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Experimentelle Modelle für Osteoarthritis

 
, Medizinischer Redakteur
Zuletzt überprüft: 07.07.2025
 
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Knorpel ist ein hochspezialisiertes Gewebe, das nur einen Zelltyp (Chondrozyten) enthält und durch das Fehlen von Blut- und Lymphgefäßen gekennzeichnet ist. Knorpel wird hauptsächlich durch Absorption aus der Synovialflüssigkeit ernährt. Der Chondrozytenstoffwechsel wird durch eine Reihe löslicher Faktoren reguliert, die lokal von Chondrozyten und dem umgebenden Gewebe produziert werden. Die Chondrozytenfunktion hängt zudem von der Zusammensetzung des extrazellulären Milieus (Sauerstoffspannung, Ionenkonzentration, pH-Wert etc.), der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, der Interaktion von Zellen und Matrix sowie physikalischen Signalen ab. Das Hauptziel der experimentellen Modellierung ist die Schaffung von Kulturen im extrazellulären Milieu, ohne den Phänotyp reifer Zellen zu verändern. Ein zweites Ziel ist die Schaffung von Kulturen zur Untersuchung der vorzeitigen, verzögerten, kurzfristigen oder anhaltenden Reaktion von Chondrozyten auf chemische und/oder physikalische Signale. In-vitro-Studien bieten zudem die Möglichkeit, das Verhalten von Chondrozyten bei Osteoarthrose zu untersuchen. Ein drittes Ziel ist die Entwicklung von Kokultursystemen, die die Untersuchung der Interaktionen verschiedener Gewebe im Gelenk ermöglichen. Die vierte Aufgabe ist die Vorbereitung von Knorpelimplantaten für die anschließende Transplantation. Und schließlich ist die fünfte Aufgabe die Untersuchung von Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Therapeutika, die die Reparatur stimulieren und/oder die Knorpelresorption hemmen können.

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Modelle von Gelenkknorpelzellkulturen entwickelt, darunter Monolayerkulturen, suspendierte Kulturen, Chondronkulturen, Explantate, Kokulturen und immortalen Zellkulturen. Jede Kultur hat ihre eigenen Vor- und Nachteile und eignet sich jeweils für die Untersuchung eines bestimmten Aspekts des Chondrozytenstoffwechsels. So sind Knorpelexplantate ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Umsatzes von Matrixelementen, wofür echte Zelloberflächenrezeptoren sowie normale Zell-Matrix- und Matrix-Zell-Interaktionen erforderlich sind. Gleichzeitig empfiehlt es sich, Matrixablagerungen oder Mechanismen, die den Chondrozytenstoffwechsel regulieren, an einer Kultur isolierter Zellen zu untersuchen. Zur Untersuchung des Prozesses der Zelldifferenzierung ist eine Monolayerkultur mit niedriger Dichte erforderlich. In einer natürlichen oder synthetischen Matrix suspendierte Kulturen sind ein Modell für die Analyse der adaptiven Reaktion von Chondrozyten auf mechanische Beanspruchung.

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Chondrozytenkulturen

Bei der Auswahl von Knorpelgewebe für In-vitro-Studien sollten mehrere wichtige Punkte beachtet werden. Die Matrixzusammensetzung und die metabolische Aktivität der Chondrozyten variieren zwischen Gelenken, und Letztere hängt auch von der Tiefe ab, in der sich die Chondrozyten im Gewebe befinden. Diese Daten wurden in mehreren Experimenten gewonnen, in denen isolierte Chondrozyten-Subpopulationen aus Knorpelzonen unterschiedlicher Tiefe untersucht wurden. Es wurden verschiedene morphologische und biochemische Unterschiede zwischen kultivierten Chondrozyten in den oberflächlichen und tiefen Schichten des Gelenkknorpels festgestellt. Oberflächliche Zellen synthetisieren eine spärliche, proteoglykanarme fibrilläre Matrix, während tiefere Zellen eine Matrix produzieren, die reich an Fibrillen und Proteoglykanen ist. Außerdem produzieren oberflächliche Zellen relativ mehr kleine, nicht aggregierte Proteoglykane und Hyaluronsäure und relativ weniger Aggrecan und Keratansulfat als tiefere Chondrozyten. Ein weiteres wichtiges Unterscheidungsmerkmal des Stoffwechsels von Chondrozyten, die aus Knorpelzonen unterschiedlicher Tiefe isoliert wurden, ist die Reaktion auf einen exogenen Reiz. Laut M. Aydelotte et al. reagierten Rinderchondrozyten aus der oberflächlichen Knorpelzone empfindlicher auf IL-1 als Zellen aus der tiefen Zone.

Das Zellverhalten hängt auch vom Gewebestandort ab. Chondrozyten aus Rippen- und Ohrknorpel desselben Tiers reagieren unterschiedlich auf Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und TGF-beta. FGF erhöhte den Einbau von Thymidin, Prolin und Leucin in kultivierte Rippen-, jedoch nicht in Ohrchondrozyten. TGF-beta erhöhte den Einbau von Thymidin in Rippen- und Ohrknorpelchondrozyten, hatte jedoch keinen Effekt auf den Einbau von Thymidin und Prolin in Ohrchondrozyten. Knorpelzellen aus Bereichen mit hoher Belastung unterscheiden sich von denen aus Bereichen mit geringer Knorpelbelastung. So synthetisieren Chondrozyten des Kniegelenkknorpels reifer Schafe aus dem zentralen Bereich der Gelenkfläche der Tibia, der nicht vom Meniskus bedeckt ist und in vivo die größte Belastung trägt, weniger Aggrecan, aber mehr Decorin als Zellen aus den vom Meniskus bedeckten Zonen. Die Autoren betonen außerdem, wie wichtig es ist, Knorpel aus identischen Gelenkzonen zu verwenden, wenn man die synthetische Funktion von Gelenken untersucht.

Der Stoffwechsel der Chondrozyten und ihre Reaktion auf regulatorische Faktoren hängen auch maßgeblich vom Alter des Spenders, ihrer Skelettentwicklung und dem Zustand der Gelenke ab, aus denen die Zellen entnommen werden. Bei menschlichen Chondrozyten lässt sich mit zunehmendem Alter eine signifikante Abnahme der proliferativen Reaktion beobachten. Die stärkste Abnahme ist bei Spendern im Alter zwischen 40 und 50 Jahren und über 60 Jahren zu beobachten. Zudem nimmt die Schwere der proliferativen Reaktion auf Wachstumsfaktoren (z. B. FGF und TGF-beta) mit zunehmendem Alter ab. Neben quantitativen Veränderungen der Chondrozytenproliferation gibt es auch qualitative Veränderungen. Zellen junger Spender (10–20 Jahre) reagieren besser auf den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF) als auf TGF-beta, während bei Zellen erwachsener Spender das Gegenteil zu beobachten ist. Zur Erklärung der altersabhängigen Veränderungen der Synthesefunktion der Chondrozyten und ihrer Reaktion auf Wachstumsfaktoren werden verschiedene Mechanismen herangezogen. Hierzu zählen eine Verringerung der Anzahl und Affinität von Zelloberflächenrezeptoren, Veränderungen bei der Synthese und Bioaktivität von Wachstumsfaktoren und Zytokinen sowie eine Modifikation von Postrezeptorsignalen.

Der pathologische Zustand der Gelenke verändert auch die Morphologie und Stoffwechselaktivität der Chondrozyten. So identifizierten J. Kouri et al. (1996) drei Subpopulationen von Chondrozyten im Knorpel bei Osteoarthrose. Chondrozyten aus dem oberflächlichen und oberen Teil der Mitte des Knorpels bilden Cluster und synthetisieren eine größere Menge an Proteoglykanen und Kollagen. TGF-beta und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) können die Synthese von Proteoglykanen durch Chondrozyten stimulieren und die Wirkung von IL-1 und TNF-a teilweise neutralisieren. Explantate von von Osteoarthrose betroffenem Knorpel und aus dem Knorpel eines Patienten mit Osteoarthrose isolierte Chondrozyten reagieren empfindlicher auf die Stimulation von TGF-beta als Chondrozyten aus gesundem Knorpel. Diese Unterschiede hängen sehr wahrscheinlich mit phänotypischen Veränderungen der Chondrozyten in den oberen Schichten des Gelenkknorpels zusammen.

Die Isolierung einzelner Chondrozyten wird durch sequenzielle Behandlung der extrazellulären Matrix mit proteolytischen Enzymen erreicht. Nach ihrer Freisetzung aus der extrazellulären Matrix eignen sich die isolierten Zellen ideal zum Studium der De-novo-Synthese von Matrixkomponenten. Einige Autoren verwenden nur Clostridienkollagenase, während andere den Knorpel mit Trypsin, Pronase, DNase und/oder Hyaluronidase vorinkubieren. Die Zahl der isolierten Zellen hängt von den verwendeten Enzymen ab. So können bei Behandlung mit Kollagenase allein 1,4–10 6 Chondrozyten aus 1 g Gewebe gewonnen werden, bei Verwendung von Pronase, Hyaluronidase und Kollagenase hingegen 4,3–10 6. Bei Behandlung mit Kollagenase verbleiben Aggrecan, Proteine, IL-6 und IL-8 in deutlich größeren Mengen in der Zellkultur als bei sequenzieller Behandlung mit verschiedenen Enzymen. Für diese Unterschiede zwischen den beiden Zellkulturen gibt es mehrere Erklärungen:

  • Zellrezeptoren werden durch Enzyme geschädigt oder gehemmt. TGF-beta hemmt die DNA- und Proteoglykansynthese in frisch isolierten Chondrozyten (Tag 1), während die DNA- und Proteoglykansynthese in in Monolayern kultivierten Chondrozyten (7 Tage) durch TGF-beta stimuliert wird. Für die Reexpression dieser Membrankomponenten ist jedoch vor Versuchsbeginn eine ausreichende Zeitspanne erforderlich.
  • Exogene Proteasen können die Integrin-vermittelte Zell-Matrix-Interaktion stören. Die Integrinfamilie fördert die Anheftung von Chondrozyten an ECM-Moleküle (Shakibaei M. et al., 1997). Diese Störung kann die Expression von Matrixgenen beeinträchtigen.
  • Reste von Matrixbestandteilen können die Synthesefunktion von Chondrozyten regulieren. Integrine können die Abbauprodukte der extrazellulären Matrix erkennen und spielen daher eine wichtige Rolle bei der Gewebereparatur nach der Einwirkung proteolytischer Enzyme. T. Larsson et al. (1989) berichteten, dass die Zugabe intakter oder fragmentierter Proteoglykane zu Zellkulturen die Protein- und Proteoglykansynthese stimuliert. Allerdings führt ein hoher Hyaluronsäurespiegel zu einer deutlich verringerten Einbeziehung von Sulfaten in die Proteoglykansynthese der Chondrozyten von Hühnerembryos, reifen Schweinechondrozyten und Ratten-Chondrosarkomzellen. Außerdem hemmt Hyaluronsäure die Proteoglykanfreisetzung aus Zellen, selbst in Gegenwart von IL-1b, TNF-a und FGF, was auf eine Hemmung der ersten biologischen Aktivität von Wachstumsfaktoren und Zytokinen hindeutet. Der genaue Wirkungsmechanismus von Hyaluronsäure ist unklar. Chondrozyten besitzen bekanntermaßen einen Rezeptor für Hyaluronsäure, der mit Aktinfilamenten des Zytosols assoziiert ist. Die Bindung von Hyaluronsäure an ihren Rezeptor stimuliert die Proteinphosphorylierung. Diese Daten belegen somit eine Modulation der Stoffwechselfunktion von Chondrozyten durch fragmentierte oder native Moleküle von Matrixproteinen durch Aktivierung von Zellmembranrezeptoren.
  • Eine schnelle Stimulation der Matrixproteinsynthese durch Chondrozyten durch Enzyme kann eine Folge von Veränderungen der Chondrozytenform und/oder einer Reorganisation des Zytoskeletts sein.
  • Einige Zytokine (z. B. IL-8) und Wachstumsfaktoren (z. B. IGF-1, TGF-β) werden in der extrazellulären Matrix (EZM) sequestriert. Das bekannteste Beispiel ist die Bindung von TGF-β durch Decorin, die zu einer verminderten Fähigkeit des TGF-β führt, Zellwachstum in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters zu induzieren. Der Befund, dass der Decoringehalt im Knorpel mit dem Alter zunimmt, deutet auf eine abnehmende Bioverfügbarkeit von TGF-β mit zunehmendem Alter hin. Wachstumsfaktoren und Zytokine können während der Kultur aus Matrixtrümmern freigesetzt werden und anschließend die Chondrozytenfunktion modulieren.

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Monolayer-Kultur von Chondrozyten

Der differenzierte Phänotyp von Chondrozyten ist vor allem durch die Synthese von Kollagen Typ II und gewebespezifischen Proteoglykanen sowie eine geringe mitotische Aktivität gekennzeichnet. Es gibt Hinweise darauf, dass Chondrozyten bei längerer Zellkultivierung in einer Monoschicht sowie nach mehreren wiederholten Zellpassagen ihre kugelförmige Gestalt verlieren und eine längliche, fibroblastenartige Gestalt annehmen. Bei einer solchen fibroblastischen Metaplasie ist auch die Synthesefunktion der Zellen verändert, die durch eine fortschreitende Abnahme der Synthese der Kollagene Typ II, IX und XI und eine Zunahme der Synthese der Kollagene Typ I, III und Y gekennzeichnet ist. Kleine, nicht aggregierte Proteoglykane werden aufgrund von funktionellem Aggrecan synthetisiert. Die Synthese von Cathepsin B und L ist in differenzierten Zellen extrem niedrig, nimmt jedoch im Verlauf des Differenzierungsverlusts zu. Kollagenase-1 wird in differenzierten Chondrozyten exprimiert; Bei längerer Kultivierung nimmt seine Expression ab, während die Produktion von Gewebeinhibitoren von Metalloproteasen (TIMPs) zunimmt.

Differenzierte Chondrozyten reexprimieren Kollagen des differenzierten Phänotyps, wenn sie von einer Monoschicht in eine suspendierte Kultur überführt werden. Der Differenzierungsprozess hängt vermutlich mit der Zellform zusammen. Diese Eigenschaft wird regelmäßig von Forschern genutzt, die defekte Transplantate mit autologen Chondrozyten untersuchen. Eine kleine Anzahl von Zellen aus Biopsiematerial kann in einer Monoschichtkultur vermehrt und vor der Transplantation wieder in eine dreidimensionale Matrix eingebracht werden. Die Reexpression eines spezifischen Phänotyps durch dedifferenzierte Chondrozyten, die in eine Agarosekultur überführt werden, kann durch TGF-β, Ossein-Hydroxylapatit-Komplex und Ascorbinsäure stimuliert werden.

Als Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Zytokine werden Chondrozyten während des Differenzierungsprozesses modifiziert. Die zelluläre Reaktion auf Zytokine und Wachstumsfaktoren unterscheidet sich bei undifferenzierten und differenzierten Chondrozyten. IL-1 stimuliert die Fibroblastenproliferation, während das Wachstum undifferenzierter Chondrozyten durch IL-1 gehemmt wird. Die DNA-Synthese wird durch IGF-1 in verlängerten, aber nicht abgeflachten Chondrozyten stimuliert. In differenzierten Chondrozyten sind die stimulierenden Effekte von IL-1beta und TNF-a auf die Prokollagenaseproduktion stärker ausgeprägt als in undifferenzierten Chondrozyten.

Chondrozyten-Kultivierung

Die Kultivierung von Chondrozyten in Suspension in einem flüssigen Medium oder in einer natürlichen oder synthetischen dreidimensionalen Matrix stabilisiert den Chondrozyten-Phänotyp. Die Zellen behalten ihre Kugelform und synthetisieren gewebespezifische Proteine. Die suspendierte Chondrozytenkultur wird üblicherweise zur Untersuchung der Bildung einer neuen perizellulären Matrix empfohlen. Chondrozytenkulturen in synthetischen oder natürlichen absorbierenden Polymeren werden zur Implantation von Zellen in Knorpeldefekte verwendet, um die Regeneration von Gelenkknorpelgewebe zu stimulieren. Das synthetische oder natürliche Medium für implantierte Zellen muss eine Reihe von Anforderungen erfüllen:

  • Implantate müssen eine poröse Struktur für Zelladhäsion und -wachstum aufweisen,
  • weder das Polymer selbst noch seine Abbauprodukte sollten bei der Implantation in vivo Entzündungen oder toxische Reaktionen hervorrufen,
  • Der Transplantatträger muss die Fähigkeit besitzen, sich mit dem angrenzenden Knorpel oder subchondralen Knochen zu verbinden.
  • Die natürliche oder synthetische Matrix muss resorbierbar sein, ihr Abbau muss durch Geweberegeneration ausgeglichen werden,
  • Um die Knorpelreparatur zu erleichtern, müssen die chemische Struktur und die Porenarchitektur der Matrix die Aufrechterhaltung des zellulären Phänotyps und die Synthese gewebespezifischer Proteine durch die darin platzierten Chondrozyten erleichtern.
  • Während der In-vivo-Implantation ist es notwendig, die mechanischen Eigenschaften der synthetischen oder natürlichen Matrix zu untersuchen.

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Suspension von Chondrozyten in flüssiger Phase

Die Anhaftung von Zellen an Kunststoffgefäße, in denen Chondrozyten kultiviert werden, kann verhindert werden, indem deren Wände mit einer Lösung aus Methylcellulose, Agarose, Hydrogel (Poly-2-hydroxyethylmethacrylat) oder einem Kollagen-Agarose-Gemisch beschichtet werden. Unter diesen Bedingungen bilden Chondrozyten Cluster und synthetisieren hauptsächlich Aggrecan und gewebespezifische Kollagene (Typ II, IX, XI). Normalerweise findet man zwei Zelltypen. Die zentralen Zellen behalten ihre Kugelform und sind von einer gut entwickelten extrazellulären Matrix umgeben, was durch histochemische und ultrastrukturelle Untersuchungen bestätigt wird. In der Peripherie haben Chondrozyten einen scheibenförmigen Umriss und sind von einer spärlichen extrazellulären Matrix umgeben; über die funktionellen Eigenschaften solcher Zellen ist wenig bekannt.

Es ist möglich, Chondrozyten auf suspendierten Mikroträgern zu kultivieren. Als Mikroträger werden Dextran-Kügelchen (Cytodex), kollagenbeschichtete Dextran-Kügelchen (Cytodex III) und nichtporöse Mikrokügelchen aus Kollagen Typ I (Cellagen) verwendet. Unter diesen Kultivierungsbedingungen haften Chondrozyten an der Oberfläche des Mikroträgers, behalten ihre Kugelform und bilden ein matrixartiges Material. Darüber hinaus fördert die Verwendung von Cellagen die Chondrozytenproliferation und die Reexpression des normalen Phänotyps. Daher kann die Kultivierung von Chondrozyten auf Cellagen-Mikrokügelchen dazu genutzt werden, den Zellphänotyp vor der Transplantation wiederherzustellen.

Eine weitere Methode zur Kultivierung von Chondrozytensuspensionen in einem flüssigen Medium ist ihre Kultivierung in Form dichter Kugeln aus Zellen (0,5-1 * 10 b ), die durch Zentrifugation gewonnen werden. Solche Chondrozyten sind in der Lage, eine Matrix zu produzieren, die eine große Menge an Proteoglykanen, Kollagen Typ II, jedoch nicht Kollagen Typ I enthält, was durch histologische, immunhistochemische und quantitative Methoden bestätigt wird.

Suspension von Chondrozyten in natürlicher ECM

Chondrozyten können in Suspension in einer dreidimensionalen Matrix (Weichagar, Agarose, Kollagengel oder -schwamm, Hyaluronsäure, Fibrinkleber, Alginatkügelchen) kultiviert werden.

In Agarose kultivierte Chondrozyten behalten ihren normalen Phänotyp und synthetisieren Kollagen Typ II und gewebespezifische Aggrecan-Aggregate. Bei der Kultivierung in Agarose werden von der Zelle synthetisierte Proteoglykane 50 Tage lang in das Medium freigesetzt. Zum Vergleich: In einer Monolayer-Kultur ist die Zellphase bereits in den ersten 5-6 Tagen der Kultivierung mit Glykosaminoglykanen überfüllt; bei der Kultivierung im Medium kommt es nach erhöhter Synthese und Freisetzung von Glykosaminoglykanen in den ersten 8-10 Tagen zu deren zeitabhängiger Abnahme. Dennoch unterscheidet sich das Verhalten von Chondrozyten bei Kultivierung in Agarose von dem in vivo. In Agarose enthält eine große Anzahl synthetisierter Aggrecan-Aggregate kleinere Moleküle und weniger Moleküle als in vivo. TGF-β stimuliert die Proteoglykansynthese im Explantat, reduziert jedoch die Aggrecansynthese in Agarose.

Alginat ist ein lineares Polysaccharid, das aus Braunalgen gewonnen wird. In Gegenwart zweiwertiger Kationen, wie beispielsweise Ca 2+ -Ionen, wird dieses Polymer zu einem Gel. Jeder in Alginat eingeschlossene Chondrozyten ist von einer Matrix aus negativ geladenen Polysacchariden umgeben, deren Poren denen in hyalinem Knorpel vergleichbar sind. Die von Chondrozyten in Alginatkügelchen gebildete Matrix besteht aus zwei Kompartimenten: einer dünnen Schicht zellassoziierter Matrix, die der perizellulären und territorialen Matrix des Gelenkknorpels entspricht, und einer weiter entfernten Matrix, die der interterritorialen Matrix in nativem Gewebe entspricht. Am 30. Tag der Kultur sind das relative und absolute Volumen der Zellen und jedes der beiden Kompartimente in einem Alginatkügelchen nahezu identisch mit denen in nativem Knorpel. Knorpelzellen behalten fast 30 Tage lang ihre Kugelform und produzieren Aggrecan, dessen hydrodynamische Eigenschaften denen der Aggrecan-Moleküle in der Gelenkknorpelmatrix ähneln, sowie Kollagenmoleküle der Typen II, IX und XI. Gleichzeitig bilden sich, wie bei anderen Suspensionskulturen, abgeflachte Zellen auf der Oberfläche der Alginatkügelchen, die eine geringe Menge an Kollagenmolekülen des Typs I produzieren, die direkt ins Medium abgegeben und nicht in die extrazelluläre Matrix eingebaut werden. In den Alginatkügelchen ist eine moderate Proliferation von Knorpelzellen zu beobachten. Nach achtmonatiger Kultivierung im Alginatgel verlieren reife Knorpelzellen nicht an Stoffwechselaktivität und synthetisieren weiterhin gewebespezifisches Kollagen Typ II und Aggrecan.

H. Tanaka et al. (1984) untersuchten die Diffusionseigenschaften verschiedener natürlicher Moleküle in Alginat und fanden heraus, dass Moleküle über 70 kDa nicht durch Alginat diffundierten. Daher eignet sich die Zellkultur in Alginat zur Untersuchung der Regulation der Matrixbiosynthese und der ECM-Organisation. Die Verfügbarkeit von in Alginat kultivierten Zellen ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von peptidregulatorischen Faktoren und pharmakologischen Wirkstoffen auf transkriptioneller, posttranskriptioneller und translationaler Ebene.

Chondrozyten werden auch in einer Matrix aus Kollagenfasern des Typs I und II kultiviert. S. Nehrer et al. (1997) verglichen die Funktion von Hunde-Chondrozyten in porösen Kollagen-Proteoglykan-Polymermatrizen, die Kollagene verschiedener Typen enthielten. Sie fanden wichtige Unterschiede in der Morphologie der Biosynthesefunktion von Chondrozyten, die in Kollagenmatrizen mit Kollagen des Typs I und II kultiviert wurden. Zellen in einer Matrix aus Kollagen Typ II behielten ihre Kugelform, während sie in Kollagen Typ I eine fibroblastenartige Morphologie aufwiesen. Darüber hinaus produzierten Chondrozyten in einer Matrix aus Kollagen Typ II größere Mengen Glykosaminoglykane. J. van Susante et al. (1995) verglichen die Eigenschaften von Chondrozyten, die in Alginat- und Kollagengel (Typ I) kultiviert wurden. Die Autoren stellten einen signifikanten Anstieg der Zellzahl im Kollagengel fest. Ab dem sechsten Kultivierungstag verloren die Zellen jedoch ihren charakteristischen Phänotyp und verwandelten sich in fibroblastenähnliche Zellen. Im Alginatgel war eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten, die Chondrozyten behielten jedoch ihren normalen Phänotyp. Im Kollagengel war die Anzahl der Proteoglykane pro Zelle signifikant höher als im Alginatgel. Ab dem sechsten Kultivierungstag war jedoch im Gel eine Abnahme der Synthese von Matrixelementen zu beobachten, während die Synthese im Alginatgel weiter zunahm.

Die feste dreidimensionale Fibrinmatrix ist eine natürliche Substanz, die darin suspendierte Chondrozyten in differenziertem Phänotyp trägt. Die dreidimensionale Fibrinmatrix kann auch als Träger bei der Chondrozytentransplantation eingesetzt werden. Die Vorteile von Fibrin liegen in seiner fehlenden Zytotoxizität, seiner Fähigkeit, Raum zu füllen, und seiner Adhäsionskraft. Histologische und biochemische Untersuchungen, Autoradiographie und Elektronenmikroskopie haben gezeigt, dass Chondrozyten in Fibringel auch nach zweiwöchiger Kultivierung ihre Morphologie beibehalten, proliferieren und Matrix produzieren. G. Homminga et al. (1993) berichteten jedoch, dass der Fibrinabbau nach drei Tagen Kultivierung beginnt und die Dedifferenzierung der Chondrozyten fortschreitet.

Suspension von Chondrozyten in künstlicher (synthetischer) ECM

Knorpelimplantate für die rekonstruktive oder orthopädische Chirurgie können durch die Züchtung isolierter Chondrozyten in vitro in einer synthetischen biokompatiblen Matrix gewonnen werden.

In Polyglykolsäure kultivierte Chondrozyten vermehren sich und behalten acht Wochen lang ihre normale Morphologie und ihren Phänotyp. Der Chondrozyten-Polyglykolsäure-Komplex besteht aus Zellen, Glykosaminoglykanen und Kollagenen und besitzt eine äußere Kollagenkapsel. Solche Implantate enthalten jedoch zwei Typen von Kollagenmolekülen – I und II. Implantate aus durch eine Reihe von Passagen dedifferenzierten Chondrozyten weisen einen höheren Anteil an Glykosaminoglykanen und Kollagenen auf als Implantate aus primär undifferenzierten Chondrozyten.

L. Freed et al. (1993b) verglichen das Verhalten von menschlichen und bovinen Chondrozytenkulturen in faseriger Polyglykolsäure (FPGA) und poröser Polymilchsäure (PPLA). Nach 6- bis 8-wöchiger Kultivierung boviner Chondrozyten in FPGA oder PPLA beobachteten die Autoren eine Zellproliferation und Regeneration der Knorpelmatrix. In FPGA hatten die Chondrozyten eine kugelförmige Gestalt und befanden sich in Lakunen, die von einer Knorpelmatrix umgeben waren. Nach 8 Wochen In-vitro-Kultivierung enthielt das regenerierte Gewebe bis zu 50 % Trockenmasse (4 % Zellmasse, 15 % Glykosaminoglykane und 31 % Kollagene). In PPLA hatten die Zellen eine spindelförmige Gestalt und eine geringe Menge an Glykosaminoglykanen und Kollagen. In FPGA war das Zellwachstum doppelt so intensiv wie in PPLA. In vivo produzierten in VPGK und PPLC gezüchtete Chondrozyten innerhalb von 1–6 Monaten histologisch knorpelähnliches Gewebe. Die Implantate enthielten Glykosaminoglykane sowie Kollagene Typ I und II.

Bovine fetale Chondrozyten wurden in porösem, hochdichtem hydrophobem und hydrophilem Polyethylen kultiviert. Nach 7 Tagen Inkubation in beiden Substraten behielten die Zellen ihre kugelförmige Gestalt und enthielten hauptsächlich Kollagen Typ II. Nach 21 Tagen Kultivierung zeigte sich, dass die hydrophile Matrix mehr Kollagen Typ II enthielt als die hydrophobe Matrix.

Knorpelgewebe kann auch durch Kultivierung in einer Monoschicht auf Millicell-CM-Filtern gewonnen werden. Für die Anlagerung von Chondroitinen ist eine Vorbeschichtung der Filter mit Kollagen notwendig. Die histologische Untersuchung der Kultur zeigt die Ansammlung von Chondrozyten in der extrazellulären Matrix (ECM), die Proteoglykane und Kollagen Typ II enthält. Kollagen Typ I wurde in dieser Kultur nicht nachgewiesen. Die Chondrozyten im gewonnenen Knorpelgewebe haben eine kugelförmige Gestalt, sind an der Oberfläche des Gewebes jedoch etwas abgeflacht. Die Dicke des neu gebildeten Gewebes nahm mit der Zeit zu und hing von der anfänglichen Dichte der Zellmonoschicht ab. Unter optimalen Kultivierungsbedingungen erreichte die Dicke des Knorpelgewebes 110 μm; die Organisation seiner Zellen und seines Kollagens in oberflächliche und tiefe Schichten ähnelt der von Gelenkknorpel. Die ECM enthält etwa dreimal mehr Kollagen und Proteoglykane. Nach zweiwöchiger Kultivierung war eine Matrixansammlung zu beobachten, sodass das Gewebe vom Filter entnommen und für Transplantationen verwendet werden konnte.

Sims et al. (1996) untersuchten die Kultivierung von Chondrozyten in Polyethylenoxid-Gel, einer gekapselten Polymermatrix, die den Transfer großer Zellzahlen durch Injektion ermöglicht. Sechs Wochen nach der Injektion in das subkutane Gewebe athymischer Mäuse bildete sich neuer Knorpel, der morphologisch durch eine weiße Opaleszenz ähnlich hyalinem Knorpel charakterisiert war. Histologische und biochemische Daten wiesen auf das Vorhandensein aktiv proliferierender Chondrozyten hin, die ECM produzieren.

Erklärung

Die Explantation von Knorpelgewebe dient der Untersuchung von Ana- und Katabolismusprozessen, der Aufrechterhaltung der Homöostase, Resorption und Reparatur. Chondrozyten in Knorpelexplantaten behalten einen normalen Phänotyp und eine normale ECM-Zusammensetzung bei, die denen im Gelenkknorpel in vivo ähnelt. Nach 5-tägiger Kultivierung in Gegenwart von Serum wird ein konstantes Niveau der Synthese und natürlicher Abbauprozesse erreicht. Die Geweberesorption kann in der Hauptkultur und in Kultur durch Zugabe von Serum mithilfe einer Reihe von Agentien beschleunigt werden, beispielsweise IL-IB, TNF-α, bakteriellen Lipopolysacchariden, Retinsäurederivaten oder aktiven Sauerstoffradikalen. Um die Knorpelreparatur zu untersuchen, wird seine Schädigung durch lösliche Entzündungsmediatoren (H2O2, IL 1, TNF-α) oder eine physikalische Ruptur der Matrix induziert.

Die organotypische Kulturmethode ist ein Modell für In-vitro-Studien der Auswirkungen isolierter externer Faktoren auf Chondrozyten und die umgebende Matrix. In vivo sind Chondrozyten spärlich in der extrazellulären Matrix lokalisiert und haben keinen Kontakt zueinander. Die Kultur von Gelenkknorpelexplantaten bewahrt diese strukturelle Organisation sowie die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Chondrozyten und der umgebenden extrazellulären Umgebung. Dieses Modell wird auch verwendet, um die Auswirkungen von mechanischem Stress, pharmakologischen Wirkstoffen, Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Hormonen auf den Knorpelstoffwechsel zu untersuchen.

Ein weiterer Vorteil der Knorpelgewebeexplantation ist das Fehlen einer Schädigung der Chondrozyten durch proteolytische Enzyme oder mechanische Faktoren, die bei der Zellisolierung unvermeidlich ist. Rezeptoren und andere Membranproteine und Glykoproteine werden vor schädigenden Faktoren geschützt.

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Chondron-Kultur

Chondron ist eine strukturelle, funktionelle und metabolische Einheit des Gelenkknorpels, bestehend aus einem Chondrozyten, seiner perizellulären Matrix und der kompakten filamentösen Kapsel. Chondronen sind für die Matrixhomöostase verantwortlich. Sie werden mechanisch aus dem Knorpel extrahiert und durch mehrere aufeinanderfolgende Homogenisierungen bei niedriger Geschwindigkeit gewonnen. Chondronen, die aus Zonen unterschiedlicher Knorpeltiefe isoliert wurden, lassen sich in vier Kategorien einteilen: einzelne Chondronen, gepaarte Chondronen, mehrere (drei oder mehr) linear angeordnete Chondronen (Chondronensäulen) und Chondronencluster.

Einzelne Chondronen kommen normalerweise in den mittleren Schichten von intaktem Knorpel vor, gepaarte Chondronen finden sich an der Grenze zwischen den mittleren und tiefen Schichten und linear angeordnete multiple Chondronen sind typisch für die tiefen Schichten von intaktem Knorpel. Schließlich bestehen Chondronencluster aus zufällig angeordneten Gruppen einzelner und gepaarter Chondronen, die nach der Homogenisierung ihren aggregierten Zustand beibehalten. Chondronencluster sind große Knorpelfragmente, die normalerweise mehrere Chondronen und radial angeordnete Kollagenfibrillen enthalten, d. h. eine typische Organisation, die für die tiefen Schichten der Matrix charakteristisch ist. Chondronen sind in transparenter Agarose immobilisiert, was Untersuchungen ihrer Struktur, molekularen Zusammensetzung und Stoffwechselaktivität ermöglicht. Das Chondron-Agarose-System gilt als Mikromodell des Knorpels, das sich vom traditionellen Chondrozyten-Agarose-System dadurch unterscheidet, dass die natürliche Mikroumgebung erhalten bleibt und keine Notwendigkeit besteht, es zu synthetisieren und zusammenzusetzen. Die Chondronkultur ist ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Zellen und Matrix im Gelenkknorpel unter normalen und pathologischen Bedingungen.

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Kultur unsterblicher Chondrozyten

Rekombinante DNA oder onkogenhaltige Viren, die eine Zelle „unsterblich“ machen können, werden zur Erzeugung permanenter Zelllinien verwendet. Unsterbliche Chondrozyten haben die Fähigkeit, sich endlos zu vermehren und gleichzeitig einen stabilen Phänotyp aufrechtzuerhalten. F. Mallein-Gerin et al. (1995) zeigten, dass das SV40T-Onkogen die Proliferation von Mauschondrozyten induziert, die weiterhin stabil Kollagen Typ II, IX und XI sowie artikuläres Aggrecan und Bindungsprotein exprimieren. Eine solche Zelllinie erlangt jedoch die Fähigkeit, Kollagen Typ I zu synthetisieren, wenn sie in einer Monolayer-Kultur oder im Agarosegel kultiviert wird.

W. Horton et al. (1988) beschrieben eine Linie unsterblicher Zellen mit geringer Expression von Typ-II-Kollagen-mRNA. Diese Zellen wurden durch Transformation mit einem Maus-Retrovirus gewonnen, das I-myc- und y-ra-Onkogene enthielt. Dieser Zelltyp stellt ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der Interaktionen der Gelenkmatrix in Abwesenheit von Typ-II-Kollagen sowie der Regulation der Typ-II-Kollagensynthese dar.

Die Kultur von Chondropriten mit mutierten oder gelöschten Genen ist ein praktisches Modell zur Untersuchung ihrer physiologischen Funktion. Dieses Modell eignet sich besonders zur Untersuchung der Rolle spezifischer Moleküle beim Aufbau der Knorpelmatrix oder zur Untersuchung der Wirkung verschiedener regulatorischer Faktoren auf den Knorpelstoffwechsel. Chondrozyten mit einem gelöschten Gen für Kollagen Typ IX synthetisieren Kollagenfibrillen, die breiter als normal sind, was darauf hindeutet, dass Kollagen Typ IX den Durchmesser der Fibrillen reguliert. Wie in Kapitel 1 erwähnt, wurde kürzlich in Familien mit primär generalisierter Osteoarthritis eine Mutation im COLAI-Gen entdeckt, das für Kollagen Typ II kodiert. Um die Wirkung von mutiertem Kollagen Typ II auf die Gelenkmatrix zu untersuchen, transfizierten R. Dharmrvaram et al. (1997) defektes COL 2 AI (Arginin an Position 519 ist durch Cystein ersetzt) in vitro in menschliche fötale Chondrozyten.

Kokultursystem. Im Gelenk interagiert Knorpel mit anderen Zelltypen, die in der Synovialmembran, der Synovialflüssigkeit, den Bändern und dem subchondralen Knochen vorkommen. Der Stoffwechsel der Chondrozyten kann durch verschiedene lösliche Faktoren beeinflusst werden, die von den genannten Zellen synthetisiert werden. So wird bei Arthritis der Gelenkknorpel durch proteolytische Enzyme und freie Radikale, die von Synovialzellen produziert werden, zerstört. Daher wurden Modelle entwickelt, um komplexe Wechselwirkungen zwischen Knorpel und umgebendem Gewebe zu untersuchen, die als Kokulturen bezeichnet werden.

S. Lacombe-Gleise et al. (1995) kultivierten Kaninchenchondrozyten und Osteoblasten in einem Kokultursystem (COSTAR). Die Zellen waren durch eine mikroporöse Membran (0,4 μm) getrennt, was einen Austausch zwischen den beiden Zelltypen ohne direkten Kontakt ermöglichte. Diese Studie zeigte die Fähigkeit von Osteoblasten, das Chondrozytenwachstum über lösliche Mediatoren zu stimulieren.

AM Malfait und Co-Autoren (1994) untersuchten die Beziehung zwischen Monozyten und Chondrozyten im peripheren Blut. Dieses Modell eignet sich zur Untersuchung zytokinvermittelter Prozesse bei entzündlichen Arthropathien (rheumatoide Arthritis, seronegative Spondyloarthritis usw.). Die Autoren des Modells trennten die Zellen durch eine proteinbindende Membran mit Poren von 0,4 μm Durchmesser. Die Studie zeigte, dass mit Lipopolysacchariden stimulierte Monozyten IL-1 und TNF-α produzierten, was die Aggrecansynthese durch Chondrozyten hemmte und zum Abbau bereits synthetisierter Aggrecanaggregate beitrug.

K. Tada et al. (1994) entwickelten ein Kokulturmodell, in dem Endothelzellen in einem Kollagengel (Typ I) in einer inneren Kammer platziert wurden, die von der äußeren Kammer mit darin platzierten Chondrozyten durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,4 μm getrennt war. In vollständiger Isolation von der äußeren Kammer bildeten menschliche Endothelzellen in Gegenwart von EGF oder TGF-α Röhren in einem Kollagengel. Bei gleichzeitiger Kultivierung beider Zelltypen wurde die TGF-α-abhängige Röhrenbildung durch Endothelzellen gehemmt. Die Hemmung dieses Prozesses durch Chondrozyten wurde durch Anti-TGF-β-Antikörper teilweise aufgehoben. Es ist anzunehmen, dass von Chondrozyten produziertes TGF-β die Vaskularisierung des Knorpels selbst hemmt.

S. Groot et al. (1994) kultivierten Chondrozyten aus den hypertrophen und proliferativen Zonen des Knochens eines 16 Tage alten Mäusefötus gleichzeitig mit Stücken von Hirngewebe. Nach vier Tagen Kultivierung konnten die Transdifferenzierung der Chondrozyten in Osteoblasten und der Beginn der Osteoidbildung beobachtet werden. Nach elf Tagen Kultivierung war ein Teil des Knorpels durch Knochengewebe ersetzt und die Knochenmatrix teilweise verkalkt. Einige vom Hirngewebe produzierte Neuropeptide und Neurotransmitter beeinflussen den Stoffwechsel der Osteoblasten bzw. besitzen Rezeptoren dafür. Dazu gehören Noradrenalin, Vasoaktives Intestinales Peptid, Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid, Substanz P und Somatostatin. Zusammen mit Chondrozyten kultivierte Stücke von Hirngewebe können einige der aufgeführten Faktoren produzieren, die den Prozess der Transdifferenzierung von Chondrozyten in Osteoblasten auslösen können.

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Der Einfluss externer Faktoren auf die Chondrozytenkultur

Der Einfluss der Sauerstoffspannung auf den Chondrozytenstoffwechsel

In den meisten Fällen entwickeln sich Chondrozytenkulturen unter Bedingungen mit atmosphärischem Sauerstoffpartialdruck. Es ist jedoch bekannt, dass Chondrozyten in vivo unter hypoxischen Bedingungen existieren und der Sauerstoffpartialdruck unter verschiedenen pathologischen Bedingungen schwankt. Während des Reifungsprozesses werden erhebliche Änderungen in der Blutversorgung der Epiphysen beobachtet. Da die Vaskularisierung in verschiedenen Zonen der Wachstumsfuge unterschiedlich ist, schwankt auch der Sauerstoffpartialdruck in ihnen. C. Brighton und R. Heppenstall (1971) zeigten, dass in der Tibiaplatte von Kaninchen der Sauerstoffpartialdruck in der hypertrophen Zone niedriger ist als im umgebenden Knorpel. Messungen einiger Stoffwechselparameter zeigten, dass Chondrozyten schnell auf lokale Änderungen der Sauerstoffkonzentration reagieren können. Zunächst einmal sinkt bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck sein Verbrauch durch die Chondrozyten. Mit einer Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks von 21 auf 0,04 % steigt die Glukoseverwertung, die Aktivität glykolytischer Enzyme und die Milchsäuresynthese nehmen zu. Selbst bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck bleibt die absolute Menge an ATP, ADP und AMP stabil. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Stoffwechsel der Chondrozyten auf maximale Energieeinsparung ausgerichtet ist. Die Syntheseaktivität und damit auch die Reparaturprozesse verändern sich jedoch unter hypoxischen Bedingungen.

Ein hoher Sauerstoffpartialdruck beeinflusst auch den Chondrozytenstoffwechsel und führt zu einer Verringerung der Proteoglykan- und DNA-Synthese sowie zum Abbau der Knorpelmatrix. Diese Effekte gehen in der Regel mit der Produktion freier Sauerstoffradikale einher.

Der Einfluss der Ionenkonzentration und des osmotischen Drucks der Umgebung auf die Chondrozytenfunktion

In nativem Knorpel unterscheidet sich die Ionenkonzentration deutlich von der in anderen Geweben: Der Natriumgehalt im extrazellulären Medium beträgt 250–350 mmol, die Osmolarität 350–450 mosmol. Werden Chondrozyten aus der extrazellulären Matrix isoliert und in Standardmedien (DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium), Osmolarität 250–280,7 mosmol) inkubiert, verändert sich die Umgebung der Zellen dramatisch. Zudem ist die Calcium- und Kaliumkonzentration in Standardmedien deutlich niedriger als in nativem Gewebe, und die Anionenkonzentration ist deutlich höher.

Die Zugabe von Saccharose zum Medium erhöht dessen Osmolarität und induziert einen vorübergehenden intrazellulären Anstieg der Konzentration von H + und Calciumanionen im Zytosol. Solche intrazellulären Veränderungen können die Prozesse der Chondrozytendifferenzierung und ihre metabolische Aktivität beeinflussen. J. Urban et al. (1993) fanden heraus, dass der Einbau von 35 8-Sulfat und 3 H-Prolin durch isolierte Chondrozyten, die 2–4 Stunden in Standard-DMEM inkubiert wurden, nur 10 % des Wertes in nativem Gewebe betrug. Die Intensität der Synthese erreichte sowohl in frisch isolierten Chondrozyten als auch in Knorpelgewebeexplantaten bei einer Osmolarität des extrazellulären Mediums von 350–400 mosmol ein Maximum. Darüber hinaus nahm das Volumen der Chondrozyten um 30–40 % zu, nachdem die isolierten Zellen in Standard-DMEM der angegebenen Osmolarität gegeben wurden. Werden Chondrozyten jedoch 12–16 Stunden lang unter Bedingungen nicht-physiologischer Osmolarität kultiviert, passen sich die Zellen an die neuen Bedingungen an und reduzieren die Intensität der Biosynthese proportional zur Veränderung der Osmolarität der extrazellulären Umgebung.

P. Borgetti et al. (1995) untersuchten die Wirkung der Osmolarität des extrazellulären Mediums auf Wachstum, Morphologie und Biosynthese von Schweinechondrozyten. Die Autoren wiesen ähnliche biochemische und morphologische Merkmale von Chondrozyten nach, die in Medien mit einer Osmolarität von 0,28 und 0,38 Mosmol kultiviert wurden. Bei einer mittleren Osmolarität von 0,48 Mosmol konnte während der ersten 4–6 Stunden der Kultivierung eine Abnahme der Zellproliferation und der Proteinsynthese beobachtet werden, doch diese Parameter erholten sich anschließend und erreichten schließlich Kontrollwerte. Als Chondrozyten in einem Medium mit einer Osmolarität von 0,58 Mosmol kultiviert wurden, verloren die Zellen die Fähigkeit, die physiologische Intensität proliferativer Prozesse aufrechtzuerhalten, und nach 6 Tagen war die Zahl der Chondrozyten signifikant reduziert. Bei einer mittleren Osmolarität von 0,58 Mosmol wurde eine starke Hemmung der Proteinsynthese beobachtet. Darüber hinaus behalten Chondrozyten bei der Kultivierung in Medien mit einer Osmolarität von 0,28–0,38 mOsm ihren physiologischen Phänotyp; bei höherer Osmolarität (0,48–0,58 mOsm) treten signifikante Veränderungen der Zellmorphologie auf, die sich im Verlust des charakteristischen Phänotyps, der Umwandlung von Chondrozyten in fibroblastenähnliche Zellen und dem Verlust der Fähigkeit der Zellen zur Bildung von Matrixproteoglykanen äußern. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf die Fähigkeit von Chondrozyten hin, auf begrenzte Schwankungen der Osmolarität der extrazellulären Umgebung zu reagieren.

Änderungen der Konzentration anderer Ionen können auch die Biosyntheseprozesse in Chondrozyten beeinflussen. So erhöht sich der Grad des 35 S (Sulfat)-Einbaus um die Hälfte, wenn die Konzentration von Kaliumionen von 5 mmol (der Konzentration im Standard-DM-EM-Medium) auf 10 mmol (der Konzentration in der ECM in vivo) erhöht wird. Calciumkonzentrationen unter 0,5 mmol förderten die Kollagenproduktion durch reife Rinderchondrozyten, während eine Konzentration von 1-2 mmol (entsprechend der Konzentration im Standard-DM-EM-Medium) eine signifikante Verringerung der Kollagensynthese verursachte. Bei hohen Calciumspiegeln (2-10 mmol) wurde eine moderate Erhöhung der Biosynthese beobachtet. Verschiedene Kationen sind an der Anheftung von Chondrozyten an ECM-Proteine beteiligt. So sorgen Magnesium- und Manganionen für die Anheftung an Fibronektin und Kollagen Typ II, während Calciumionen nicht an der Anheftung von Chondrozyten an Proteine beteiligt sind. Somit weisen die Ergebnisse der beschriebenen Untersuchungen auf den Einfluss von Veränderungen der extrazellulären Kalium-, Natrium- und Kalziumionen sowie der Osmolarität des Mediums auf die Biosynthesefunktion von Chondrozyten hin, die in Standardmedien inkubiert wurden.

Einfluss mechanischer Belastung auf den Chondrozytenstoffwechsel

Gelenkimmobilisierung führt zu reversibler Knorpelatrophie, was auf die Notwendigkeit mechanischer Reize für normale Stoffwechselprozesse in der extrazellulären Matrix hinweist. Die verwendeten Zellkulturmodelle existieren meist unter normalem atmosphärischem Druck. M. Wright et al. (1996) zeigten, dass die mechanische Umgebung den Chondrozytenstoffwechsel beeinflusst; die Zellreaktion hängt von der Intensität und Häufigkeit der Druckbelastung ab. Belastungsexperimente an Explantaten intakten Gelenkknorpels in vitro zeigten eine verminderte Protein- und Proteoglykansynthese unter statischer Belastung, während dynamische Belastung diese Prozesse stimuliert. Die genauen Mechanismen der Wirkung mechanischer Belastung auf Knorpel sind komplex und stehen wahrscheinlich mit Zelldeformation, hydrostatischem Druck, osmotischem Druck, elektrischem Potenzial und zellulären Oberflächenrezeptoren für Matrixmoleküle in Zusammenhang. Um die Wirkung jedes dieser Parameter zu untersuchen, ist es notwendig, ein System zu schaffen, in dem ein Parameter unabhängig variiert werden kann. Beispielsweise eignet sich die Explantatkultur nicht zur Untersuchung der Zelldeformation, kann aber zur Untersuchung des allgemeinen Einflusses von Druck auf die Stoffwechselaktivität von Chondrozyten verwendet werden. Die Kompression des Knorpels führt zu Zelldeformationen und geht mit der Entstehung eines hydrostatischen Druckgradienten, elektrischen Potenzials, Flüssigkeitsflusses und Veränderungen physikochemischen Parametern wie Wassergehalt in der Matrix, elektrischer Ladungsdichte und osmotischem Druck einher. Zelldeformationen können anhand isolierter Chondrozyten in Agarose- oder Kollagengel untersucht werden.

Es wurden mehrere Systeme entwickelt, um die Wirkung mechanischer Stimulation auf die Chondrozytenkultur zu untersuchen. Einige Forscher verwenden Systeme, bei denen Druck auf die Zellkultur über die Gasphase ausgeübt wird. So beobachteten JP Veldhuijzen et al. (1979) unter Anwendung eines Drucks von 13 kPa über dem atmosphärischen Druck und einer niedrigen Frequenz (0,3 Hz) über 15 Minuten eine erhöhte Synthese von cAMP und Proteoglykanen sowie eine verringerte DNA-Synthese. R. Smith et al. (1996) zeigten, dass die intermittierende Aussetzung einer Kultur primärer Rinderchondrozyten gegenüber hydrostatischem Druck (10 MPa) mit einer Frequenz von 1 Hz über 4 Stunden eine erhöhte Synthese von Aggrecan und Kollagen Typ II verursachte, während konstanter Druck diese Prozesse nicht beeinflusste. Unter Verwendung eines ähnlichen Systems berichteten Wright et al. (1996), dass zyklischer Druck auf die Zellkultur mit einer Hyperpolarisation der Chondrozytenzellmembran und einer Aktivierung Ca 2+ -abhängiger Kaliumkanäle verbunden ist. Die Auswirkungen zyklischen Drucks werden durch dehnungsaktivierte Ionenkanäle in der Chondrozytenmembran vermittelt. Die Reaktion der Chondrozyten auf hydrostatischen Druck hängt von den Zellkulturbedingungen und der Frequenz der ausgeübten Belastung ab. So verringert zyklischer hydrostatischer Druck (5 MPa) den Sulfateinbau in die Chondrozytenmonoschicht bei einer Frequenz von 0,05, 0,25 und 0,5 Hz, während bei einer Frequenz über 0,5 Hz der Sulfateinbau in das Knorpelexplantat zunimmt.

M. Bushmann et al. (1992) berichteten, dass Chondrozyten in Agarosegelen ihre Biosynthese als Reaktion auf statische und dynamische mechanische Belastung auf die gleiche Weise verändern wie das kultivierte intakte Organ. Die Autoren fanden heraus, dass mechanische Belastung einen hyperosmotischen Reiz mit anschließender pH-Abnahme in Chondrozyten erzeugt.

Die Wirkung mechanischer Dehnung kann an einer in ein Gel eingetauchten Zellkultur untersucht werden. Die Dehnungskraft wird durch ein computergesteuertes Vakuum erzeugt. Wenn das System einem bestimmten Vakuum ausgesetzt ist, wird der Boden der Petrischale mit der Zellkultur um einen bekannten Betrag gedehnt. Die Verformung ist an den Rändern des Schalenbodens am größten und in der Mitte am geringsten. Die Dehnung wird auch auf die in der Petrischale kultivierten Chondrozyten übertragen. Mit dieser Methode zeigten K. Holm-vall et al. (1995), dass in Chondrosarkomzellen, die in einem Kollagengel (Typ II) kultiviert wurden, die Expression von mRNA eines α2-Integrins erhöht ist . Ein α2-β-Integrin kann an Kollagen Typ II binden. Es gilt als Mechanorezeptor, da es mit Aktin-bindenden Proteinen interagiert und so die extrazelluläre Matrix und das Zytoskelett verbindet.

Der Einfluss des pH-Werts auf den Chondrozytenstoffwechsel

Der pH-Wert der interstitiellen Flüssigkeit der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes ist saurer als in anderen Geweben. A. Maroudas (1980) ermittelte den pH-Wert der Gelenkknorpelmatrix mit 6,9. B. Diamant et al. (1966) ermittelten unter pathologischen Bedingungen einen pH-Wert von 5,5. Es ist bekannt, dass Chondrozyten bei niedrigem PO2 leben, was auf die wichtige Rolle der Glykolyse (95 % des gesamten Glukosestoffwechsels) im Stoffwechsel dieser Zellen hinweist; die Glykolyse geht mit der Produktion großer Mengen Milchsäure einher.

Neben der Versauerung des Milieus durch Glykolyseprodukte sind die Matrixbestandteile selbst von großer Bedeutung. Die große Menge fixierter negativer Ladungen auf Proteoglykanen verändert die extrazelluläre Ionenzusammensetzung: Es wird eine hohe Konzentration freier Kationen (z. B. H +, Na +, K + ) und eine niedrige Konzentration an Anionen (z. B. O2, HCO3 ) beobachtet. Außerdem wird unter dem Einfluss mechanischer Belastung Wasser aus der ECM verdrängt, wodurch die Konzentration fixierter negativer Ladungen steigt und mehr Kationen in die Matrix gelangen. Damit einher geht ein Rückgang des pH-Werts im extrazellulären Milieu, der sich wiederum auf den intrazellulären pH-Wert auswirkt und somit den Stoffwechsel der Chondrozyten verändert. R. Wilkin und A. Hall (1995) untersuchten den Einfluss des pH-Werts im extrazellulären und intrazellulären Milieu auf die Biosynthese der Matrix anhand isolierter Rinderchondrozyten. Sie beobachteten eine duale Veränderung der Matrixsynthese bei pH-Abnahme. Eine leichte Senkung des pH-Werts (7,4 < pH < 7,1) um 50 % erhöhte den Einbau von 35 SO 4 und 3 H-Prolin in die Chondrozyten, während eine stärkere Ansäuerung des Mediums (pH < 7,1) die Synthese im Vergleich zur Kontrolle um 75 % hemmte. Die Schaffung eines niedrigen pH-Werts (6,65) mit Ammoniumionen verursachte eine Verringerung der Matrixsynthese um lediglich 20 %. Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Veränderung des pH-Werts des extrazellulären Mediums der Matrixsynthese nicht allein durch Veränderungen des pH-Werts des intrazellulären Mediums erklärt werden kann. Außerdem sind Chondrozyten in der Lage, den intrazellulären pH-Wert mit Hilfe von Na + -, H + -Austauschern, dem Ka + -abhängigen Cl _ -HCO3 -Transporter und H + /ATPase zu regulieren.

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Der Einfluss der Zusammensetzung des Kulturmediums auf den Stoffwechsel von Chondrozyten

Das Medium zur Kultivierung von Chondrozyten muss den experimentellen Bedingungen entsprechen. In den letzten Jahren wurde Kälberserum verwendet, um die Kultivierungsbedingungen zu optimieren. Bei der Verwendung von Serum müssen jedoch einige wichtige Punkte beachtet werden:

  • Auswärtswachstum von Zellen aus der Gewebeperipherie in Organkulturen,
  • Variabilität in der Zusammensetzung von Seren verschiedener Serien,
  • das Vorhandensein unbekannter Komponenten in ihnen,
  • erhöhtes Risiko von Interferenzen und Artefakten bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener biologischer Faktoren auf die Stoffwechselaktivität von Zellen.

Ein Beispiel hierfür ist eine Studie über die Wirkung von EGF auf Knorpelchondrozyten bei Ratten. EGF stimulierte den Einbau von 3 H-Thymidin und einen Anstieg des DNA-Gehalts in der Kultur. Dieser Effekt war bei niedrigen Serumkonzentrationen (<1 %) stärker ausgeprägt, verschwand jedoch bei hohen Konzentrationen (>7,5 %).

Es ist bekannt, dass Synthese und Abbau in mit Kälberserum angereichertem DMEM im Vergleich zu In-vivo-Bedingungen deutlich erhöht sind. Unterschiede zwischen dem In-vivo- und In-vitro-Stoffwechsel können auf Unterschiede zwischen der Synovialflüssigkeit und dem Medium zurückzuführen sein, in dem die Zellen kultiviert werden. Lee et al. (1997) kultivierten junge Rinderchondrozyten in Agarose unter Verwendung eines Nährmediums, das mit 20 % Kälberserum angereichertes DMEM und eine große Menge normaler allogener Synovialflüssigkeit enthielt. Die Anwesenheit von Synovialflüssigkeit im Medium induzierte einen Anstieg der Proteoglykanmenge auf bis zu 80 % der Gesamtmenge der Synovialflüssigkeit. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Synovialflüssigkeit in Kultur einen Stoffwechsel ähnlich dem in vivo induziert, mit einer hohen Glykosaminoglykansynthese und einer geringen Zellteilung.

G. Verbruggen et al. (1995) zeigten, dass die 35 S-arrpeKaHa-Synthese durch in Agarose kultivierte menschliche Chondrozyten in serumfreiem DMEM 20-30 % des Syntheseniveaus betrug, das in mit 10 % Kälberserum ergänztem DMEM beobachtet wurde. Die Autoren ermittelten, inwieweit IGF-1, IGF-2, TGF-R oder Insulin die Aggrecan-Produktion in serumfreiem Medium wiederherstellten. Die Autoren schlussfolgerten, dass 100 ng/ml Insulin, IGF-1 oder IGF-2 die Aggrecan-Synthese teilweise auf 39-53 % des Kontrollniveaus wiederherstellten. Bei einer Kombination der aufgeführten Faktoren wurde kein Synergismus oder Kumulation beobachtet. Gleichzeitig stimulierten 10 ng/ml TGF-R in Gegenwart von 100 ng/ml Insulin die Aggrecan-Synthese auf 90 % oder mehr des Referenzniveaus. Schließlich hatte menschliches Serumtransferrin, allein oder in Kombination mit Insulin, keinen Einfluss auf die Aggrecansynthese. Als Kälberserum durch Rinderserumalbumin ersetzt wurde, sank der Gehalt an Aggrecanaggregaten signifikant. Die Anreicherung des Kulturmediums mit Insulin, IGF oder TGF-R stellte die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von Aggrecanaggregaten teilweise wieder her. Darüber hinaus können IGF-1 und Insulin die Homöostase in Zellkulturen aufrechterhalten. Nach 40 Tagen Kultivierung in einem mit 10 – 20 ng/ml IGF-1 angereicherten Medium blieb die Proteoglykansynthese auf dem gleichen oder sogar einem höheren Niveau als in dem Medium mit 20 % Kälberserum. Katabole Prozesse verliefen in dem mit IGF-1 angereicherten Medium langsamer als in dem mit 0,1 % Albuminlösung angereicherten Medium, aber etwas schneller in dem mit 20 % Serum angereicherten Medium. In langlebigen Kulturen erhält 20 ng/ml IGF-1 einen stabilen Zellzustand.

D. Lee et al. (1993) verglichen die Wirkung der Zusammensetzung des Kulturmediums (DMEM, DMEM + 20 % Kälberserum, DMEM + 20 ng/ml IGF-1) auf die DNA-Synthese in einer Knorpelgewebeexplantatkultur, einer Monolayerkultur und in Agarosesuspension. Beim Kultivieren in Agarose in Gegenwart von Serum beobachteten die Autoren eine Tendenz der Chondrozyten, sich zu großen Clustern zu gruppieren. Ohne Serum oder mit IGF-1 kultivierte Zellen behielten in Agarose ihre runde Form, sammelten sich in kleinen Gruppen, bildeten jedoch keine großen Aggregate. In einem Monolayer war die DNA-Synthese im serumhaltigen Medium signifikant höher als in dem mit IGF-1 angereicherten Medium; in letzterem war die DNA-Synthese signifikant höher als im nicht angereicherten Medium. Es wurden keine Unterschiede in der DNA-Synthese festgestellt, wenn Chondrozyten in Agarosesuspension in einem nicht angereicherten Medium und in einem Medium mit IGF-1 kultiviert wurden. Gleichzeitig ging die Kultivierung von Chondrozytensuspensionen in Agarose in einem serumangereicherten Medium mit einem erhöhten Einbau des Radionukleotids 3 H-Thymidin im Vergleich zu anderen Medien einher.

Vitamin C ist notwendig für die Aktivierung von Enzymen, die an der Bildung einer stabilen Helixstruktur von Kollagenfibrillen beteiligt sind. Chondrozyten mit Ascorbinsäuremangel synthetisieren unterhydroxylierte, nicht-helikale Kollagenvorstufen, die langsam sezerniert werden. Die Gabe von Ascorbinsäure (50 μg/ml) bewirkt die Hydroxylierung von Kollagen Typ II und IX und deren Sekretion in normalen Mengen. Die Zugabe von Vitamin C hatte keinen Einfluss auf die Proteoglykansynthese. Die Kollagensekretion wird daher unabhängig von der Proteoglykansekretion reguliert.

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