Experimentelle Modelle der Osteoarthritis

Knorpel ist ein hochspezialisiertes Gewebe, das nur eine Art von Zellen (Chondrozyten) enthält, die durch das Fehlen von Blut und Lymphgefäßen gekennzeichnet sind. Die Ernährung des Knorpels erfolgt hauptsächlich durch Absorption aus der Synovialflüssigkeit. Der Metabolismus von Chondrozyten wird durch eine Anzahl von löslichen Faktoren reguliert, die lokal durch Chondrocyten und umgebendes Gewebe produziert werden. Die Funktion von Chondrozyten hängt auch von der Zusammensetzung des extrazellulären Mediums (Sauerstoffspannung, Ionenkonzentration, pH-Wert usw.), VCM-Zusammensetzung, Zell- und Matrixinteraktion, physikalischen Signalen ab. Die Hauptaufgabe der experimentellen Modellierung ist die Schaffung von Kulturen in der extrazellulären Umgebung, ohne den Phänotyp reifer Zellen zu verändern. Die zweite Aufgabe besteht darin, Kulturen für die Untersuchung der vorzeitigen, verzögerten, kurzen oder langfristigen Reaktion von Chondrozyten auf chemische und / oder physikalische Signale zu schaffen. Studien in vitro bieten auch die Möglichkeit , das Verhalten von Chondrozyten bei Arthrose zu studieren. Die dritte Aufgabe ist die Entwicklung von Co-Kurativen Systemen, die es ermöglichen, die Interaktionen verschiedener Gewebe im Gelenk zu untersuchen. Die vierte Aufgabe ist die Vorbereitung von Knorpelimplantaten für die nachfolgende Transplantation. Und schließlich ist die fünfte Aufgabe, Wachstumsfaktoren, Zytokine oder therapeutische Mittel zu untersuchen, die in der Lage sind, die Reparatur zu stimulieren und / oder die Knorpelresorption zu hemmen.

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Modelle von Gelenkknorpelzellkulturen geschaffen, einschließlich Monolayer-Kulturen, suspendierte Kulturen, Chondron-Kulturen, Explantate, Co-Kulturen, unsterbliche Zellkulturen. Jede Kultur hat ihre Vor- und Nachteile, und jede ist geeignet, einen bestimmten Aspekt des Chondrozytenmetabolismus zu untersuchen. Daher sind knorpelige Explantate ein hervorragendes Modell zur Untersuchung des Umsatzes von Matrixelementen, die echte Zelloberflächenrezeptoren und normale Zell-Matrix- und Matrix-Zell-Wechselwirkungen erfordern. Gleichzeitig empfiehlt sich die Untersuchung von Ablagerungen in der Matrix oder von Mechanismen zur Regulation des Chondrozytenstoffwechsels an einer Kultur isolierter Zellen. Eine Monoschicht-Kultur mit geringer Dichte ist notwendig, um den Prozess der Zelldifferenzierung zu untersuchen. Kulturen, die in einer natürlichen oder synthetischen Matrix suspendiert sind, sind ein Modell zur Analyse der adaptiven Reaktion von Chondrozyten auf mechanische Belastung.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrozytenkulturen

Bei der Auswahl von Knorpelgewebe für In-vitro-Studien müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Matrixzusammensetzung und metabolische Aktivität von Chondrozyten variieren in verschiedenen Gelenken und letzteres hängt auch von der Tiefe des Chondrozyten im Gewebe ab. Diese Daten wurden in mehreren Experimenten erhalten, in denen isolierte Subpopulationen von Chondrozyten aus den Knorpelzonen unterschiedlicher Tiefe untersucht wurden. Zwischen kultivierten Chondrozyten, die sich in der Oberfläche befinden, und tiefen Schichten des Gelenkknorpels wurde eine Anzahl von morphologischen und biochemischen Unterschieden gefunden. Oberflächenzellen synthetisieren eine seltene, verarmte Proteoglycan-Fibrillenmatrix, während tiefere Zellen eine Matrix erzeugen, die reich an Fibrillen und Proteoglykanen ist. Darüber hinaus produzieren die Oberflächenzellen relativ mehr kleine nicht-aggregierte Proteoglykane und Hyaluronsäure und relativ weniger Aggrecan und Keratansulfat als die tiefer liegenden Chondrozyten. Ein anderes wichtiges Unterscheidungsmerkmal des Metabolismus von Chondrozyten, die aus den unterschiedlich tiefen Knorpelzonen isoliert werden, ist die Reaktion auf den exogenen Reiz. Laut M. Aydelotte und Co-Autoren waren die Bullenchondrozyten aus der Oberflächenzone des Knorpels empfindlicher für IL-1 als die Zellen der tiefen Zone.

Das Verhalten der Zellen hängt auch von der Lage des Gewebes ab. Chondrozyten Knorpel und Ohrränder, aus dem gleichen Tiere entnommen , die unterschiedlich auf Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten - Wachstumsfaktor (FGF) und TGF-beta reagieren. FGF erhöht Thymidineinbau, Prolin und Leucin in die Kultur von Chondrozyten Rippe aber nicht das Ohr. TGF-P erhöht den Einbau von Thymidin in Knorpel Chondrozyten Rippe und Ohr, hatte aber keinen Einfluss auf den Thymidineinbau in Chondrozyten und Prolin Ohr. Knorpelzellen, die aus Zonen mit der größten Belastung erhalten wurden, unterscheiden sich von denen von Stellen mit einer geringen Belastung des Knorpels. Zum Beispiel reife Chondrozyten des Knorpels des Kniegelenkes aus dem zentralen Bereich des tibialen Knochenoberfläche sheep articular nicht durch den Meniskus bedeckt ist , die die größte Last trägt in vivo, kleiner synthetisierte Aggrecan, Decorin , aber größer als die Zellen der Bereiche durch den Meniskus bedeckt. Die Autoren betonen auch die Bedeutung der Verwendung von Knorpel aus identischen Gelenkzonen bei der Untersuchung der synthetischen Funktion der Gelenke.

Der Stoffwechsel von Chondrozyten und ihre Reaktion auf regulatorische Faktoren hängt auch signifikant vom Alter des Spenders, der Entwicklung seines Skeletts und dem Zustand der Gelenke ab, aus denen die Zellen entnommen werden. In humanen Chondrozyten wird eine signifikante Abnahme der proliferativen Antwort mit dem Alter beobachtet. Der größte Rückgang wird bei Spendern im Alter von 40-50 Jahren und über 60 Jahren beobachtet. Darüber hinaus nimmt die Schwere der proliferativen Antwort auf Wachstumsfaktoren (z. B. FGF und TGF-beta) während des Alterns ab. Neben quantitativen Veränderungen der Proliferation von Chondrozyten gibt es auch qualitative Veränderungen. Junge Spenderzellen (10-20 Jahre alt) reagieren besser auf Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) als auf TGF-beta, während das Gegenteil in adulten Spenderzellen beobachtet wird. Um die altersabhängigen Veränderungen der synthetischen Funktion von Chondrozyten und ihre Reaktion auf die Wirkung von Wachstumsfaktoren zu erklären, werden verschiedene Mechanismen verwendet. Unter ihnen eine Abnahme in der Anzahl und Affinität der Oberflächenzellrezeptoren, eine Veränderung in der Synthese und Bioaktivität von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, eine Modifikation der Postrezeptorsignale.

Der pathologische Zustand der Gelenke verändert auch die Morphologie und Stoffwechselaktivität von Chondrozyten. So haben J. Kouri und Co-Autoren (1996) drei Subpopulationen von Chondrozyten im Knorpel mit Osteoarthritis identifiziert. Chondrozyten aus der oberflächlichen und oberen Knorpelmitte bilden Cluster und synthetisieren mehr Proteoglykane und Kollagen. TGF-beta und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) sind in der Lage, die Synthese von Proteoglykanen durch Chondrozyten zu stimulieren und die Wirkungen von IL-1 und TNF-a teilweise zu neutralisieren. Knorpelexplantate wurden mit Osteoarthritis leidet, und die Chondrozyten aus Knorpel von Patienten mit Osteoarthritis isoliert, sind empfindlicher auf der Stimulation von TGF-beta als gesunder Knorpel Chondrozyten. Diese Unterschiede sind höchstwahrscheinlich mit phänotypischen Veränderungen der Chondrozyten in den oberen Schichten des Gelenkknorpels verbunden.

Die Isolierung einzelner Chondrozyten wird durch sequentielle Behandlung mit proteolytischen Enzymen der ECM erreicht. Nach ihrer Freisetzung aus der ECM sind isolierte Zellen ideal geeignet, um die Synthese von De-novo- Matrixkomponenten zu untersuchen . Einige Autoren verwenden nur Clostridium-Kollagenase, andere vorinkubieren den Knorpel mit Trypsin, Pronase, DNase und / oder Hyaluronidase. Die Anzahl der isolierten Zellen hängt von den verwendeten Enzymen ab. Somit kann bei der Verarbeitung eines von 1 g Kollagenase Gewebe 1,4T0 erhalten werden ⁶ Chondrozyten, wohingegen bei der Verwendung von Pronase, Hyaluronidase und Kollagenase - 4,3-10 ⁶. Bei der Verarbeitung mit Kollagenase verbleiben Aggrecan, Proteine, IL-6, IL-8 viel mehr in der Zellkultur als bei der sequentiellen Behandlung mit verschiedenen Enzymen. Für diese Unterschiede zwischen den beiden Zellkulturen gibt es mehrere Erklärungen:

• Zelluläre Rezeptoren beschädigt oder durch die Wirkung von Enzymen, niedergedrückt, TGF-beta inhibiert die DNA-Synthese von Proteoglycanen in den neu isolierten Chondrozyten (Tag 1), während die DNA und die Proteoglykan-Synthese von Chondrozyten kultiviert in Monoschicht (7 Tage) stimuliert durch TGF-beta. Jedoch Reexpression der Membrankomponenten erfordert eine ausreichende Zeit vor dem Beginn des Experiments.
• Exogene Proteasen können die durch Integrine vermittelte Interaktion von Zellen und Matrix aufbrechen. Die Integrinfamilie fördert die Anheftung von Chondrozyten an VKM-Moleküle (Shakibaei M. Et al., 1997), wobei dieser Bruch die Expression von Matrixgenen beeinflussen kann.
• Rückstände von Matrixkomponenten können die synthetische Funktion von Chondrozyten regulieren. Integrine sind in der Lage, Abbauprodukte von ECM zu erkennen und spielen somit eine wichtige Rolle bei der Gewebereparatur nach Exposition gegenüber proteolytischen Enzymen. T. Larsson und Co-Autoren (1989) berichteten, dass die Zugabe intakter oder fragmentierter Pro-Theoglycane zur Zellkultur die Synthese von Proteinen und Proteoglykanen stimuliert. Jedoch hohe Konzentrationen von Hyaluronsäure bewirkt eine signifikante Verringerung in der Aufnahme von Sulfat-Proteoglykan-Synthese von Chondrozyten Hühnerembryo Chondrozyten Schweine- und Ratten Chondrosarkom Zellen reifen. Außerdem Hyaluronsäure - Inhibitor der Proteoglykan-Freisetzung aus den Zellen selbst in Gegenwart von IL-lb, TNF-a, FGF, was darauf hinweist, dass die erste, die biologische Aktivität von Wachstumsfaktoren und Zytokinen entgegenzuwirken. Der genaue Mechanismus, der der Wirkung von Hyaluronsäure zugrunde liegt, bleibt unklar; Es ist bekannt, dass Chondrozyten einen Rezeptor für Hyaluronsäure enthalten, assoziiert mit Aktinfilamenten des Zytosols. Die Bindung von Hyaluronsäure an ihren Rezeptor stimuliert die Phosphorylierung von Proteinen. Somit zeigen diese Daten die Modulation der metabolischen Funktion von Chondrozyten durch fragmentierte oder native Moleküle von Matrixproteinen durch Aktivierung der Membranrezeptorzellen.
• Die schnelle Stimulation der Synthese von Matrixproteinen durch Chondrozyten durch Enzyme kann eine Folge einer Veränderung der Form von Chondrozyten und / oder der Reorganisation des Zytoskeletts sein.
• Einige Zytokine (z. B. IL-8) und Wachstumsfaktoren (z. B. IGF-1, TGF-P) sind in der ECM fixiert. Das bekannteste Beispiel ist die Bindung von TGF-beta mit Dekor, was zu einer Abnahme der Fähigkeit des Ersteren, Zellwachstum in Ovarialzellen bei chinesischen Hamstern zu induzieren, führt. Die Daten, dass der Inhalt der Knorpeldekoration mit dem Alter zunimmt, weisen auf eine Abnahme der Bioverfügbarkeit von TGF-beta im Alter hin. Wachstumsfaktoren und Zytokine können während der Kultur von Matrixresten freigesetzt werden und dann die Chondrozytenfunktion modulieren.

[8], [9], [10], [11],

Monoschichtkultur von Chondrozyten

Der differenzierte Phänotyp der Chondrozyten ist vor allem durch die Synthese von Typ-II-Kollagen und gewebespezifischen Proteoglykanen sowie eine geringe mitotische Aktivität gekennzeichnet. Es gibt Hinweise darauf, dass bei längerer Kultivierung von Zellen in einer Monoschicht und nach mehreren wiederholten Passagen von Zellen die Chondrocyten ihre kugelförmigen Umrisse verlieren und eine längliche, Fibroblasten-ähnliche Form annehmen. Mit einem solchen Fibroblast Metaplasie synthetische Funktion auch Zellen modifiziert wird, durch eine fortschreitende Abnahme in der Synthese der Kollagene II, IX und XI-Typ und verbesserte Synthese von Kollagen I gekennzeichnet, III und Utipov. Kleine nicht-aggregierte Proteoglycane werden durch funktionelles Aggrecan synthetisiert. Synthatzatepsin B und L ist extrem niedrig in differenzierten Zellen, sondern in dem Prozess der Verlust der Differenzierung erhöht. Kollagenase-1 wird in differenzierten Chondrozyten exprimiert, mit verlängerter Kultivierung nimmt ihre Expression ab, während die Produktion von Gewebeinhibitoren von Metalloproteasen (TIMP) zunimmt.

Die differenzierten Chondrozyten exprimieren das Kollagen des differenzierten Phänotyps, wenn sie von einer Monolayer-Kultur auf eine suspendierte transferiert werden. Der Prozess der Differenzierung hängt wahrscheinlich mit der Form der Zellen zusammen. Diese Eigenschaft wird regelmäßig von Forschern genutzt, die defekte Transplantate mit autologen Chondrozyten untersuchen. Eine kleine Anzahl von Zellen, die aus einem Biopsiematerial erhalten wurden, können in einer Monolayerkultur vermehrt und dann wieder in eine dreidimensionale Matrix vor der Transplantation eingebracht werden. Die Reexpression eines spezifischen Phänotyps durch dedifferenzierte Chondrozyten, die auf eine Agarosekultur übertragen wurden, kann mit TGF-p, einem Ossein-Hydroxyapatit-Komplex und Ascorbinsäure stimuliert werden.

Als Reaktion auf die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen werden Chondrozyten während des Differenzierungsprozesses modifiziert. Die zelluläre Antwort auf Zytokine und Wachstumsfaktoren unterscheidet sich zwischen undifferenzierten und differenzierten Chondrozyten. IL-1 stimuliert die Proliferation von Fibroblasten, während das Wachstum von undifferenzierten Chondrozyten durch IL-1 inhibiert wird. Die Synthese von DNA wird durch IGF-1 in länglichen, aber nicht abgeflachten Chondrozyten stimuliert. In den differenzierten Chondrozyten sind die stimulierenden Wirkungen von IL-1β und TNF-α auf Procollagenase-Produkte ausgeprägter als in undifferenzierten.

Kultivierung von Chondrozyten

Die Kultivierung von Chondrozyten in Suspension in einem flüssigen Medium oder in einer natürlichen oder synthetischen dreidimensionalen Matrix stabilisiert den Phänotyp des Chondrozyten. Zellen behalten ihre sphärische Form bei und synthetisieren gewebespezifische Proteine. Eine gewichtete Chondrozytenkultur wird normalerweise für die Untersuchung der Bildung einer neuen perizellulären Matrix empfohlen. Kultur von Chondrozyten in synthetischem oder natürlichem absorbierendem Polymer verwendet, um Zellen zu Knorpeldefekten Implantieren Gelenkknorpelregeneration zu stimulieren. Synthetische oder natürliche Umgebung für implantierbare Zellen muss eine Reihe von Anforderungen erfüllen:

• Implantate sollten eine poröse Struktur für Adhäsion und Zellwachstum haben,
• weder das Polymer selbst noch die Abbauprodukte sollten während der in vivo- Implantation Entzündungen oder toxische Reaktionen hervorrufen ,
• der Transplantatträger sollte in der Lage sein, an einen angrenzenden Knorpel oder subchondralen Knochen zu binden,
• eine natürliche oder synthetische Matrix muss absorptionsfähig sein, ihr Abbau muss durch Geweberegeneration ausgeglichen werden,
• zu erleichtern, sollte im Zellphänotyp und die Synthese von gewebespezifischen Proteinen Chondrozyten hält es platziert Reparatur von Knorpel- chemischer Struktur und Porenarchitektur Matrix helfen
• Während der Implantation in vivo ist es notwendig, die mechanischen Eigenschaften der synthetischen oder natürlichen Matrix zu untersuchen.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspension von Chondrozyten in der flüssigen Phase

Zellanheftung an Kunststoffbehältern, bei dem die Kultivierung von Chondrozyten kann ihre Wände mit einer Lösung, Methylcellulose, Agarose, Hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylat) oder ein Gemisch von Kollagen-Agarose-beschichteten, verhindert werden. Unter diesen Bedingungen bilden Chondrozyten Cluster und synthetisieren hauptsächlich Aggrecan und gewebespezifische Kollagene (II, IX, XI-Typen). Normalerweise werden zwei Arten von Zellen gefunden. Die Zellen in der Mitte behalten eine kugelige Form, umgeben von einer gut entwickelten ECM, die durch histochemische und ultrastrukturelle Studien bestätigt wird. In der Peripherie haben Chondrozyten diskoide Konturen, sind von einer seltenen ECM umgeben; Über die funktionellen Eigenschaften solcher Zellen ist wenig bekannt.

Die Kultivierung von Chondrozyten auf Mikroträgern, die in Suspension unterstützt werden, ist möglich; Als Microcarrier werden Dextran-Kügelchen (Cytodex), kollagenbeschichtete Dextran-Kügelchen (Cytodex III), hohlraumfreie Mikrokügelchen vom Kollagen Typ I (Collagen) verwendet. Unter diesen Kulturbedingungen heften sich Chondrozyten an die Oberfläche des Mikroträgers, behalten ihre sphärische Form bei und erzeugen ein matrixartiges Material. Darüber hinaus fördert die Verwendung von Kollagen die Proliferation von Chondrozyten und die Wiederexpression eines normalen Phänotyps. Daher kann die Kultivierung von Chondrozyten auf den Mikrokügelchen des Kollagens verwendet werden, um den Zellphänotyp vor der Transplantation wiederherzustellen.

Ein anderes Verfahren zur Kultivierung einer Suspension von Chondrocyten in einem flüssigen Medium ist ihre Kultivierung in Form von dichten Kügelchen, die aus Zellen (0,5-1 · 10 ^b ) bestehen, die durch Zentrifugation erhalten werden. Solche Chondrozyten sind in der Lage, eine Matrix zu produzieren, die eine große Anzahl von Proteoglykanen enthält, Kollagen Typ II, aber nicht Typ-I-Kollagen, was durch histologische, immunhistochemische und quantitative Methoden bestätigt wird.

Suspension von Chondrozyten in einer natürlichen ECM

Chondrozyten können in Suspension in einer dreidimensionalen Matrix (Weichagar, Agarose, Kollagengel oder -schwamm, Hyaluronsäure, Fibrinkleber, Alginatperlen) kultiviert werden.

Kultivierte Agarose-Chondrozyten behalten ihren normalen Phänotyp und synthetisieren Kollagen-Typ-II- und gewebespezifische Aggregat-Neu-Aggregate. Bei Kultivierung in Agarose werden zell-synthetisierte Proteoglykane für 50 Tage in das Medium freigesetzt. Zum Vergleich - in Monolayer-Kultur ist die Zellphase bereits in den ersten 5-6 Tagen der Kultivierung mit Glykosaminoglykanen überfüllt; Wenn sie in dem Medium kultiviert werden, nachdem die Synthese und Freisetzung von Glykosaminoglykanen intensiviert worden ist, tritt die zeitabhängige Abnahme der Glykosaminoglykane in den ersten 8-10 Tagen auf. Dennoch unterscheidet sich das Verhalten von Chondrozyten während ihrer Kultivierung in Agarose von dem unter In-vivo-Bedingungen. In Agarose enthält eine große Anzahl von synthetisierten Aggregan-Aggregaten immer kleinere Moleküle als in vivo. TGF-P stimuliert die Synthese von Proteoglykanen im Explantat, reduziert jedoch die Synthese von Aggrecan in Agarose.

Alginat ist ein lineares Polysaccharid aus braunem Seetang. In Gegenwart von zweiwertigen Kationen, wie Ca ^{2+ -Ionen}, wird dieses Polymer zu einem Gel. Jede Chondrozyten in Alginat gefangen, die durch eine Matrix von negativ geladenen Polysacchariden umgeben ist , sind die Poren , die mit denen vergleichbar hyalinen Knorpels. Die Matrix , die Chondrozyten in Alginatkugeln gebildet wird, bestehend aus zwei Segmenten - eine dünne Schicht aus zellassoziierte Matrix auf die perizellulären und territorialen Matrizen von Gelenkknorpel und entfernteren Matrix greif Äquivalent in nativen Gewebe entspricht. Am 30. Tag der Kultur, relative und absolute Volumen von Zellen belegt, und jeder der beiden Abteilungen in dem Wulst Alginat denen von nativen Knorpel fast völlig identisch. Seit fast 30 Tagen behalten Chondrozyten ihre Kugelform und produziert Aggrecan, hydrodynamischen Eigenschaften , die mit denen von Aggrecan - Moleküle in der Matrix des Gelenkknorpels Moleküls und Kollagen II ähnlich sind, IX und XI - Typen. Zur gleichen Zeit wie die anderen Kulturen, Suspensionen, Alginatkugeln auf der Oberfläche der abgeflachten Zellen vorhanden sind , die eine geringe Menge an Typ - I - Molekül erzeugen , Kollagen, direkt in die Umgebung abgegeben und nicht in dem Videorecorder eingebaut. In den Alginatperlen wird eine mäßige Proliferation von Chondrocyten beobachtet. Nach 8 Monaten Kultivierung in Alginatgel reifen Chondrozyten nicht verlieren metabolische Aktivität und setzt sich gewebespezifische Kollagen Typ II und Aggrecan zu synthetisieren.

N. Tanaka und Mitautoren (1984) untersuchten die Diffusionseigenschaften verschiedener natürlicher Moleküle in dem Alginat und fanden heraus, dass Moleküle, die größer als 70 kD sind, nicht durch das Alginat diffundieren. Somit ist die Kultivierung von Zellen im Alginat geeignet, die Regulation der Matrixbiosynthese und die Organisation der ECM zu untersuchen. Die Verfügbarkeit von Zellen, die in dem Alginat kultiviert werden, erlaubt es, die Wirkung von Peptidregulationsfaktoren und pharmakologischen Wirkstoffen auf transkriptionelle, posttranskriptionelle und translationale Ebenen zu untersuchen.

Chondrozyten werden auch in einer Matrix von Kollagenfasern der Typen I und II kultiviert. S. Nehrer und Co-Autoren (1997) verglichen die Funktion von Hunde-Chondrozyten in porösen Kollagen-Proteoglykan-Polymermatrices, die Collagen verschiedener Typen enthielten. Sie fanden wichtige Unterschiede in der Morphologie der biosynthetischen Funktion von Chondrozyten, die in Kollagenmatrices kultiviert wurden, die Kollagentypen I und II enthielten. Zellen in der Matrix von Kollagen Typ II wanden ihre sphärische Form auf, während sie in Typ I-Kollagen eine fibroblastenähnliche Morphologie aufwiesen. Darüber hinaus produzierten Chondrozyten in der Matrix des Typ-II-Kollagens mehr Glykosaminoglykane. J. Van Susante et al. (1995) verglichen die Eigenschaften von Chondrozyten, die in dem Alginat- und dem Kollagengel (Typ I) kultiviert wurden. Die Autoren fanden einen signifikanten Anstieg der Anzahl der Zellen im Kollagengel, aber ab dem 6. Tag der Kultivierung verloren die Zellen einen charakteristischen Phänotyp und wandelten sich in Fibroblasten-ähnliche Zellen um. In dem Alginatgel wurde eine Abnahme der Anzahl von Zellen beobachtet, aber die Chondrozyten behielten ihren normalen Phänotyp bei. Im Kollagengel war die Anzahl der Proteoglykane pro Zelle signifikant höher als im Alginat, jedoch war die Synthese der Matrixelemente im Gel ab dem 6. Kultivierungstag reduziert, während im Alginat die Synthese weiter zunahm.

Eine feste dreidimensionale Fibrinmatrix ist eine natürliche Substanz, die die in sie eingewogenen Chondrozyten in einem differenzierten Phänotyp unterstützt. Die 3D-Fibrinmatrix kann auch als Träger für die Chondrozytentransplantation verwendet werden. Vorteile von Fibrin sind das Fehlen von Zytotoxizität, die Fähigkeit, den Raum zu füllen, die Haftfähigkeit. Durch histologische und biochemische Studien, Autoradiographie, Elektronenmikroskopie, Chondrozyten im Fibringel wurde gefunden, dass sie ihre Morphologie beibehalten, sich vermehren und sogar nach 2 Wochen Kultur eine Matrix bilden. G. Homminga und Co-Autoren (1993) berichteten jedoch, dass nach 3 Tagen der Kultivierung der Zerfall von Fibrin beginnt, die Dedifferenzierung von Chondrozyten fortschreitet.

Suspension von Chondrozyten in einer künstlichen (synthetischen) ECM

Knorpelimplantate für die rekonstruktive oder orthopädische Chirurgie können erhalten werden, indem isolierte Chondrozyten in vitro in einer synthetischen biokompatiblen Matrix gezüchtet werden.

Kultivierte Polyglycolsäure-Chondrozyten proliferieren und behalten normale Morphologie und Phänotyp innerhalb von 8 Wochen bei. Der Chondrozyten-Polyglycolsäure-Komplex besteht aus Zellen, Glykosaminoglykanen, Kollagenen und besitzt eine äußere Kollagenkapsel. In solchen Implantaten gibt es jedoch zwei Arten von Kollagenmolekülen - I und II. Implantate, die durch eine Reihe von Passagen von Chondrozyten dedifferenziert sind, haben eine größere Anzahl von Glykosaminoglykanen und Kollagenen als in Implantaten von primär undifferenzierten Chondrozyten.

L. Freed und Co-Autoren (1 993b) verglichen das Verhalten von humanen und Bullen-Chondrozytenkulturen in faseriger Polyglycolsäure (HPHC) und in Polymilchsäure (PPLC). Nach 6-8 Wochen Kultivierung von Bullenchondrozyten im HSVG oder PPLC beobachteten die Autoren Zellproliferation und Knorpelmatrixregeneration. Bei HSBC waren die Chondrocyten kugelförmig und befanden sich in Lakunen, die von einer knorpeligen Matrix umgeben waren. Nach 8 Wochen In-vitro- Kultur enthielt das regenerierte Gewebe bis zu 50% Trockensubstanz (4% Zellmasse, 15% Glykosaminoglykane und 31% Kollagen). In PPLK Zellen waren spindelförmig, eine kleine Menge von Glykosaminoglykanen und Kollagen. In HSBC war das Zellwachstum 2 mal intensiver als in PTCA. Unter In- vivo-Bedingungen erzeugten Chondrozyten, die in HPVC und PPLC für 1 bis 6 Monate gezüchtet wurden, ein Gewebe, das histologisch dem Knorpel ähnlich war. Die Implantate enthielten Glykosaminoglykane, Typ-I- und Typ-II-Kollagene.

Fötale Bullenchondrozyten wurden in porösem hydrophobem und hydrophilem Polyethylen hoher Dichte kultiviert. Nach 7 Tagen Inkubation in beiden Substraten behielten die Zellen eine sphärische Form bei, die hauptsächlich Typ II-Kollagen enthielt. Nach 21 Tagen Kultivierung stellte sich heraus, dass die hydrophile Matrix mehr Typ-II-Kollagen als die hydrophobe Matrix enthält.

Knorpelgewebe kann auch durch Kultivieren in einer Monoschicht auf Millicell-CM-Filtern erhalten werden. Die Vorbeschichtung der Filter mit Kollagen ist für die Befestigung von Chondroiten notwendig. Die histologische Untersuchung der Kultur zeigt die Akkumulation von Chondrozyten in der ECM, die Proteoglykane und Typ II-Kollagen enthalten. Kollagen Typ I in einer solchen Kultur wird nicht nachgewiesen. Chondrozyten in dem resultierenden Knorpelgewebe haben eine sphärische Form, aber auf der Oberfläche des Gewebes sind sie etwas abgeflacht. Die Dicke des neu gebildeten Gewebes nahm mit der Zeit zu und hing von der Anfangsdichte der Monoschicht der Zellen ab. Unter optimalen Kulturbedingungen erreichte die Dicke des Knorpelgewebes 110 & mgr; m, die Organisation seiner Zellen und des Kollagens in der Oberfläche und in den tiefen Schichten ist ähnlich der des Gelenkknorpels. VKM enthält etwa 3 mal mehr Kollagen und Proteoglykane. Nach 2 Wochen Kultivierung wurde die Akkumulation der Matrix-sa festgestellt, die es ermöglichte, das Gewebe aus dem Filter zu extrahieren und es für die Transplantation zu verwenden.

Sims et al. (1996) untersuchten die Kultivierung von Chondrocyten in einer Polyethylenoxid-Gel-verkapselten Polymermatrix, die es erlaubt, eine große Anzahl von Zellen durch Injektion zu transportieren. Sechs Wochen nach der Injektion in das subkutane Gewebe athymischer Mäuse wurde ein neuer Knorpel gebildet, der morphologisch durch eine weiße Opaleszenz ähnlich dem hyalinen Knorpel gekennzeichnet war. Daten aus histologischen und biochemischen Studien zeigten das Vorhandensein von aktiv proliferierenden Chondrozyten, die ECM produzieren.

Explantation

Die Untersuchung von Knorpelgewebe wird verwendet, um die Prozesse von Ana- und Katabolismus, Homöostase, Resorption und Reparatur zu untersuchen. Chondrozyten in knorpeligen Gewebeexplantaten unterstützen den normalen Phänotyp und die normale Zusammensetzung von ECM, ähnlich denen in Gelenkknorpel in vivo. Nach 5 Tagen Kultivierung in Anwesenheit von Serum wird ein konstanter Grad an Synthese und natürlichem Abbau erreicht. Die Gewebe-Resorption kann in der Hauptkultur und -kultur durch die Zugabe von Serum durch eine Reihe von Mitteln beschleunigt werden, beispielsweise IL-IB, TNF-a, bakterielle Lipopolysaccharide, Retinsäurederivate oder aktive Sauerstoffradikale. Um die Reparatur von Knorpel zu untersuchen, wird seine Schädigung durch lösliche Entzündungsmediatoren (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) oder physikalischen Bruch der Matrix induziert .

Die Methode der organotypischen Kulturen ist ein Modell zur Untersuchung von In-vitro- Effekten isolierter externer Faktoren auf Chondrozyten und die umgebende Matrix. In vivo sind Chondrozyten selten in der ECM lokalisiert und kontaktieren sich nicht gegenseitig. Die Kultur des Explantatgelenkknorpels behält diese strukturelle Organisation sowie die besonderen Wechselwirkungen zwischen den Chondrozyten und ihrer umgebenden extrazellulären Umgebung bei. Dieses Modell wird auch verwendet, um die Wirkung von mechanischer Belastung, pharmakologischen Wirkstoffen, Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Hormonen auf den Stoffwechsel von Knorpel zu untersuchen.

Ein weiterer Vorteil der knorpeligen Gewebeexplantation ist die Abwesenheit von Chondrozytenschaden durch proteolytische Enzyme oder ein mechanischer Faktor, der bei der Isolierung von Zellen unvermeidbar ist. Rezeptoren und andere Membranproteine und Glycoproteine sind vor schädigenden Faktoren geschützt.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultur der Chondrons

Chondron ist eine strukturelle, funktionelle und metabolische Einheit des Gelenkknorpels, die aus einem Chondrozyten, seiner perizellulären Matrix und einer kompakten Filamentkapsel besteht und für die Matrixhomöostase verantwortlich ist. Die Chondrons werden mechanisch aus dem Knorpel extrahiert und durch mehrere aufeinanderfolgende Niedriggeschwindigkeits-Homogenisationen gesammelt. Getrennt von den Zonen unterschiedlicher Tiefe kann hondrony Knorpels in vier Kategorien eingeteilt werden: single hondron, twin hondrony, mehrere (drei oder mehr) linear angeordnet hondrony (Spalte hondronov) hondronov Staus.

Einzelne Chondrone werden normalerweise in den mittleren Schichten des intakten Knorpels gefunden, gepaart - an der Grenze der mittleren und tiefen Schichten sind linear lokalisierte multiple Chondrons typisch für tiefe Schichten von intaktem Knorpel. Schließlich bestehen Cluster von Chondronen aus zufällig organisierten Gruppen von einzelnen und gepaarten Chondronen, die den aggregierten Zustand nach der Homogenisierung beibehalten. Akkumulationen von Chondronen sind große Fragmente von Knorpel, die gewöhnlich mehrere Chondrone und radial angeordnete Kollagenfibrillen enthalten, dh eine typische Organisationscharakteristik von tiefen Schichten der Matrix. Chondrone sind in einer transparenten Agarose immobilisiert, was es erlaubt, ihre Struktur, molekulare Zusammensetzung und metabolische Aktivität zu untersuchen. Das Chondron - Agarose - System wird als ein Mikromodell des Knorpels angesehen, das sich vom traditionellen Chondrozyten - Agarose - System dadurch unterscheidet, dass eine natürliche Mikroumgebung aufrechterhalten wird und keine Synthese und Assemblierung erforderlich ist. Die Chondron-Kultur ist ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Zellen und Matrix im Gelenkknorpel unter normalen und pathologischen Bedingungen.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultur von unsterblichen Chondrozyten

Um dauerhafte Zelllinien zu erzeugen, werden rekombinante DNA oder onkogenhaltige Viren verwendet, die die Zelle "unsterblich" machen können. Immortale Chondrozyten haben die Fähigkeit zur endlosen Proliferation, wobei ein stabiler Phänotyp aufrechterhalten wird. F. Mallein-Gerin et al (1995) zeigte, dass das Onkogen SV40T-induzierte Proliferation von Chondrozyten Maus ist, die somit weiterhin stabil die Kollagene II, IX und XI Arten ausdrücken, sowie Gelenk- und Aggrecan-Bindungsprotein. Eine solche Zelllinie erwirbt jedoch die Fähigkeit, Kollagen vom Typ I zu synthetisieren, wenn sie in einer Monoschichtkultur oder in einem Agarosegel kultiviert wird.

W. Horton und Co-Autoren (1988) beschrieben eine Linie unsterblicher Zellen mit einem niedrigen Grad an Kollagen-Typ-II-mRNA-Expression. Diese Zellen wurden erhalten, indem sie mit einem Maus-Retrovirus transformiert wurden, der I-myc- und y-ra-Onkogene enthielt. Diese Art von Zellen ist ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen der artikulären Matrix in Abwesenheit von Typ-II-Kollagen, sowie die Regulierung der Synthese von Typ-II-Kollagen.

Die Kultur von Chondropyten mit mutierten oder deletierten Genen ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung ihrer physiologischen Funktion. Dieses Modell eignet sich besonders für die Rolle von spezifischen Molekülen in Knorpelmatrix Organisationen zu studieren oder die Auswirkungen verschiedener Regulationsfaktoren auf den Knorpelmetabolismus zu studieren. Chondrozyten Fern Gen synthetisiert Kollagen Typ IX - Kollagen - Fibrillen breiter als normal, was darauf hinweist , dass Kollagen Typ IX , den Durchmesser der Fibrillen reguliert. Wie in Kapitel 1 erwähnt, wurde kürzlich eine Mutation des COLAI-Gens, das für Typ II-Kollagen in Familien mit primär generalisierter Osteoarthritis kodiert, nachgewiesen. Zur Untersuchung der Wirkung von mutiertem Kollagen Typ II in der Gelenkmatrix R. Dharmrvaram et al (1997) durchgeführt Transfektion ( „Verunreinigung“ eine Fremdnucleinsäure) defekt COL ₂ AI (Arginin an Position 519 durch Cystein ersetzt ist) in menschlichen fötalen Chondrozyten in vitro.

System von Cokulturen. Im Gelenk wechselwirkt der Knorpel mit Zellen anderer Arten, die in der Synovialmembran, der Synovialflüssigkeit, den Ligamenten, dem subchondralen Knochen enthalten sind. Der Metabolismus von Chondrozyten kann durch verschiedene lösliche Faktoren beeinflusst werden, die von diesen Zellen synthetisiert werden. Arthritis Gelenkknorpel wird also durch proteolytische Enzyme und freie Radikale zerstört, die von Synovialzellen produziert werden. Daher wurden Modelle entwickelt, um komplexe Wechselwirkungen zwischen Knorpel und umgebendem Gewebe zu untersuchen, die als Kokultur bezeichnet werden.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) wurden Kaninchen-Chondrozyten und Osteoblasten in dem Co-Kultur-System (Costar), in dem die Zellen mikroporöse Membran getrennt waren (0,4 Mikrometer) ermöglicht den Austausch zwischen den beiden Zelltypen ohne direkten Kontakt. Diese Studie zeigte die Fähigkeit von Osteoblasten, das Wachstum von Chondrozyten durch lösliche Mediatoren zu stimulieren.

A.M. Malfait und Koautoren (1994) untersuchten die Beziehung zwischen Monozyten des peripheren Blutes und Chondrozyten. Dieses Modell eignet sich zur Untersuchung der durch Zytokine vermittelten Prozesse bei entzündlichen Arthropathien (rheumatoide Arthritis, seronegative Spondylitis etc.). Die Autoren des Modells trennten die Zellen durch eine proteinbindende Membran mit 0,4 μm Durchmesser. Die Studie fand heraus, dass Lipopolysaccharid-stimulierten Monozyten arbeitet ifno IL-1-a, die die Synthese von Chondrozyten Aggrecan und trug zum Abbau von bereits synthetisierten Aggrecan Aggregate hemmt.

K. Tada et al (1994) erstellt ein Kokultur-Modell, bei dem Endothelzellen in Collagen (I-Typ) Gel in die innere Kammer von der äußeren Kammer von der sie durch Chondrozyten platziert getrennt gestellt wurde in einem Filter mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern. In einem Zustand vollständiger Isolation von der äußeren Kammer bildeten menschliche Endothelzellen in Gegenwart von EGF oder TGF-a Röhrchen in einem Kollagengel. Mit der gleichzeitigen Kultivierung beider Arten von TGF-Zellen wurde die abhängige Bildung der Röhren durch Endothelzellen inhibiert. Die Chondrozyteninhibierung dieses Prozesses wurde teilweise durch Anti-TGF-beta-Antikörper eliminiert. Es kann angenommen werden, dass das von den Chondrozyten produzierte TGF-beta die Vaskularisierung des Knorpels selbst unterdrückt.

S. Groot und Co-Autoren (1994) kultivierten gleichzeitig Chondrozyten aus den hypertrophen und proliferativen Zonen des Knochens einer 16 Tage alten fötalen Maus mit Hirngewebe. Nach 4 Tagen Kultur wurde eine Transdifferenzierung von Chondrozyten in Osteoblasten und der Beginn der Osteoidbildung beobachtet. Nach 11 Tagen Kultivierung wurde ein Teil des Knorpels durch Knochengewebe ersetzt und die Knochenmatrix teilweise verkalkt. Einige Neuropeptide und Neurotransmitter, die von Hirngewebe produziert werden, beeinflussen den Metabolismus von Osteoblasten oder haben Rezeptoren an ihnen. Unter ihnen können Norepinephrin, vasoaktives intestinales Peptid, mit dem Calcitonin-Gen assoziiertes Peptid, Substanz P und Somatostatin isoliert werden . Mit Chondrozyten kultiviert, können Teile von Gehirngewebe einige dieser Faktoren erzeugen, die den Prozess der Chondrocyten-Transdifferenzierung in Osteoblasten induzieren können.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Der Einfluss externer Faktoren auf die Kultur von Chondrozyten

Die Wirkung von Sauerstoffspannung auf den Stoffwechsel von Chondrozyten

In den meisten Fällen entwickeln sich Chondrozytenkulturen unter atmosphärischer Sauerstoffspannung. Nichtsdestoweniger ist es gut bekannt, dass Chondrozyten in vivo unter hypoxischen Bedingungen existieren und die Sauerstoffspannung mit verschiedenen pathologischen Zuständen variiert. Während des Reifeprozesses werden signifikante Veränderungen in der Blutversorgung der Epiphysen beobachtet. Da die Vaskularisierung in verschiedenen Bereichen der Wachstumsplatte variiert, variiert auch die Sauerstoffspannung in ihnen. C. Brighton und R. Heppenstall (1971) zeigten, dass in der Platte der Tibia bei Kaninchen die Sauerstoffspannung in der hypertrophen Zone geringer ist als im umgebenden Knorpel. Messungen einiger Stoffwechselparameter haben gezeigt, dass Chondrozyten in der Lage sind, schnell auf lokale Veränderungen der Sauerstoffkonzentration zu reagieren. Zuallererst nimmt der Verbrauch von Chondrozyten bei niedriger Sauerstoffspannung ab. Bei einer Abnahme der Sauerstoffspannung von 21 auf 0,04% ist die Glucoseverwertung erhöht, die Glycolyse-Enzymaktivität und die Milchsäuresynthese sind erhöht. Selbst bei einer niedrigen Sauerstoffspannung bleibt die absolute Menge an ATP, ADP und AMP stabil. Diese Daten zeigen die Direktionalität des Chondrozyten-Metabolismus zur Maximierung der Energieeinsparung. Nichtsdestoweniger ändert sich die synthetische Aktivität und damit die Reparaturprozesse unter Hypoxiebedingungen.

Hohe Sauerstoffspannung beeinflusst auch den Metabolismus von Chondrozyten, was zu einer Verringerung der Synthese von Proteoglykanen und DNA, Abbau der Knorpelmatrix, führt. Diese Effekte gehen in der Regel mit der Produktion von freien Sauerstoffradikalen einher.

Einfluss der Ionenkonzentration und des osmotischen Druckes der Umgebung auf die Funktion der Chondrozyten

Im nativen Knorpel unterscheidet sich die Ionenkonzentration signifikant von derjenigen in anderen Geweben: Der Natriumgehalt im extrazellulären Medium beträgt 250-350 mmol und seine Osmolarität beträgt 350-450 mosmol. Wenn Chondrozyten von einem Videorecorder zu isolieren und sie in einem Standardmedium (DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium - Dulbecco Minimum Essential Medium) Osmolarität - 250-280,7 mOsm) Inkubieren ändert Umgebung der Zelle scharf umgibt. Außerdem ist die Konzentration von Calcium und Kalium in Standardmedien viel niedriger als in nativem Gewebe, und die Konzentration von Anionen ist viel höher.

Die Zugabe von Saccharose zu dem Medium führt zu einer Erhöhung seiner Osmolarität und induziert einen vorübergehenden intrazellulären Anstieg der Konzentration von H ^{+ -} und Calciumanionen im Cytosol. Solche intrazellulären Veränderungen können die Prozesse der Chondrozyten-Differenzierung und ihre metabolische Aktivität beeinflussen. J. Urban et al. (1993) fanden heraus, dass der Einbau von ³⁵ 8-Sulfat und ³ H-Prolin mit isolierten Chondrozyten, die in einem Standard-DMEM-Medium für 2-4 Stunden inkubiert wurden, nur 10% von dem in nativem Gewebe betrug. Die Intensität der Synthese erreichte ein Maximum mit einer Osmolarität des extrazellulären Mediums von 350-400 mOsmol sowohl in den neu isolierten Chondrozyten als auch in den Explantaten des Knorpelgewebes. Darüber hinaus erhöhte sich das Chondrocytenvolumen um 30 bis 40%, nachdem isolierte Zellen in einem Standard-DMEM-Medium mit dieser Osmolarität platziert wurden. Wenn Chondrozyten jedoch unter nichtphysiologischer Osmolarität für 12-16 Stunden kultiviert werden, passen sich Zellen an neue Bedingungen an und verringern die Intensität der Biosynthese proportional zur Osmolarität des extrazellulären Mediums.

P. Borgetti et al (1995) untersuchten die Wirkung von Osmolarität des extrazellulären Mediums auf das Wachstum, die Morphologie und die Biosynthese von Schweine-Chondrozyten. Die Autoren zeigten ähnliche biochemische und morphologische Eigenschaften von Chondrozyten kultiviert in Medium mit einer Osmolarität mOsm 0,28 und 0,38. Wenn 0,48 mOsm Osmolarität des Mediums während der ersten 4-6 Stunden der Kultur Abnahme der Zellproliferation und Proteinsynthese beobachtet wurde, aber trat anschließend diese Parameter wieder herzustellen, die schließlich die Steuerwerte erreicht. Wenn Chondrozyten in einem Medium mit 0,58 mOsm Osmolarität Zellen ihre Fähigkeit verlieren, das Züchten physiologischer Intensität proliferative Prozesse zu unterstützen, und nach 6 Tagen die Anzahl der Chondrozyten wird deutlich reduziert. Bei einer Osmolarität des Mediums von 0,58 Mosmol wird eine tiefe Hemmung der Proteinsynthese beobachtet. Darüber hinaus, wenn sie in Medien mit einer Osmolarität mOsm behalten 0,28-0,38 Chondrozyten physiologische Phänotyp mit einer höheren Osmolarität (mOsm 0,48-0,58) wesentliche Änderungen in der Zellmorphologie, wie manifestierten Verlust charakteristische Phänotyp Umwandlung Chondrozyten in Fibroblasten-ähnliche Zellen, sowie Zellverlust, die Fähigkeit, Matrix-Proteoglykane zusammenzustellen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die Fähigkeit von Chondrozyten, auf eingeschränkte Osmolalitätsschwankungen in der extrazellulären Umgebung zu reagieren.

Die Änderung der Konzentration anderer Ionen kann auch die Prozesse der Biosynthese in Chondrozyten beeinflussen. Somit nimmt der Grad des Einschlusses von ³⁵ S (Sulfat) um die Hälfte zu mit einer Zunahme der Konzentration von Kaliumionen von 5 mmol (Konzentration in einem Standard-DM-DM-Medium) auf 10 mmol (Konzentration in VKM in vivo). Calciumkonzentrationen unter 0,5 mmol trugen zur Bildung von Kollagen durch reife Bullenchondrozyten bei, während eine Konzentration von 1-2 mmol (entsprechend der Konzentration in dem Standard-DM-DM-Medium) eine signifikante Verringerung der Kollagensynthese bewirkte. Ein moderater Anstieg der Biosynthese wurde bei hohen Calciumgehalten (2-10 mmol) beobachtet. Verschiedene Kationen sind an der Bindung von Chondrozyten an VKM-Proteine beteiligt. Somit stellen Magnesium- und Manganionen eine Anlagerung an Fibronectin und Kollagen Typ II bereit, während Calciumionen nicht an der Anheftung von Chondrozyten an Proteine beteiligt sind. So zeigen die Ergebnisse der beschriebenen Studien den Einfluss von Veränderungen der extrazellulären Ionen auf Kalium, Natrium, Calcium und Osmolarität des Mediums auf die Biosynthesefunktion von Chondrozyten, die in Standardmedien inkubiert wurden.

Der Einfluss von mechanischer Belastung auf den Stoffwechsel von Chondrozyten

Immobilisierung des Gelenks verursacht eine reversible Atrophie des Knorpels, was auf die Notwendigkeit mechanischer Reize für den normalen Verlauf von Stoffwechselprozessen in der ECM hinweist. In den meisten Fällen existieren die verwendeten Zellkulturmodelle unter normalen atmosphärischen Druckbedingungen. M. Wright und Co-Autoren (1996) zeigten, dass die mechanische Umgebung den Stoffwechsel von Chondrozyten beeinflusst, die Reaktion der Zellen hängt von der Intensität und Häufigkeit der Kompressionsbelastung ab. Experimente mit der Beladung von Explantaten von intaktem Gelenkknorpel in vitro zeigten eine Abnahme der Synthese von Proteinen und Proteoglykanen unter der Einwirkung einer statischen Belastung, während eine dynamische Belastung diese Prozesse stimuliert. Die genauen Mechanismen, um den Effekt der mechanischen Belastung auf den Knorpel zu realisieren, sind komplex und hängen wahrscheinlich mit der Zelldeformation, dem hydrostatischen Druck, dem osmotischen Druck, dem elektrischen Potential und den zellulären Oberflächenrezeptoren von Matrixmolekülen zusammen. Um die Wirkung jedes dieser Parameter zu untersuchen, ist es notwendig, ein System zu schaffen, in dem ein Parameter unabhängig voneinander variiert werden kann. Zum Beispiel ist eine Explantatkultur nicht geeignet, um eine Zelldeformation zu untersuchen, aber sie kann verwendet werden, um die Gesamtwirkung von Druck auf die metabolische Aktivität von Chondrozyten zu untersuchen. Kompression des Knorpels führt Verformung zu Zelle und auch durch das Auftreten von hydrostatischen Druckgradienten, elektrischem Potential begleitet, und die Fluidströmungsänderung physikochemische Faktoren wie der Wassergehalt in der Matrix, die Dichte der elektrischen Ladung, die Höhe des osmotischen Drucks. Die Zelldeformation kann mit isolierten Chondrozyten untersucht werden, die in ein Agarose- oder Kollagengel eingetaucht sind.

Mehrere Systeme wurden entwickelt, um die Wirkung mechanischer Stimulation auf die Kultur von Chondrozyten zu untersuchen. Einige Forscher verwenden Systeme für diesen Zweck, bei denen der Druck auf die Zellkultur durch die Gasphase ausgeübt wird. Zum Beispiel beschreibt JP Veldhuijzen et al (1979) mit einem Überdruck von 13 kPa bei einer niedrigen Frequenz (0,3 Hz) während 15 Minuten unter Verwendung beobachtete einen Anstieg der cAMP - Synthese und Proteoglykanen und DNA - Synthese zu senken. R. Smith et al (1996) zeigte , dass die intermittierende Exposition von primären Kulturen von Chondrozyten bull hydrostatischen Druck (10 MPa) bei 1 Hz für 4 Stunden verursachte die Erhöhung der Synthese von Aggrecan und Kollagen Typ II, während der konstante Druck keine Auswirkung auf diesen Prozessen hatte. Verwendung berichtete ein ähnliches System M. Wright et al (1996) , dass der zyklische Druck auf der Zellkultur mit Hyperpolarisation der Zellmembran von Chondrozyten und Aktivierung von Ca assoziiert ist ²⁺ -abhängigen Kaliumkanäle. Somit werden die Wirkungen des zyklischen Drucks durch Ionenkanäle vermittelt, die durch Dehnung in der Chondrocytenmembran aktiviert werden. Die Antwort der Chondrozyten auf den hydrostatischen Druck hängt von den Bedingungen der Zellkultur und der Häufigkeit der aufgebrachten Belastung ab. Somit zyklischer hydrostatischen Druck (5 MPa) verringert den Einbau von Sulfat in der Chondrozyten - Monoschicht bei einer Frequenz von 0,05, 0,25 und 0,5 Hz, während bei Frequenzen oberhalb von 0,5 Hz Inklusion Sulfat in Knorpelexplantat zunimmt.

M. Bushmann et al. (1992) berichteten, dass Chondrozyten in einem Agarosegel die Biosynthese in Reaktion auf statische und dynamische mechanische Belastung in der gleichen Weise wie das kultivierte intakte Organ verändern. Die Autoren fanden heraus, dass die mechanische Belastung einen hyperosmotischen Stimulus erzeugt, gefolgt von einer Abnahme des pH-Wertes in den Chondrozyten.

Die Wirkung des mechanischen Dehnens kann an einer Kultur von Zellen untersucht werden, die in ein Gel eingetaucht sind. Die Dehnkraft kann mit einem computergesteuerten Vakuum erzeugt werden. Wenn sich das System in einem bestimmten Grad in einem Vakuum befindet, wird der Boden der Petrischale mit der Zellkultur um einen bestimmten Betrag verlängert, die Verformung ist an den Rändern des Bodens des Bechers maximal und ist in der Mitte minimal. Stretching wird übertragen und kultiviert in einer Petrischale von Chondrozyten. Mit Hilfe dieser Methode haben Holm-vall und Co-Autoren (1995) gezeigt, dass die Expression von mRNA von & agr; ₂ -Integrin in gezüchteten Kollagen (Typ II) Gel-Chondrosarkomzellen erhöht ist . A ₂ p _r Integrin zur Bindung an Kollagen Typ II fähig ist . Es wird als Mechanorezeptor betrachtet, da es mit Aktin-bindenden Proteinen interagiert und so die ECM mit dem Zytoskelett verbindet.

Einfluss des pH-Wertes auf den Chondrozyten-Metabolismus

Der pH-Wert der interstitiellen Flüssigkeit der ECM des Knorpelgewebes ist saurer als in anderen Geweben. A. Maroudas (1980) bestimmte den pH-Wert des Gelenkknorpels bei 6,9. W. Diamant und Koautoren (1966) fanden unter pathologischen Bedingungen einen pH-Wert von 5,5. Es ist bekannt, dass Chondrozyten bei niedrigem PO2 leben, was auf die wichtige Rolle der Glykolyse (95% des gesamten Glukosestoffwechsels) im Stoffwechsel dieser Zellen hinweist; Die Glykolyse wird von der Produktion einer großen Menge Milchsäure begleitet.

Neben der Ansäuerung der Umwelt durch die Glykolyseprodukte sind die Matrixkomponenten selbst von großer Bedeutung. Eine große Menge an fixierter negativer Ladung auf Proteoglykanen modifiziert die extrazelluläre Ionenzusammensetzung: eine hohe Konzentration an freien Kationen (zum Beispiel H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) und eine geringe Konzentration an Anionen (zum Beispiel O2, HCO3) werden notiert. Darüber hinaus wird unter dem Einfluss einer mechanischen Belastung Wasser aus der ECM ausgestoßen, was zu einer Erhöhung der Konzentration von fixierten negativen Ladungen und der Anziehung von mehr Kationen zu der Matrix führt. Dies geht einher mit einer Abnahme des pH-Wertes des extrazellulären Mediums, die den intrazellulären pH-Wert beeinflusst und dadurch den Metabolismus der Chondrozyten verändert. R. Wilkin und A. Hall (1995) untersuchten die Wirkung des pH-Wertes des extrazellulären und intrazellulären Mediums auf die Biosynthese der Matrix durch isolierte Bullenchondrozyten. Sie beobachteten eine doppelte Modifikation der Matrixsynthese mit einer Abnahme des pH-Wertes. Eine leichte Abnahme des pH-Wertes (7,4 35 S0 ₄ und ³ H-Prolin in Chondrozyten um 50% , während eine tiefere Ansäuerung des Mediums (pH <7,1) die Synthese um 75% im Vergleich zu Kontrolle. Die Erzeugung des gleichen niedrigen pH-Werts (6,65) mit Ammoniumionen verursachte eine Verringerung der Matrixsynthese um nur 20%. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Modifikation des pH-Werts des extrazellulären Matrixsynthesemediums nicht nur durch Änderungen des pH-Werts des intrazellulären Mediums erklärt werden kann. Darüber hinaus besitzt die Fähigkeit , die intrazelluläre Chondrozyten pH von Na zu regulieren ⁺, H ⁺ Austauscher, Ca ⁺ -abhängigen C1 ^_ -NSOZ -TRANSPORTE und H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Wirkung der Zusammensetzung des Mediums auf die Kultivierung auf den Stoffwechsel von Chondrozyten

Das Medium zur Kultivierung der Chondrocyten muss den experimentellen Bedingungen entsprechen. In den letzten Jahren wurde Kälberserum verwendet, um die Kulturbedingungen zu optimieren. Bei der Verwendung von Serum müssen jedoch einige wichtige Punkte berücksichtigt werden:

• externes Wachstum von Zellen aus der Peripherie von Gewebe in Organkulturen,
• die Variabilität der Zusammensetzung von Seren verschiedener Serien,
• Vorhandensein von unbekannten Komponenten in ihnen,
• erhöhtes Risiko von Interferenzen, Artefakte bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener biologischer Faktoren auf die metabolische Aktivität von Zellen.

Ein Beispiel für Letzteres ist die Untersuchung der Wirkung von EGF auf Knorpelchondrocyten bei Ratten. EGF stimulierte den Einbau von ³ H-Thymidin und einen Anstieg des DNA-Gehalts in der Kultur. Dieser Effekt war bei niedrigen Serumkonzentrationen (<1%) stärker ausgeprägt, bei hohen Konzentrationen (> 7,5%) verschwand der Effekt.

Es ist gut bekannt, dass die Niveaus der Synthese und des Abbaus von mit Kälberserum angereichertem DMEM im Vergleich zu in vivo-Bedingungen signifikant erhöht sind. Unterschiede zwischen in vivo und in vitro Metabolismus können durch Unterschiede zwischen der Synovialflüssigkeit und der Umgebung, in der die Zellen kultiviert werden, verursacht werden. D. Lee et al. (1997) kultivierten Chondrozyten junger Bullen in Agarose unter Verwendung eines Nährmediums, das DMEM enthielt, angereichert mit 20% Kälberserum und einer großen Menge normaler allogener Synovialflüssigkeit. Das Vorhandensein von Synovialflüssigkeit in dem Medium induzierte eine Erhöhung der Anzahl von Proteoglykanen, bis zu 80% der Gesamtmenge an Synovialflüssigkeit. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass Synovialflüssigkeit in Kultur eine metabolische Rate ähnlich der in vivo induziert , mit einem hohen Grad an Synthese von Glykosaminoglykanen und einem niedrigen Grad an Zellteilung.

G. Verbruggen et al (1995) zeigte , dass die Synthese von ³⁵ S-arrpeKaHa humanen kultivierten Chondrozyten in Agarose in DMEM ohne Serum 20-30% von der Höhe der Synthese in DMEM, ergänzt mit 10% Kälberserum beobachtet wurde. Die Autoren bestimmten das Ausmaß, in dem IGF-1, IGF-2, TGF-P oder Insulin die Produktion von Aggrecan in serumfreien Medien wiederherstellen. Die Autoren folgerten, dass 100 ng / ml Insulin, IGF-1 oder IGF-2 die Synthese von Aggrecan teilweise auf 39-53% des Kontrollspiegels reduzierten. Mit einer Kombination dieser Faktoren wurden keine synergistischen oder kumulativen Phänomene identifiziert. Zur gleichen Zeit stimulierten 10 ng / ml TGF-P in Gegenwart von 100 ng / ml Insulin die Synthese von Aggrecan bis zu 90% oder mehr vom Referenzwert. Schließlich beeinflußte Serumtransferrin allein oder in Kombination mit Insulin die Synthese von Aggrecan nicht. Wenn Kälberserum durch Rinderserumalbumin ersetzt wurde, war der Aggregatgehalt von Aggrecan signifikant verringert. Die Anreicherung des Mediums für die Insulinkultur, IGF oder TGF-P, stellte teilweise die Fähigkeit der Zellen zur Erzeugung von Aggrecan-Aggregaten wieder her. In diesem Fall können IGF-1 und Insulin die Homöostase in Zellkulturen aufrechterhalten. Nach 40 Tagen Kultur in Medium , das mit 10-20 ng / ml IGF-1, Proteoglykansynthese ergänzt wurde auf dem gleichen Niveau gehalten oder sogar noch höher im Vergleich mit Medium , das 20% Kälberserum enthält. Katabole Prozesse verliefen langsamer in einem mit IGF-1 angereicherten Medium als in einem Medium, das mit 0,1% Albuminlösung angereichert war, aber etwas schneller in einem Medium, das mit 20% Serum angereichert war. In langlebigen Kulturen behält 20 ng / ml IGF-1 einen stabilen Zustand von Zellen bei.

D. Lee et al (1993) verglichen , um die Wirkung der Zusammensetzung des Kulturmediums (DMEM, DMEM + 20% Kälberserum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) auf dem DNA - Synthese in einer Kultur von Explantat Knorpel-, Monoschichtkultur und in Suspension in Agarose . Bei Kultivierung in Agarose in Gegenwart von Serum beobachteten die Autoren eine Tendenz, Chondrocyten zu großen Clustern zu gruppieren. Zellen, die ohne Serum oder mit IGF-1 kultiviert wurden, wurden in einer runden Agarose gelagert, zu kleinen Gruppen zusammengestellt, bildeten jedoch keine großen Aggregate. In der Monoschicht war die Synthese von DNA in serumhaltigen Medien signifikant höher als in dem mit IGF-1 angereicherten Medium; Die Synthese von DNA in letzterem war viel höher als in der nicht-angereicherten Umgebung. Bei der Kultivierung von Chondrocyten in Suspension in Agarose in einem nicht angereicherten Medium und in Medien mit IGF-1 wurden keine Unterschiede in der DNA-Synthese beobachtet. Zur gleichen Zeit die Aufschlämmung Chondrozyten in Agarose in Medium , das mit Serum ergänzte Züchtung wurde durch eine erhöhte Inkorporation von Radionucleotid begleitet ³ H-Thymidin im Vergleich zu anderen Umgebungen.

Vitamin C ist für die Aktivierung von Enzymen notwendig, die an der Bildung einer stabilen Spiralstruktur von Kollagenfibrillen beteiligt sind. Chondrozyten, die in Bezug auf Ascorbinsäure defizient sind, synthetisieren unterhydroxylierte nicht-helikale Vorläufer von Kollagen, die langsam sezerniert werden. Die Einführung von Ascorbinsäure (50 & mgr; g / ml) verursacht eine Hydroxylierung der Collagenarten II und IX und ihre Sekretion in normalen Mengen. Die Zugabe von Vitamin C hatte keinen Einfluss auf das Niveau der Proteoglykan-Synthese. Folglich wird die Sekretion von Kollagen unabhängig von der Sekretion von Proteoglykanen reguliert.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]