Hämatopoetische Stammzellen

Hämatopoietische Stammzellen (HSCs) zeichnen sich wie mesenchymale Vorläuferzellen durch Multipotenz aus und führen zu Zelllinien, deren Endbestandteile die gebildeten Elemente des Blutes sowie eine Reihe spezialisierter Gewebezellen des Immunsystems bilden.

Die Hypothese von der Existenz eines gemeinsamen Vorläufers aller Blutzellen sowie der Begriff „Stammzelle“ selbst stammen von A. Maksimov (1909). Das Potenzial für die Bildung von Zellmasse in HSCs ist enorm – Knochenmarkstammzellen produzieren täglich 10 Zellen, die die gebildeten Elemente des peripheren Blutes bilden. Die Existenz hämatopoetischer Stammzellen wurde 1961 in Experimenten zur Wiederherstellung der Hämatopoese an Mäusen nachgewiesen, die einer tödlichen Dosis radioaktiver Strahlung ausgesetzt waren, die Knochenmarkstammzellen zerstört. Nach der Transplantation syngener Knochenmarkzellen in solche tödlich bestrahlten Tiere wurden in der Milz der Empfänger diskrete Hämatopoeseherde gefunden, deren Quelle einzelne klonogene Vorläuferzellen waren.

Dann wurde die Fähigkeit hämatopoetischer Stammzellen zur Selbsterhaltung nachgewiesen, die die Funktion der Hämatopoese im Prozess der Ontogenese sicherstellen. Im Prozess der embryonalen Entwicklung zeichnen sich HSCs durch eine hohe Migrationsaktivität aus, die für ihre Bewegung in die Zonen der Bildung hämatopoetischer Organe notwendig ist. Diese Eigenschaft von HSCs bleibt auch in der Ontogenese erhalten – durch ihre ständige Migration kommt es zu einer permanenten Erneuerung des Pools immunkompetenter Zellen. Die Fähigkeit von HSCs zur Migration, zum Durchdringen histohämatischer Barrieren, zur Einnistung in Gewebe und zum klonogenen Wachstum diente als Grundlage für die Transplantation von Knochenmarkszellen bei einer Reihe von Erkrankungen, die mit der Pathologie des hämatopoetischen Systems verbunden sind.

Wie alle Stammzellressourcen sind hämatopoetische Stammzellen in ihrer Nische (Knochenmark) nur in sehr geringen Mengen vorhanden, was ihre Isolierung erschwert. Immunphänotypisch sind humane HSCs als CD34+NK-Zellen charakterisiert, die in die Blutbahn wandern und die Organe des Immunsystems besiedeln oder das Knochenmarkstroma neu besiedeln können. Es ist klar, dass HSCs nicht die unreifsten Zellen des Knochenmarks sind, sondern aus Vorläuferzellen stammen, zu denen ruhende fibroblastenähnliche CD34-negative Zellen gehören. Es ist bekannt, dass Zellen mit dem CD34-Phänotyp in die Blutbahn gelangen können, wo sie ihren Phänotyp zu CD34+ verändern. Bei der Rückwanderung ins Knochenmark werden sie jedoch unter dem Einfluss der Mikroumgebung wieder zu CD34-negativen Stammzellelementen. Im Ruhezustand reagieren CD34~-Zellen nicht auf parakrine regulatorische Signale des Stromas (Wachstumsfaktoren, Zytokine). In Situationen, die eine erhöhte Intensität der Hämatopoese erfordern, reagieren Stammzellen mit dem CD34-Phänotyp auf Differenzierungssignale mit der Bildung sowohl hämatopoetischer als auch mesenchymaler Progenitorzellen. Die Hämatopoese erfolgt durch direkten Kontakt von HSCs mit zellulären Elementen des Knochenmarkstromas, repräsentiert durch ein komplexes Netzwerk aus Makrophagen, retikulären Endothelzellen, Osteoblasten, Stromafibroblasten und extrazellulärer Matrix. Die Stromabasis des Knochenmarks ist nicht nur Matrix oder „Skelett“ für hämatopoetisches Gewebe; sie übernimmt die Feinregulierung der Hämatopoese durch parakrine Regulationssignale von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen und sorgt zudem für die für die Bildung von Blutzellen notwendigen adhäsiven Interaktionen.

Das sich ständig erneuernde System der Hämatopoese basiert somit auf einer polypotenten (aus hämatopoetischer Sicht) hämatopoetischen Stammzelle, die zur langfristigen Selbsterhaltung fähig ist. Im Prozess der Bindung durchlaufen HSCs eine primäre Differenzierung und bilden Zellklone mit unterschiedlichen zytomorphologischen und immunphänotypischen Merkmalen. Die sequentielle Bildung primitiver und gebundener Vorläuferzellen endet mit der Bildung morphologisch identifizierbarer Vorläuferzellen verschiedener hämatopoetischer Linien. Das Ergebnis der nachfolgenden Stadien des komplexen mehrstufigen Prozesses der Hämatopoese ist die Reifung der Zellen und die Freisetzung reifer gebildeter Elemente – Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten und Thrombozyten – in das periphere Blut.

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Quellen hämatopoetischer Stammzellen

Hämatopoietische Stammzellen gelten als die am besten erforschte Stammzellquelle, was vor allem auf ihre klinische Verwendung bei Knochenmarktransplantationen zurückzuführen ist. Auf den ersten Blick ist ziemlich viel über diese Zellen bekannt. Bis zu einem gewissen Grad ist dies richtig, da intermediäre und reife Nachkommen von HSCs die am leichtesten zugänglichen Zellelemente sind, von denen jedes (Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen und Thrombozyten) auf allen Ebenen sorgfältig untersucht wurde – von der Licht- bis zur Elektronenmikroskopie, von biochemischen und immunphänotypischen Merkmalen bis zur Identifizierung durch PCR-Analysemethoden. Die Überwachung morphologischer, ultrastruktureller, biochemischer, immunphänotypischer, biophysikalischer und genomischer Parameter von HSCs hat jedoch keine Antworten auf viele problematische Fragen geliefert, deren Lösung für die Entwicklung der Zelltransplantation notwendig ist. Die Mechanismen der Stabilisierung hämatopoetischer Stammzellen im Ruhezustand, ihrer Aktivierung, ihres Eintritts in das Stadium der symmetrischen oder asymmetrischen Teilung und vor allem ihrer Verpflichtung zur Bildung funktionell unterschiedlich geformter Blutelemente wie Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten und Blutplättchen sind noch nicht geklärt.

Das Vorhandensein von Zellen mit dem Phänotyp CD34 im Knochenmark, die die Vorläufer sowohl mesenchymaler als auch hämatopoetischer Stammzellen sind, warf die Frage nach der Existenz der frühesten Vorläufer der Zelldifferenzierung in stromale und hämatopoetische Linien auf, die CD34-negativen Zellen nahestehen. Die sogenannten Langzeitkultur-initiierenden Zellen (LTC-IC) wurden mithilfe der Langzeitkultivierungsmethode gewonnen. Die Lebensdauer solcher Vorläuferzellen mit koloniebildender Aktivität auf der Stromabasis des Knochenmarks mit einer bestimmten Kombination von Wachstumsfaktoren beträgt mehr als 5 Wochen, während die Lebensfähigkeit von determinierten koloniebildenden Einheiten (CFU) in Kultur nur 3 Wochen beträgt. Derzeit gelten LTC-IC als funktionelles Analogon von HSCs, da bei hohem Repopulationspotenzial etwa 20 % der LTC-IC durch den Phänotyp CD34+CD38- charakterisiert sind und eine hohe Kapazität zur Selbsterneuerung aufweisen. Solche Zellen kommen im menschlichen Knochenmark mit einer Häufigkeit von 1:50.000 vor. Myeloide-lymphoide-initiierende Zellen, die unter Langzeitkultivierungsbedingungen (15 Wochen) gewonnen werden, sind den HSCs jedoch am nächsten. Solche Zellen, die als LTC bezeichnet werden, gehören zu den Zellen des menschlichen Knochenmarks und des Gehirns, sind zehnmal seltener als LTC-IC und bilden Zelllinien sowohl myeloider als auch lymphatischer hämatopoetischer Linien.

Obwohl die Markierung hämatopoetischer Stammzellen mit monoklonalen Antikörpern und die anschließende immunphänotypische Identifizierung die wichtigste Methode zur Erkennung und selektiven Sortierung hämatopoetischer Zellen mit Stammzellpotenzial ist, ist die klinische Anwendung der so isolierten HSCs begrenzt. Die Blockierung des CD34-Rezeptors oder anderer Markerantigene durch Antikörper während der immunpositiven Sortierung verändert zwangsläufig die Eigenschaften der mit ihrer Hilfe isolierten Zelle. Die immunnegative Isolierung von HSCs auf Magnetsäulen wird als vorteilhafter erachtet. In diesem Fall werden jedoch üblicherweise auf Metallträgern fixierte monoklonale Antikörper zur Sortierung verwendet. Wichtig ist zudem, dass beide Methoden der HSC-Isolierung eher auf phänotypischen als auf funktionellen Merkmalen basieren. Daher bevorzugen viele Forscher die Analyse klonogener Parameter von HSCs, die es ermöglicht, den Reifegrad und die Differenzierungsrichtung von Progenitorzellen anhand der Größe und Zusammensetzung der Kolonien zu bestimmen. Es ist bekannt, dass während des Bindungsprozesses die Anzahl und der Zelltyp der Kolonie in der Kolonie abnimmt. Die hämatopoetische Stammzelle und ihre frühe Tochterzelle, die sogenannte Granulozyten-Erythrozyten-Monozyten-Megakaryozyten-koloniebildende Einheit (CFU-GEMM), bilden in Kultur große multilineare Kolonien, die jeweils Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten enthalten. Die Granulozyten-Monozyten-koloniebildende Einheit (CFU-GM), die sich stromabwärts entlang der Commitment-Linie befindet, bildet Kolonien aus Granulozyten und Makrophagen, während die Granulozyten-koloniebildende Einheit (CFU-G) nur eine kleine Kolonie reifer Granulozyten bildet. Der frühe Erythrozytenvorläufer, die Burst-bildende Einheit der Erythrozyten (CFU-E), ist die Quelle großer Erythrozytenkolonien, und die reifere koloniebildende Einheit der Erythrozyten (CFU-E) ist die Quelle kleiner Erythrozytenkolonien. Wenn Zellen auf halbfesten Medien wachsen, können im Allgemeinen Zellen identifiziert werden, die sechs Typen myeloider Kolonien bilden: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E und CFU-E).

Allerdings enthält jedes Ausgangsmaterial zur Isolierung von HSZ neben hämatopoetischen Derivaten auch eine erhebliche Zahl begleitender Zellen. In diesem Zusammenhang ist zunächst eine vorläufige Reinigung des Transplantats von aktiven Zellen des Immunsystems des Spenders erforderlich. Gewöhnlich wird zu diesem Zweck eine Immunselektion verwendet, die auf der Expression spezifischer Antigene durch Lymphozyten beruht und deren Isolierung und Entfernung mittels monoklonaler Antikörper ermöglicht. Zudem wurde eine Immunosettenmethode zur T-Lymphozyten-Depletion von Knochenmarktransplantaten entwickelt, die auf der Bildung von Komplexen aus CD4+-Lymphozyten und spezifischen monoklonalen Antikörpern beruht, die mittels Apherese wirksam entfernt werden. Diese Methode gewährleistet die Produktion von gereinigtem Zellmaterial mit einem Gehalt an hämatopoetischen Stammzellen von 40 – 60 %.

Eine Erhöhung der Anzahl der Vorläuferzellen durch die Entfernung reifer Blutbestandteile aus dem Leukaphereseprodukt wird durch Gegenstromzentrifugation und anschließende Filtration (in Gegenwart eines Chelatbildners – Trinatriumcitrat) durch Säulen mit Nylonfasern, die mit menschlichem Immunglobulin beschichtet sind, erreicht. Die sequentielle Anwendung dieser beiden Methoden gewährleistet eine vollständige Reinigung des Transplantats von Thrombozyten, 89 % von Erythrozyten und 91 % von Leukozyten. Durch einen deutlich verringerten Verlust an HSCs kann der Anteil der CD34+-Zellen an der Gesamtzellmasse auf bis zu 50 % erhöht werden.

Die Fähigkeit der isolierten hämatopoetischen Stammzellen, in der Kultur Kolonien reifer Blutzellen zu bilden, wird zur funktionellen Charakterisierung der Zellen genutzt. Durch die Analyse der gebildeten Kolonien können die Arten der Vorläuferzellen identifiziert und quantifiziert werden, der Grad ihrer Bindung und die Richtung ihrer Differenzierung bestimmt werden. Die klonogene Aktivität wird in halbfesten Medien auf Methylcellulose, Agar, Plasma oder Fibringel bestimmt, die die Migrationsaktivität der Zellen reduzieren und ihre Anhaftung an Glas- oder Kunststoffoberflächen verhindern. Unter optimalen Kultivierungsbedingungen entwickeln sich aus einer einzelnen Zelle in 7 bis 18 Tagen Klone. Wenn ein Klon weniger als 50 Zellen enthält, wird er als einzelner Cluster identifiziert; wenn die Anzahl der Zellen 50 übersteigt, wird er als Kolonie identifiziert. Berücksichtigt wird die Anzahl der Zellen, die eine Kolonie bilden können (koloniebildende Einheiten – CFU oder koloniebildende Zellen – COC). Es ist zu beachten, dass die Parameter CFU und COC nicht der Anzahl der HSCs in der Zellsuspension entsprechen, obwohl sie mit dieser korrelieren, was erneut die Notwendigkeit unterstreicht, die funktionelle (koloniebildende) Aktivität von HSCs in vitro zu bestimmen.

Unter den Knochenmarkszellen haben hämatopoetische Stammzellen das höchste proliferative Potenzial, weshalb sie in Kultur die größten Kolonien bilden. Die Anzahl solcher Kolonien soll indirekt die Anzahl der Stammzellen bestimmen. Nach der Bildung von Kolonien in vitro mit einem Durchmesser von mehr als 0,5 mm und einer Zellzahl von über 1000 testeten die Autoren diese Zellen auf Resistenz gegen subletale Dosen von 5-Fluorouracil und untersuchten ihre Fähigkeit, das Knochenmark tödlich bestrahlter Tiere wieder zu besiedeln. Gemäß den angegebenen Parametern waren die isolierten Zellen kaum von HSCs zu unterscheiden und erhielten das Abkürzungssymbol HPP-CFC – koloniebildende Zellen mit hohem proliferativen Potenzial.

Die Suche nach einer qualitativ besseren Isolierung hämatopoetischer Stammzellen geht weiter. Hämatopoietische Stammzellen ähneln jedoch morphologisch Lymphozyten und stellen eine relativ homogene Zellgruppe mit nahezu runden Kernen, fein verteiltem Chromatin und einer geringen Menge schwach basophilen Zytoplasmas dar. Ihre genaue Anzahl ist ebenfalls schwer zu bestimmen. Man geht davon aus, dass HSCs im menschlichen Knochenmark mit einer Häufigkeit von 1 pro 106 kernhaltigen Zellen vorkommen.

Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen

Um die Qualität der Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen zu verbessern, wird eine sequentielle oder simultane (auf einem Mehrkanalsortierer) Untersuchung des Spektrums membrangebundener Antigene durchgeführt, und in HSCs sollte der CD34+CD38-Phänotyp mit dem Fehlen linearer Differenzierungsmarker kombiniert werden, insbesondere Antigenen immunkompetenter Zellen wie CD4, Oberflächenimmunglobulinen und Glykophorin.

Fast alle Phänotypisierungsschemata hämatopoetischer Stammzellen beinhalten die Bestimmung des CD34-Antigens. Dieses Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 110 kDa, das mehrere Glykosylierungsstellen trägt, wird nach Aktivierung des entsprechenden Gens auf Chromosom 1 auf der Plasmazellmembran exprimiert. Die Funktion des CD34-Moleküls ist mit der L-Selektin-vermittelten Interaktion früher hämatopoetischer Vorläuferzellen mit der Stromabasis des Knochenmarks verbunden. Es ist jedoch zu beachten, dass das Vorhandensein des CD34-Antigens auf der Zelloberfläche nur eine vorläufige Beurteilung des HSC-Gehalts in der Zellsuspension zulässt, da es auch von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen sowie von Knochenmarkstromazellen und Endothelzellen exprimiert wird.

Während der Differenzierung hämatopoetischer Progenitorzellen ist die CD34-Expression dauerhaft reduziert. Erythrozyten, Granulozyten und monozytäre Progenitorzellen exprimieren das CD34-Antigen entweder schwach oder gar nicht auf ihrer Oberfläche (CD34-Phänotyp). Auf der Oberflächenmembran differenzierter Knochenmarkszellen und reifer Blutzellen ist CD34-Antigen nicht nachweisbar.

Es ist zu beachten, dass in der Differenzierungsdynamik hämatopoetischer Vorläuferzellen nicht nur der Grad der CD34-Expression abnimmt, sondern auch die Expression des Antigens CD38, eines integralen Membranglykoproteins mit einem Molekulargewicht von 46 kDa, das über NAD-Glykohydrolase- und ADP-Ribosylcyclase-Aktivität verfügt, progressiv zunimmt, was auf seine Beteiligung am Transport und an der Synthese von ADP-Ribose hindeutet. Somit ergibt sich die Möglichkeit einer doppelten Kontrolle des Engagements hämatopoetischer Vorläuferzellen. Die Population von Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38+, die 90 bis 99 % der CD34-positiven Knochenmarkszellen ausmacht, enthält Vorläuferzellen mit begrenztem proliferativen und differenzierenden Potenzial, während Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38 die Rolle von HSC für sich beanspruchen können.

Tatsächlich enthält die durch die Formel CD34+CD38- beschriebene Knochenmarkzellpopulation eine relativ große Anzahl primitiver Stammzellen, die sich in myeloide und lymphatische Richtung differenzieren können. Unter Bedingungen der Langzeitkultivierung von Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38- ist es möglich, alle reifen Blutbestandteile zu gewinnen: Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten, Megakaryozyten, Erythrozyten und Lymphozyten.

Vor relativ kurzer Zeit wurde festgestellt, dass CD34-positive Zellen zwei weitere Marker exprimieren, AC133 und CD90 (Thy-1), die ebenfalls zur Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen verwendet werden. Das Thy-1-Antigen wird zusammen mit dem CD117-Rezeptor (c-kit) auf CD34+-Zellen des Knochenmarks, der Nabelschnur und des peripheren Blutes exprimiert. Es handelt sich um ein oberflächliches Phosphatidylinositol-bindendes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 25–35 kDa, das an Zelladhäsionsprozessen beteiligt ist. Einige Autoren glauben, dass das Thy-1-Antigen ein Marker der unreifsten CD34-positiven Zellen ist. Selbstreproduzierende Zellen mit dem Phänotyp CD34+Thy-1+ führen zu langfristig kultivierten Linien mit der Bildung von Tochterzellen. Es wird angenommen, dass das Thy-1-Antigen regulatorische Signale blockiert, die einen Zellteilungsstopp verursachen. Obwohl CD34+Thy1+-Zellen zur Selbstreproduktion und zur Bildung langfristig kultivierter Linien fähig sind, kann ihr Phänotyp nicht ausschließlich HSCs zugeschrieben werden, da der Gehalt an Thy-1+ in der Gesamtmasse der CD34-positiven Zellelemente etwa 50 % beträgt und damit die Anzahl der hämatopoetischen Zellen deutlich übersteigt.

Als vielversprechender für die Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen dürfte AC133 gelten – ein Antigenmarker hämatopoetischer Vorläuferzellen, dessen Expression erstmals auf embryonalen Leberzellen nachgewiesen wurde. AC133 ist ein transmembranäres Glykoprotein, das in den frühesten Stadien der HSC-Reifung auf der Oberfläche der Zellmembran erscheint – möglicherweise sogar früher als das CD34-Antigen. Studien von A. Petrenko und V. Grishchenko (2003) zeigten, dass AC133 von bis zu 30 % der CD34-positiven embryonalen Leberzellen exprimiert wird.

Somit besteht das ideale phänotypische Profil hämatopoetischer Stammzellen gemäß aktuellen Konzepten aus einem Zellumriss, dessen Konturen Konfigurationen der Antigene CD34, AC133 und Thy-1 umfassen sollten, für die molekularen Projektionen von CD38, HLA-DR und den linearen Differenzierungsmarkern GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 jedoch kein Platz ist.

Eine Variante des phänotypischen Porträts von HSCs kann die Kombination CD34+CD45RalowCD71low sein, da sich die Eigenschaften der durch diese Formel beschriebenen Zellen nicht von den funktionellen Parametern von Zellen mit dem Phänotyp CD34+CD38 unterscheiden. Darüber hinaus können menschliche HSCs durch die phänotypischen Merkmale CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit /low identifiziert werden – nur 30 solcher Zellen stellen die Hämatopoese bei tödlich bestrahlten Mäusen vollständig wieder her.

Die 40-jährige intensive Forschung an HSCs, die sowohl zur Selbstreproduktion als auch zur Differenzierung in andere Zellelemente fähig sind, begann mit der Analyse der allgemeinen phänotypischen Eigenschaften von Knochenmarkszellen, die den Einsatz von Knochenmarkstransplantationen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen des hämatopoetischen Systems rechtfertigten. Später entdeckte neue Stammzelltypen haben in der klinischen Praxis noch keine breite Anwendung gefunden. Gleichzeitig können Stammzellen aus Nabelschnurblut und embryonaler Leber den Umfang der Zelltransplantation nicht nur in der Hämatologie, sondern auch in anderen Bereichen der Medizin deutlich erweitern, da sie sich sowohl quantitativ als auch qualitativ von Knochenmarks-HSCs unterscheiden.

Das für eine Transplantation benötigte Volumen an hämatopoetischer Stammzellmasse wird üblicherweise aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut und embryonaler Leber gewonnen. Darüber hinaus können hämatopoetische Vorläuferzellen in vitro durch Vermehrung von embryonalen Stammzellen und deren anschließende gezielte Differenzierung in hämatopoetische Zellelemente gewonnen werden. A. Petrenko und V. Grishchenko (2003) weisen zu Recht auf signifikante Unterschiede in den immunologischen Eigenschaften und der Fähigkeit zur Wiederherstellung der Hämatopoese von Stammzellen unterschiedlicher Herkunft hin, was auf das ungleiche Verhältnis früh pluripotenter und spät determinierter Vorläuferzellen in ihren Quellen zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeichnen sich hämatopoetische Stammzellen aus verschiedenen Stammzellenquellen durch quantitativ und qualitativ völlig unterschiedliche Assoziationen nicht-hämatopoetischer Zellen aus.

Knochenmark ist bereits eine traditionelle Quelle für hämatopoetische Stammzellen. Eine Knochenmarkzellsuspension wird durch Waschen unter örtlicher Betäubung aus dem Darmbein oder Brustbein gewonnen. Die so gewonnene Suspension ist heterogen und enthält eine Mischung aus HSCs, Stromazellelementen, determinierten Progenitorzellen myeloider und lymphatischer Linien sowie reif geformten Blutelementen. Die Anzahl der Zellen mit den Phänotypen CD34+ und CD34+CD38 unter den mononukleären Knochenmarkzellen beträgt 0,5–3,6 % bzw. 0–0,5 %. Peripheres Blut nach G-CSF-induzierter Mobilisierung von HSCs enthält 0,4–1,6 % CD34+ und 0–0,4 % CD34+CD38.

Der Prozentsatz der Zellen mit den Immunphänotypen CD34+CD38 und CD34+ ist im Nabelschnurblut höher – 0–0,6 und 1–2,6 %, und ihre maximale Anzahl wird unter den hämatopoetischen Zellen der embryonalen Leber nachgewiesen – 0,2–12,5 bzw. 2,3–35,8 %.

Die Qualität des transplantierten Materials hängt jedoch nicht nur von der Anzahl der darin enthaltenen CD34+-Zellen ab, sondern auch von ihrer funktionellen Aktivität, die sich anhand des Ausmaßes der Koloniebildung in vivo (Knochenmarksneubildung bei tödlich bestrahlten Tieren) und in vitro – durch Koloniewachstum auf halbflüssigen Medien – beurteilen lässt. Es stellte sich heraus, dass die koloniebildende und proliferative Aktivität hämatopoetischer Vorläuferzellen mit dem HLA-DR-Phänotyp CD34+CD38, die aus der embryonalen Leber, dem fetalen Knochenmark und dem Nabelschnurblut isoliert wurden, das proliferative und koloniebildende Potenzial hämatopoetischer Zellen des Knochenmarks und des peripheren Bluts eines Erwachsenen deutlich übersteigt. Die quantitative und qualitative Analyse von HSCs unterschiedlicher Herkunft ergab signifikante Unterschiede sowohl hinsichtlich ihres relativen Gehalts in der Zellsuspension als auch hinsichtlich ihrer funktionellen Fähigkeiten. Die maximale Anzahl an CD34+-Zellen (24,6 %) wurde im transplantierten Material gefunden, das aus fetalem Knochenmark gewonnen wurde. Das Knochenmark eines Erwachsenen enthält 2,1 % CD34-positive Zellelemente. Unter den mononukleären Zellen des peripheren Bluts eines Erwachsenen weisen nur 0,5 % den CD34+-Phänotyp auf, während ihre Zahl im Nabelschnurblut 2 % erreicht. Gleichzeitig ist die Koloniebildungskapazität von CD34+-Zellen des fetalen Knochenmarks 2,7-mal höher als die klonale Wachstumskapazität hämatopoetischer Knochenmarkszellen eines Erwachsenen, und Nabelschnurblutzellen bilden deutlich mehr Kolonien als hämatopoetische Elemente, die aus dem peripheren Blut von Erwachsenen isoliert wurden: 65,5 bzw. 40,8 Kolonien/105 Zellen.

Unterschiede in der proliferativen Aktivität und dem Koloniebildungsvermögen hämatopoetischer Stammzellen hängen nicht nur mit ihrem unterschiedlichen Reifegrad, sondern auch mit ihrem natürlichen Mikromilieu zusammen. Es ist bekannt, dass die Proliferationsintensität und die Differenzierungsrate von Stammzellen durch die integrale regulatorische Wirkung eines Mehrkomponentensystems von Wachstumsfaktoren und Zytokinen bestimmt werden, die sowohl von den Stammzellen selbst als auch von den zellulären Elementen ihres Matrix-Stroma-Mikromilieus produziert werden. Die Verwendung gereinigter Zellpopulationen und serumfreier Medien für die Zellkultivierung ermöglichte die Charakterisierung von Wachstumsfaktoren, die stimulierend und hemmend auf Stammzellen unterschiedlichen Entwicklungsniveaus, Progenitorzellen und linear ausgerichtete Zellen wirken. Die Ergebnisse der Studien zeigen überzeugend, dass sich HSCs aus Quellen mit unterschiedlichem Entwicklungsstand sowohl phänotypisch als auch funktionell unterscheiden. HSCs in früheren Stadien der Ontogenese zeichnen sich durch ein hohes Selbstreproduktionspotenzial und eine hohe proliferative Aktivität aus. Solche Zellen zeichnen sich durch längere Telomere aus und durchlaufen eine Verpflichtung, alle hämatopoetischen Zelllinien zu bilden. Die Reaktion des Immunsystems auf HSCs embryonalen Ursprungs ist verzögert, da solche Zellen nur schwach HLA-Moleküle exprimieren. Es gibt eine klare Abstufung des relativen Gehalts an HSCs, ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit und der Anzahl der Arten von Verpflichtungslinien, die sie bilden: CD34+-Zellen der embryonalen Leber > CD34+-Zellen des Nabelschnurbluts > CD34+-Zellen des Knochenmarks. Es ist wichtig, dass solche Unterschiede nicht nur den intra-, neo- und frühen postanatalen Phasen der menschlichen Entwicklung innewohnen, sondern auch der gesamten Ontogenese – die proliferative und koloniebildende Aktivität von HSCs, die aus dem Knochenmark oder peripheren Blut eines Erwachsenen gewonnen werden, ist umgekehrt proportional zum Alter des Spenders.