Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-Analyse

Der weit verbreitete Einsatz verschiedener Restriktionsendonukleasen zur Analyse chromosomaler DNA hat die enorme Variabilität des menschlichen Genoms offenbart. Schon kleine Veränderungen in den kodierenden und regulatorischen Regionen von Strukturgenen können zum Stopp der Synthese eines bestimmten Proteins oder zum Verlust seiner Funktion im menschlichen Körper führen, was sich in der Regel auf den Phänotyp des Patienten auswirkt. Etwa 90 % des menschlichen Genoms bestehen jedoch aus nichtkodierenden Sequenzen, die variabler sind und viele sogenannte neutrale Mutationen oder Polymorphismen enthalten und keine phänotypische Expression aufweisen. Solche polymorphen Regionen (Loci) werden in der Diagnose von Erbkrankheiten als genetische Marker verwendet. Polymorphe Loci sind in allen Chromosomen vorhanden und mit einer bestimmten Region des Gens verknüpft. Durch die Bestimmung der Lokalisation eines polymorphen Locus lässt sich feststellen, welches Gen mit der Mutation assoziiert ist, die die Krankheit beim Patienten verursacht hat.

Zur Isolierung polymorpher DNA-Regionen werden bakterielle Enzyme verwendet – Restriktionsenzyme, deren Produkt Restriktionsstellen sind. Spontane Mutationen an polymorphen Stellen machen diese resistent oder umgekehrt empfindlich gegenüber der Wirkung einer bestimmten Restriktionsase.

Mutationsvariabilität von Restriktionsschnittstellen kann durch Längenänderungen von Restriktionsfragmenten der DNA erkannt werden, indem diese mittels Elektrophorese und anschließender Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden getrennt werden. Liegt an einer polymorphen Stelle keine Restriktion vor, lässt sich auf Elektrophorese ein großes Fragment nachweisen, und wenn eine Restriktion vorhanden ist, ist ein kleineres Fragment vorhanden. Das Vorhandensein oder Fehlen einer Restriktionsstelle an identischen Loci homologer Chromosomen ermöglicht eine relativ zuverlässige Markierung des mutierten und des normalen Gens und die Verfolgung seiner Weitergabe an die Nachkommen. Untersucht man daher die DNA von Patienten, bei denen in beiden Chromosomen eine Restriktionsstelle in einer polymorphen Region vorhanden ist, lassen sich auf dem Elektrophoresegramm kurze DNA-Fragmente nachweisen. Bei Patienten, die homozygot für eine Mutation sind, die die polymorphe Restriktionsstelle verändert, werden längere Fragmente nachgewiesen, und bei heterozygoten Patienten kurze und lange Fragmente.

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