Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

Die breite Verwendung verschiedener Restriktionsendonukleasen für die Analyse von chromosomaler DNA zeigte eine große Variabilität im menschlichen Genom. Bereits kleine Veränderungen in den kodierenden und regulatorischen Regionen von Strukturgenen können zur Beendigung der Synthese eines bestimmten Proteins oder zum Verlust seiner Funktion im menschlichen Körper führen, was normalerweise den Phänotyp des Patienten beeinflusst. Jedoch bestehen ungefähr 90% des menschlichen Genoms aus nicht-codierenden Sequenzen, die variabler sind und viele sogenannte neutrale Mutationen oder Polymorphismen enthalten und keine phänotypische Expression aufweisen. Solche polymorphen Stellen (loci) werden bei der Diagnose von Erbkrankheiten als genetische Marker verwendet. Polymorphe Loci sind in allen Chromosomen vorhanden und sind mit einer spezifischen Region des Gens verbunden. Nachdem die Lokalisierung des polymorphen Locus bestimmt wurde, ist es möglich, festzustellen, mit welchem Genom eine Mutation assoziiert ist, die die Krankheit in dem Patienten verursacht hat.

Um polymorphe Regionen der DNA zu isolieren, werden bakterielle Enzyme verwendet - Restriktionsenzyme, deren Produkt Restriktionsstellen sind. Spontane Mutationen, die an polymorphen Stellen auftreten, machen sie resistent oder umgekehrt empfindlich für die Wirkung eines spezifischen Restriktionsenzyms.

Mutationsvariabilität in Restriktionsstellen kann nachgewiesen werden, indem die Länge der beschränkten DNA-Fragmente verändert wird, indem sie unter Verwendung von Elektrophorese und anschließender Hybridisierung mit spezifischen DNA-Sonden getrennt werden. In Abwesenheit einer Restriktion in einer polymorphen Stelle wird ein großes Fragment in den Elektrophoresegrammen nachgewiesen, und falls vorhanden, wird ein kleineres Fragment vorhanden sein. Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Restriktionsstelle in den identischen Loci von homologen Chromosomen ermöglicht es, die Mutante und das normale Gen zuverlässig zu markieren und ihre Übertragung auf die Nachkommen zu verfolgen. So werden bei der Untersuchung der DNA von Patienten, in deren beiden Chromosomen eine Restriktionsstelle in der polymorphen Region vorliegt, kurze DNA-Fragmente auf dem Elektrophorese-Diagramm offenbart. Bei Patienten, die homozygot sind für eine Mutation, die eine polymorphe Restriktionsstelle modifiziert, werden Fragmente längerer Länge nachgewiesen, und in heterozygoten Fragmenten werden kurze und lange Fragmente nachgewiesen.

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