Die Rolle von Enzymen und Zytokinen in der Pathogenese von Osteoarthritis

In den letzten Jahren hat sich ein großer Teil der Forschung auf die Identifizierung von Proteasen konzentriert, die für den Abbau von ECM von Gelenkknorpel bei Osteoarthritis verantwortlich sind. Nach modernen Vorstellungen spielen Matrix-Metalloproteasen (MMP) eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Osteoarthrose. Patienten mit Osteoarthritis haben eine erhöhte Konzentration von drei Vertretern von MMP - Kollagenasen, Stromelysinen und Gelatinasen. Kollagenase ist verantwortlich für den Abbau von nativem Kollagen, Stromelysin - Kollagen Typ IV, Laminin und Proteoglykane, azhelatinaza - für den Abbau von Gelatine, Kollagen IV, Vh XI Typen Elastin. Ferner nimmt die Existenz eines anderen Enzyms - Aggrecanase die MMP Eigenschaften hat und für die Proteolyse von Knorpel Proteoglykan-Aggregate verantwortlich.

Der Gelenkknorpel von humanen Kollagenasen identifizierte drei Typen von Ebenen , die in Patienten erhöht sind mit Osteoarthritis - Kollagenase-1 (MMP-1), Kollagenase-2 (MMP-8), Kollagenase-3 (MMP-13). Die Koexistenz von drei verschiedenen Arten von Kollagenasen im Gelenkknorpel weist darauf hin, dass jeder von ihnen seine spezifische Rolle spielt. Tatsächlich ist die Kollagenase-1 und -2 sind vor allem in der oberflächlichen und der oberen Mittelzone des Gelenkknorpels lokalisiert, während Kollagenase-3 ist in der Unterseite der mittleren und tiefen Zonen gefunden. Darüber hinaus haben die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen gezeigt , dass während der Progression von Osteoarthritis Niveau von Kollagenase-3 ein Plateau erreicht oder sogar abnimmt, während das Niveau der Kollagenase-1 allmählich erhöht wird. Es gibt Hinweise darauf , dass bei Arthrose Kollagenase-1 im Entzündungsprozess im Gelenkknorpel hauptsächlich beteiligt ist, während Kollagenase-3 - in Gewebeumbau. Cartilagin-3, exprimiert im Knorpel von Patienten mit OA, baut Typ-II-Collagen intensiver ab als Collagenase-1.

Der Vertreter der zweiten Gruppe Metalloproteasen Menschliche stromelizinovu als drei aufgezeigten - Stromelysin-1 (MMP-3), Stromelysin-2 (MMP-10) und Stromelysin-3 (MMP-11). Heute ist bekannt, dass nur Stromelysin-1 am pathologischen Prozess der Osteoarthritis beteiligt ist. In der Synovialmembran von Patienten mit Osteoarthritis nicht Stromelysin-2 bestimmt, aber es wird in sehr geringen Mengen in synovialen Fibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis gefunden. Stromelysin-3 findet sich auch in der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis in der Nähe der Fibroblasten, insbesondere in Fibrosezonen.

In der Gelatinasgruppe wurden nur zwei im menschlichen Knorpelgewebe identifiziert: 92 kD Gelatinase (Gelatinase B oder MMP-9) und Gelatine bei 72 kD (Gelatinase A oder MMP-2); Bei Patienten mit Osteoarthritis wird eine Erhöhung der 92 kD-Gelatinase festgestellt.

Vor nicht allzu langer Zeit wurde eine weitere Gruppe von MMPs identifiziert, die auf der Oberfläche von Zellmembranen lokalisiert sind und als MMP-Membrantyp (MMP-MT) bezeichnet werden. Zu dieser Gruppe gehören vier Enzyme - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT-Expression findet sich im menschlichen Gelenkknorpel. Obwohl MMP-MT-1 die Eigenschaften von Kollagenase besitzt, sind sowohl MMP-MT-1 als auch MMP-MT-2 in der Lage, Gelatinase-72 kD und Kollagenase-3 zu aktivieren. Die Rolle dieser Gruppe von MMP in der Pathogenese von OA erfordert Verfeinerung.

Proteinasen werden in Form eines Zymogens sekretiert, das durch andere Proteinasen oder organische Verbindungen von Quecksilber aktiviert wird. Die katalytische Aktivität von MMP hängt von der Anwesenheit von Zink in der aktiven Zone des Enzyms ab.

Die biologische Aktivität von MMP wird durch spezifische TIMPs kontrolliert. Bis heute wurden drei Arten von TIMP identifiziert, die in menschlichen Gelenkgeweben, TIMP-1-TIMP-3, gefunden werden. Der vierte Typ von TIMP wird identifiziert und kloniert, aber er wurde noch nicht in menschlichen artikulären Geweben nachgewiesen. Diese Moleküle binden spezifisch an die aktive Stelle von MMP, obwohl einige von ihnen in der Lage sind, das aktive Zentrum von Pro-Gelatinase 72 kD (TIMP-2, -3, -4) und 92 kD Gelatinase (TIMP-1 und -3) zu binden. Die Daten zeigen, dass bei OA im Gelenkknorpel ein Ungleichgewicht zwischen MMP und TIMP besteht, was zu einem relativen Mangel an Inhibitoren führt, was teilweise auf eine Erhöhung des Spiegels an aktiver MMP im Gewebe zurückzuführen sein kann. TIMP-1 und -2 werden im Gelenkknorpel gefunden, sie werden von Chondrozyten synthetisiert. Bei Osteoarthritis in Synovialmembran und Synovialflüssigkeit wurde nur die erste Art von TIMP nachgewiesen. TIMP-3 wird ausschließlich im ECM erkannt. TIMP-4 hat eine identische Aminosäuresequenz mit TIMP-2 und -ZIN von fast 38% -STIMP-1. In anderen Zielzellen ist TIMP-4 für die Modulation der Aktivierung von 72 kD-Progestogenase auf der Zelloberfläche verantwortlich, was eine wichtige Rolle als gewebespezifischer Regulator des ECM-Remodellings anzeigt.

Ein anderer Mechanismus zur Kontrolle der biologischen Aktivität von MMP ist ihre physiologische Aktivierung. Es wird angenommen, dass Enzyme aus der Familie der Serin- und Cysteinproteasen, wie AP / Plasmin bzw. Cathepsin B, physiologische Aktivatoren von MMP sind. Im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis wurde ein erhöhter Urokinase (UAP) - und Plasminspiegel festgestellt.

Trotz der Tatsache, dass verschiedene Arten von Cathepsinen in den Gelenkgeweben gefunden werden, wird Cathepsin-B als der wahrscheinlichste Aktivator von MMP in Knorpel angesehen. In den Geweben des menschlichen Gelenks wurden physiologische Inhibitoren von Serin- und Cysteinproteasen nachgewiesen. Die Aktivität des Inhibitors AP-1 (IAP-1) sowie Cysteinproteasen ist bei Patienten mit Osteoarthritis reduziert. Ähnlich wie bei MMP / TIMP ist es das Ungleichgewicht zwischen Serin- und Cysteinproteasen und deren Inhibitoren, die die erhöhte MMP-Aktivität im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis erklären können. Außerdem können sich MMPs gegenseitig aktivieren. Zum Beispiel aktiviert Stromelysin-1 Kollagenase-1, Kollagenase-3 und Gelatinase 92 kD; Collagenase-3 aktiviert 92 kD-Gelatinase; MMP-MT aktiviert Collagenase-3, und Gelatinase-72 kD potenziert diese Aktivierung; MMP-MT aktiviert auch 72 kD-Gelatinase. Zytokine lassen sich in drei Gruppen einteilen: destruktive (proinflammatorische), regulatorische (einschließlich entzündungshemmende) und anabole (Wachstumsfaktoren).

Zytokintypen (nach van den Berg WB et al)

Zerstörerisch	Interleukin-1 TNF-a Leukämischer Hemmfaktor Interleukin-17
Regulatorisch	Interlekin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzym-Inhibitoren
Anabole	Msulin-ähnliche Wachstumsfaktoren TGF-b Knochenmorphogenetische Proteine Morphogenetische Proteine aus Knorpel

Destructive Cytokinen, insbesondere IL-1 Erhöhung der Freisetzung von Proteasen hemmt induziert und die Synthese von Proteoglycanen und Kollagenen Chondrozyten. Regulatory Cytokines, insbesondere IL-4 und -10 hemmt die Produktion von IL-1 - Rezeptor - Antagonisten, zur Erhöhung der Produktion von IL-1 (IL-1 RA), und verringert den Pegel und die NO-Synthase - Aktivität in Chondrozyten. Somit antagonisiert IL-4 IL-1 in drei Arten: 1) reduziert die Produktion und verhindert seine Wirkungen, 2) erhöht die Produktion von basic „Scavenger“ IL-1 Pa und 3) reduziert die Produktion von primären sekundären „messenger» NO. Darüber hinaus reduziert IL-4 den enzymatischen Gewebeabbau. In vivo-Bedingungen wird die optimale therapeutische Wirkung mit der Kombination von IL-4 und IL-10 erreicht. Anabolische Faktoren, wie kakTFR-p, und IGF-1, nicht wirklich mit der Produktion oder Wirkung von IL-1 stören, aber der entgegengesetzten Aktivität zeigen, zum Beispiel stimulieren die Synthese von Proteoglycan und Kollagen inhibieren Protease - Aktivität und TGF (3, hemmt auch die Freisetzung von Enzymen und stimuliert ihre Hemmstoffe.

Proinflammatorische Zytokine sind für die erhöhte Synthese und Expression von MMP in den Gelenkgeweben verantwortlich. Sie werden in der Synovialmembran synthetisiert und diffundieren dann durch die Synovialflüssigkeit in den Gelenkknorpel. Proinflammatorische Zytokine aktivieren Chondrozyten, die wiederum auch proinflammatorische Zytokine produzieren können. In den Gelenken, die von der Osteoarthrose betroffen sind, spielt die Rolle des Effektors der Entzündung hauptsächlich die Zellen der Synovialmembran. Es ist die Synovitis vom Makrophagen-Typ, die Proteasen und Entzündungsmediatoren sezerniert. Unter ihnen sind in der Pathogenese von Osteoarthritis IL-f, TNF-a, IL-6, leukämischer inhibitorischer Faktor (LIF) und IL-17 am stärksten beteiligt.

Biologisch aktive Substanzen, die den Gelenkknorpelabbau bei Osteoarthritis stimulieren

• Interleukin-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Kolonie-stimulierende Faktoren: Makrophagen (Monozyten) und Granulozyten-Makrophagen
• Substanz P
• PGE ₂
• Aktivatoren von Plasminogen (Gewebe- und Urokinase-Typen) und Plasmin
• Metalloproteasen (Kollagenasen, Ellastasen, Stromelysine)
• Kathepsin A und B
• Thriller
• Bakterielle Lipopolysaccharide
• Phospholipase Ag

Die Literaturdaten zeigen, dass IL-ip und möglicherweise TNF-a die Hauptmediatoren der Zerstörung von Gelenkgewebe bei Osteoarthritis sind. Es ist jedoch immer noch nicht bekannt, ob sie unabhängig voneinander arbeiten oder ob es eine funktionale Hierarchie zwischen ihnen gibt. An Modellen der Osteoarthrose bei Tieren wurde gezeigt, dass die Blockade von IL-1 die Zerstörung von Gelenkknorpel wirksam verhindert, wohingegen die Blockade von TNF-α nur zu einer Verringerung der Entzündung in den Geweben des Gelenks führt. In der Synovialmembran, Synovialflüssigkeit und Knorpel der Patienten wurden erhöhte Konzentrationen beider Zytokine nachgewiesen. Die Chondrozyten sind in der Lage , die Synthese von nicht nur Proteasen (MMPs und vor allem AP) aber auch kleineren Kollagene wie Typ I und III, sowie reduziert die Synthese von Kollagen Typ II und IX und Proteoglykane zu erhöhen. Diese Cytokine stimulieren auch aktive Sauerstoffspezies und Entzündungsmediatoren wie PGE ₂. Das Ergebnis solcher makromolekularen Veränderungen im Gelenkknorpel bei Osteoarthritis ist die Ineffizienz von Reparaturprozessen, die zu einem weiteren Abbau des Knorpels führt.

Die oben genannten pro-inflammatorischen Zytokine modulieren die Prozesse der Hemmung / Aktivierung von MMP bei Osteoarthritis. Zum Beispiel kann das Ungleichgewicht zwischen den Mengen an TIMP-1 und MMP in Knorpel in Osteoarthritis durch IL-IP - vermittelt werden, da die Untersuchung in vitro gezeigt , dass durch Chondrozyten Konzentrationen von IL-1beta reduziert die Konzentration von TIMP-1 und MMP erhöhte Synthese zu erhöhen. Die Synthese von AP wird ebenfalls durch IL-1beta moduliert. Stimulation in vitro Chondrozyten des Gelenkknorpels mit IL-1 vyzyvet dosisabhängigen Anstieg der Synthese und scharfer AP Abnahme der Synthese von PAI-1. Die Fähigkeit von IL-1 die Synthese von PAI-1 - Synthese zu stimulieren und AP zu reduzieren , ist ein leistungsfähiger Mechanismus für die Erzeugung von Plasmin - Aktivierung und MMP. Darüber hinaus ist Plasmin nicht nur ein Enzym, das andere Enzyme aktiviert, es ist auch an dem Prozess des Abbaus von Knorpel durch direkte Proteolyse beteiligt.

IL-IP wird als inaktive Vorstufe synthetisiert Masse 31 kD (Prä-IL-IP), AZAT, werden nach der Spaltung des Signalpeptids, von dem Gewicht von 17,5 kD auf das aktive Cytokin umgewandelt. In den Geweben der Gelenke, einschließlich der Synovialmembran und Synovialflüssigkeit von Gelenkknorpel, IL-ip in aktiver Form erfaßt und in Studien in vivo demonstriert die Fähigkeit der Synovialmembran in Osteoarthritis dieses Zytokin sezernieren. Einige Serinproteasen sind in der Lage, pre-IL-ip in seine bioaktive Form zu überführen. Bei Säugetieren sind solche Eigenschaften in nur eine Protease gefunden, das zur Familie der Cystein aspartatspetsificheskih Enzyme IL-1P-Converting - Enzym (IKF oder Caspase-1) genannt , gehört. Dieses Enzym kann spezifisch Prä-IL-ip in ein biologisch aktives "reifes" IL-ip mit einer Masse von 17,5 kD umwandeln. IKF ist ein Proenzym mit einer molekularen Masse von 45 kD (p45), das in der Zellmembran lokalisiert ist. Nach proteolytischer Spaltung des Proenzyms p45 bilden sich zwei Untereinheiten, die als p10 und p20 bekannt sind, die durch enzymatische Aktivität charakterisiert sind.

TNF-a wird auch als ein membrangebundener Vorläufer mit einer Masse von 26 kD synthetisiert; durch proteolytische Spaltung wird es aus der Zelle als eine aktive lösliche Form mit einer Masse von 17 kD freigesetzt. Die proteolytische Spaltung erfolgt durch das TNF-a-konvertierende Enzym (TNF-KF), das zur Familie der Adamalysine gehört. AR Amin und Co-Autoren (1997) fanden eine erhöhte Expression von TNF-CF-mRNA im Gelenkknorpel von Patienten mit Osteoarthritis.

Die biologische Aktivierung von Chondrozyten und Synovitocyten IL-1 und TNF-a wird durch Bindung an spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen - IL-R und TNF-R - vermittelt. Für jedes Zytokin wurden zwei Arten von Rezeptoren identifiziert: IL-IP der Typen I und II und TNF-P I (p55) und II (p75). Für die Übertragung von Signalen in den Zellen der Gelenkgewebe sprechen IL-1PI und p55 an. IL-1P Typ I hat eine etwas höhere Affinität für IL-1beta als für IL-1a; IL-1P Typ II - im Gegensatz dazu hat eine größere Affinität für IL-1a als für IL-ip. Es bleibt unklar, ob IL-IP II Typ II IL-1-Signale vermitteln kann oder ob es nur dazu dient, die Bindung von IL-1 an den IL-1PI-Typ kompetitiv zu inhibieren. In Chondroiten und Synovialfibroblasten finden sich bei Patienten mit Osteoarthritis eine große Anzahl von IL-1PI und p55, was wiederum die hohe Sensitivität dieser Zellen für die Stimulation mit geeigneten Zytokinen erklärt. Dieser Prozess führt sowohl zu einer Erhöhung der Sekretion proteolytischer Enzyme als auch zur Zerstörung von Gelenkknorpel.

Es ist die Teilnahme von IL-6 im pathologischen Prozess bei Osteoarthritis nicht ausgeschlossen. Diese Annahme beruht auf den folgenden Beobachtungen:

• IL-6 erhöht die Anzahl der Entzündungszellen in der Synovialmembran,
• IL-6 stimuliert die Proliferation von Chondrozyten,
• IL-6 verstärkt die Wirkungen von IL-1, indem es die Synthese von MMP erhöht und die Synthese von Proteoglykanen hemmt.

Jedoch, IL-6 ist in der Lage, die Produktion von TIMP zu induzieren, jedoch nicht die Produktion von MMPs beeinflusst daher davon ausgegangen wird, dass dieses Zytokin in dem Prozess der Eindämmung von proteolytischen Abbau des Gelenkknorpels beteiligt ist, die durch einen Rückkopplungsmechanismus durchgeführt wird.

Ein weiterer Vertreter der IL-6-Familie ist das LIF - Zytokin, das durch Chondrozyten von Patienten mit Osteoarthrose erhaltenen erzeugt wird, in Reaktion auf eine Stimulation durch proinflammatorische Zytokine IL-IP und TNF-a. LIF stimuliert die Resorption von Proteoglykanen des Knorpels sowie die Synthese von MMP und NO-Produktion. Die Rolle dieses Zytokins bei Osteoarthritis ist nicht vollständig geklärt.

IL-17 ist ein 20-30 kD-Homodimer mit IL-1-ähnlicher Wirkung, jedoch viel weniger ausgeprägt. IL-17 stimuliert die Synthese und Isolierung einer Reihe von entzündungsfördernden Zytokinen, einschließlich IL-ip, TNF-a, IL-6 und MMP in Zielzellen, beispielsweise in menschlichen Makrophagen. Zusätzlich stimuliert IL-17 die NO-Produktion mit Chondrozyten. Wie die LIF wurde die Rolle von IL-17 in der Pathogenese von OA wenig untersucht.

Anorganische freie Radikale NO spielt eine wichtige Rolle bei der Degradation von Gelenkknorpel mit OA. Chondrozyten, die von Patienten mit Osteoarthritis erhalten werden, produzieren mehr NO sowohl spontan als auch nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu normalen Zellen. Ein hoher NO-Gehalt wird in der Synovialflüssigkeit und im Serum von Patienten mit Osteoarthritis gefunden - das Ergebnis einer erhöhten Expression und Synthese der induzierten NO-Synthase (hNOC), eines Enzyms, das für die NO-Produktion verantwortlich ist. Kürzlich wurde die DNA von Chondrozyten-spezifischem hNOC kloniert, die Aminosäuresequenz des Enzyms wurde bestimmt. Die Aminosäuresequenz zeigt eine Identität von 50% und eine Ähnlichkeit von 70% zu dem für das Endothel und das neurale Gewebe spezifischen hNOC.

NO hemmt die Synthese von Makromolekülen der ECM von Gelenkknorpel und stimuliert die Synthese von MMP. Darüber hinaus ist eine Zunahme der NO-Produktion von einer Abnahme der Synthese des Antagonisten IL-IP (IL-1RA) durch Chondrozyten begleitet. Somit führt eine Erhöhung des IL-1-Spiegels und eine Abnahme von IL-1-RA zu einer Überstimulation von NO-Chondrozyten, was wiederum zu einem erhöhten Abbau der Knorpelmatrix führt. Es gibt Berichte über eine therapeutische Wirkung eines selektiven hNOC-Inhibitors in vivo auf das Fortschreiten von experimenteller Osteoarthritis.

Natürliche Cytokininhibitoren können die Bindung von Zytokinen an die Rezeptoren von Zellmembranen direkt hemmen und ihre proinflammatorische Aktivität reduzieren. Natürliche Cytokinhemmer können je nach ihrer Wirkungsweise in drei Klassen eingeteilt werden.

Die erste Klasse von Inhibitoren schließt Rezeptorantagonisten ein, die die Bindung des Liganden an seinen Rezeptor durch Konkurrenz um die Bindungsstelle verhindern. Bis heute wird ein solcher Inhibitor nur für IL-1 gefunden - dies ist der oben erwähnte kompetitive Inhibitor des IL-1 / ILIP IL-1 PA-Systems. IL-1 RA blockiert viele der Wirkungen, die in den Geweben der Gelenke in Osteoarthritis, einschließlich der Synthese von Prostaglandinen durch synoviale Zellen beobachtet werden, die Produktion von Kollagenase durch Chondrocyten und den Abbau von Gelenkknorpel in dem Kabinett.

IL-1RA wird in verschiedenen Formen nachgewiesen - eine lösliche (rIL-1PA) und zwei interzelluläre (μIL-1PAI und μIL-1APAP). Die Affinität der löslichen Form von IL-1RA ist fünfmal so groß wie die der interzellulären Formen. Trotz der intensiven wissenschaftlichen Suche bleibt die Funktion der letzteren unbekannt. Experimente in vitro zeigten, dass, um die Aktivität von IL-1bet zu inhibieren, die Konzentration von IL-1PA, 10-100 Mal höher als normal, erforderlich ist, in vivo ist eine tausendfache Erhöhung der Konzentration von IL-1PA erforderlich. Diese Tatsache kann teilweise den relativen Mangel an IL-1-RA und den Überschuss an IL-1 in der Synovia von Patienten mit Osteoarthritis erklären.

Die zweite Klasse der natürlichen Hemmstoffe der Zytokine stellen die löslichen Rezeptoren der Zytokine vor. Ein Beispiel für solche Inhibitoren bei Menschen, die mit der Pathogenese von Osteoarthrose in Zusammenhang stehen, sind pIL-1P und pp55. Lösliche Zytokinrezeptoren sind verkürzte Formen von normalen Rezeptoren, binden an Cytokine, sie stören ihre Bindung an Membran-assoziierte Rezeptoren von Zielzellen, wobei sie durch den Mechanismus eines kompetitiven Antagonismus wirken.

Der Hauptvorläufer der löslichen Rezeptoren sind membrangebundene IL-1PP. Die Affinität von rIL-IP zu IL-1 und IL-1 PA ist unterschiedlich. Somit hat pIL-1PH eine größere Affinität für IL-1p als für IL-1 PA und pIL-1PI zeigt eine größere Affinität für IL-1RA als für IL-ip.

Für TNF gibt es auch zwei Arten von löslichen Rezeptoren - pp55 und pp75, wie lösliche IL-1-Rezeptoren, sie werden durch "Sheding" (Dumping) gebildet. In vivo finden sich beide Rezeptoren in den Geweben der betroffenen Gelenke. Die Rolle von löslichen TNF-Rezeptoren in der Pathogenese von Osteoarthritis wird diskutiert. Es wird vermutet, dass sie in geringen Konzentrationen die dreidimensionale Struktur von TNF stabilisieren und die Halbwertszeit des bioaktiven Zytokins erhöhen, während hohe Konzentrationen von pp55 und pp75 die TNF-Aktivität durch kompetitiven Antagonismus reduzieren können. Offensichtlich kann pp75 als ein Träger von TNF wirken, was seine Bindung an den Membran-assoziierten Rezeptor erleichtert.

Eine dritte Klasse von natürlichen Inhibitoren der Cytokin von einer Gruppe von anti-inflammatorischen Zytokinen dargestellt, das TGF-beta umfasst, IL-4, IL-10 und IL-13. Anti-inflammatorische Zytokine reduzieren die Produktion von pro-inflammatorischen, sowie einige Proteasen, stimulieren die Produktion von IL-1RA und TIMP.