Hämatopoetische Stammzellen des Dottersacks

Offensichtlich ist verschiedene proliferative und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen Potenz aufgrund der Besonderheiten ihrer ontogenetischen Entwicklung, weil in dem Prozess der Ontogenese in menschlichen ändern, auch die Lokalisierung der Hauptbereiche der Hämatopoiese. Hämatopoetische Vorläuferzellen des Dottersacks des Fötus sind der Bildung einer ausschließlich erythropoetischen Zelllinie verpflichtet. Nach der Migration von primärem GSK in die Leber und Milz in der Mikroumgebung dieser Organe erweitert sich das Spektrum der Komissionslinien. Insbesondere erlangen hämatopoetische Stammzellen die Fähigkeit, lymphoide Linien zu erzeugen. In der pränatalen Phase erreichen hämatopoetische Vorläuferzellen die Zone der endgültigen Lokalisation und besiedeln das Knochenmark. Im Prozess der fetalen Entwicklung im Blut des Fötus enthält eine erhebliche Anzahl von Stamm hämatopoetischen Zellen. Zum Beispiel erreicht der HSC-Spiegel in der 13. Schwangerschaftswoche 18% der Gesamtzahl der mononukleären Blutzellen. In Zukunft gibt es eine fortschreitende Abnahme in ihrem Inhalt, sondern kurz vor der Geburt Anzahl von HSC im Blut der Nabelschnur ist nicht sehr verschieden von ihren Zahlen im Knochenmark.

Aus dem Dottersack in die Leber, Milz und Knochenmark - Nach den klassischen Ideen, eine natürliche Veränderung der Lokalisation der Hämatopoese während der Embryonalentwicklung von Säugetieren wird durch die Migration und Implementierung eines neuen Mikro pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen durchgeführt. Seit den frühen Stadien der Embryonalentwicklung von hämatopoetischen Geweben enthält eine große Anzahl von Stammzellen, die als gestation abnimmt, ist die vielversprechendste zur Gewinnung hämatopoietischer Stammzellen hämatopoetische fötalen Lebergewebe aus abortnogo Material bei 5-8-Wochen Gestation isoliert betrachtet.

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Der Ursprung von hämatopoetischen Stammzellen

Die Tatsache, dass fötale rote Blutkörperchen in den Blutinseln des Dottersacks stammt, kein Zweifel. Jedoch in vitro Differenzierungspotential von hämatopoetischen x Dottersackzellen ist sehr begrenzt (sie unterscheiden überwiegend Erythrozyten). Es sei darauf hingewiesen, dass die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Dottersack nicht in der Lage ist Hämatopoese für eine lange Zeit wiederherzustellen. Es stellte sich heraus, dass diese Zellen nicht die Vorläufer des GSK eines erwachsenen Organismus sind. Echter GSK erscheint früher, bei 3-5 Wochen der fötalen Entwicklung, in der Zone der Bildung von Magengeweben und Endothel des Blutgefäßes (paraaortic splanchnopleura, P-SP) und anstelle von Lesezeichen Aorta Gonaden und primärer Niere - im Feld oder so Mesonephros genannt AGM-Bereich. Es hat sich gezeigt, dass Zellen gezeigt AGM-Region sind nicht nur eine Quelle von HSC, aber Endothelzellen der Blutgefäße, und Osteoklasten, die bei der Knochenbildung beteiligten Prozesse. Am 6. Schwangerschaftswoche frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen von AGM-Kreis Reise in die Leber, die die wichtigsten blutbildenden Organe des Fötus vor der Geburt ist.

Da dieser Moment unter dem Gesichtspunkt der Zelltransplantation äußerst wichtig ist, verdient das Problem des Ursprungs von HSC im Prozess der menschlichen Embryogenese eine ausführlichere Darstellung. Die klassische Idee, dass die hämatopoetischen Stammzellen von Säugetieren und Vögeln aus adnexal Quelle stammen, basierend auf Forschung Metcalf und Moore, der Klonierungstechniken GSK zum ersten Mal verwendet und deren Nachkommen, isoliert aus dem Dottersack. Die Ergebnisse ihrer Arbeit bildeten die Grundlage für die Migrationstheorie, nach der GSK, zuerst in dem Dottersack aufgetaucht, konsequent besetzt vorübergehende und endgültige hämatopoetischen Organe in der Bildung in ihrem jeweiligen Mikro. Auf diese Weise wurde die Ansicht vertreten, dass die Bildung von GSK, die ursprünglich im Dottersack lokalisiert war, als zelluläre Grundlage für die definitive Hämatopoese dient.

Die hämatopoetischen Stammzellen des Dottersacks gehören zu den frühesten Vorläuferzellen der Hämopoese. Ihr Phänotyp wird durch die Formel AA4.1 + CD34 + c-kit + beschrieben. Im Gegensatz zu GCS von reifem Knochenmark exprimieren sie keine Sca-1-Antigene und MHC-Moleküle. Es scheint, dass das Auftreten von Marker-Antigene auf den Oberflächenmembranen von GSK yolk sac durch Kultivierung während der embryonalen Entwicklung unter Bildung begangen Linien Hämopoese zu ihrer Differenzierung entspricht: verringert die Expression von CD34 Antigen und Thy-1 erhöht die Expression von CD38 und CD45RA, erscheinen HLA-DR-Moleküle. In den anschließenden durch Zytokine und Wachstumsfaktoren induziert wird, in vitro-Expression von Spezialisierungs beginnt Antigene spezifisch für hämatopoetische Vorläuferzellen der bestimmten Zelllinie. Allerdings ist die Ergebnisse der Studie von embryonalen Hämatopoese in Vertretern der drei Klassen von Wirbeltieren (Amphibien, Vögeln und Säugetieren), und insbesondere die Analyse der Herkunft des HSZ sind verantwortlich für die definitive Hämatopoese in der postnatalen Ontogenese, im Gegensatz zu klassischen Vorstellungen. Es wird festgestellt, dass bei Vertretern aller in der Embryogenese untersuchten Klassen zwei unabhängige Regionen gebildet werden, in denen GSKs entstehen. Extraembryonal „klassische“ -Region dargestellt Dottersack oder dessen Analoga, während die kürzlich intraembrionalnaya HSC Lokalisierungszone identifiziert umfasst paraaortale Mesenchym und AGM-Bereich. Heute kann man argumentieren, dass die Amphibien und Vögel endgültige HSCs aus intraembrionalnyh Quellen stammen, während bei Säugetieren und Menschen GSK Teil des Dottersacks in seiner endgültigen Hämatopoese noch unmöglich ist, vollständig zu eliminieren.

Embryonale Hämatopoese im Dottersack ist im wesentlichen primären Erythropoese, die durch die Erhaltung des Kernels in allen Stadien der Erythrozytenreifung und Art der fötalen Hämoglobinsynthese charakterisiert ist. Nach den neuesten Daten endet die Welle der primären Erythropoese am 8. Tag der Embryonalentwicklung im Dottersack. Es folgt eine Akkumulation von definitiven erythroiden Vorläuferzellen - BFU-E, die ausschließlich im Dottersack gebildet werden und erstmals am 9. Gestationstag auftreten. Das nächste Stadium der Embryogenese bildet bereits die definitiven erythroiden Vorläuferzellen - CFU-E, sowie (!) Mastzellen und CFU-GM. Dies ist die Grundlage für die Existenz eines Standpunktes, nach dem definitive Vorläuferzellen im Dottersack erscheinen, mit Blut wandern, sich in der Leber absetzen und schnell die erste Phase der intraembryonalen Hämatopoese einleiten. Nach diesen Vorstellungen kann der Dottersack einerseits als Ort der primären Erythropoese und andererseits als erste Quelle definitiver hämatopoetischer Vorläuferzellen in der Embryonalentwicklung angesehen werden.

Es ist aus dem Sack ist Dotter isoliert wird, dass koloniebildenden Zellen mit hohem Proliferationspotential gezeigt bereits am 8. Tag der Trächtigkeit, also lange vor der Schließung des Gefäßsystemes des Embryo und Dottersack. Darüber hinaus aus dem Dottersack, abgeleitet mit hohem Proliferationspotential in vitro Kolonie-bildenden Zellen, die Größe und die zelluläre Zusammensetzung unterscheidet sich nicht von den entsprechenden Parametern des Kulturwachstums von Knochenmark-Stammzellen. Zur gleichen Zeit, mit Kolonie Retransplantation Dottersack Zellen mit hohem Proliferationspotential deutlich mehr Kolonie gebildeter Zellen und Tochter multipotenten Vorläuferzellen als mit Knochenmark hämatopoetische Vorläuferzellen zu bilden.

Die endgültige Schlussfolgerung über die Rolle von hämatopoetischen Stammzellen im Dottersack definitive Hämatopoese können die Ergebnisse, in denen geben die Autoren eine Reihe von Endothelzellen des Dottersacks (G166), erhalten, die effektiv seine Zellproliferation mit phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von HSC (AA4.1 + WGA + unterstützt, geringe Dichte und schwache Hafteigenschaften). Der Inhalt der neuesten wenn kultiviert auf einer Feeder-Schicht von Zellen in der S166 für 8 Tage mehr als 100-fache erhöht. Die gemischten Kolonien, die auf der Unterschicht der Linie S166 Zelle gewachsen, wurden identifiziert Makrophagen, Granulozyten, Megakaryozyten, Monozyten und Blastenzellen und Vorläuferzellen von B und T-Lymphozyten. Dottersack Zellen, auf einer Unterschicht von Endothelzellen wächst die Fähigkeit besitzen, sich zu reproduzieren und in den Experimenten der Autoren zu drei Passagen gehalten. Erholung durch sie Hämatopoese in erwachsenen Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) durch die Bildung aller Leukozytarten begleitet, sowie T- und B-Lymphozyten. Doch die Autoren in ihrer Forschung Zellen des Dottersack von 10 Tage alten Embryos verwendet wird, aus dem das extra- und intraembrionalnye Gefäßsystem bereits geschlossen hat, das schließt nicht die Anwesenheit unter den Zellen des Dottersacks GSK intraembrionalnogo Herkunft.

Zur gleichen Zeit zeigte die Analyse des Differenzierungspotential von hämatopoetischen Zellen von frühen Stadien der Entwicklung, vor dem ausgewählten Gefäßsystem des Embryos kombiniert und den Dottersack (8-8,5 Tage Trächtigkeit) zeigte die Anwesenheit von Vorstufen von T- und B-Zellen im Dottersack, aber nicht im Körper des Embryos . Die in vitro-Verfahren zur zweistufigen Kultivierungssystem auf einer Monoschicht von epithelialen und subepithelialen Zellen der Thymusdrüse mononukleären Zellen wurden in den Dottersack von prä-T differenziert und T-Lymphozyten reifen. Unter den gleichen Kulturbedingungen, sondern auf einer Monoschicht von Stromazellen der Leber und Knochenmark mononukleären Zellen des Dottersacks wurden in pre-B Zellen differenziert und reifen IglVT-B-Lymphozyten.

Die Ergebnisse dieser Studien weisen auf die Möglichkeit hin, Zellen des Immunsystems aus dem extraembryonalen Gewebe des Dottersacks zu entwickeln, und die Bildung von primären T- und B-Zelllinien hängt von den Faktoren der stromalen Mikroumgebung der embryonalen hämatopoetischen Organe ab.

Andere Autoren zeigten auch, dass Dottersackzellen mit Potenzen eine lymphatische Differenzierung umfassen und gebildet Lymphozyten aus diesen antigenen Eigenschaften nicht in reifen Tieren unterscheiden. Es wird festgestellt, dass Zellen des Dottersack von 8-9 Tage alten Embryos können die Thymus-Lymphopoese in atimotsitarnom mit der Entstehung von reifen CD3 + CD4 + wiederherstellen - und CD8 + SDZ + Lymphozyten verziert Repertoire an Rezeptoren T-Zellen besitzen. Somit kann der Thymus von Zellen adnexal Ursprung besiedelt werden, aber es ist unmöglich, die Möglichkeit der Migration auf die Thymus-Vorläuferzellen durch T-Lymphozyten aus intraembrionalnyh Lymphopoese Quellen auszuschließen.

Jedoch Transplantation des Dottersacks hämatopoetischen Zellen in bestrahlte Empfänger Erwachsenen ist nicht immer abgeschlossen Repopulation lang am Boden zerstört Zonen hämatopoetischen Gewebelokalisierung, ein in vitro-Zellen des Dottersacks bilden Milzkolonien viel kleiner als die Zellen AGM-Bereich. In einigen Fällen über den Dottersack Zellen 9-Tage-Embryo ist noch möglich, langfristig (bis zu 6 Monate) Neubesiedlung des hämatopoetischen Gewebe bestrahlt Empfängers zu erreichen. Die Autoren glauben, dass die Zellen des Dottersack Phänotyp CD34 + c-kit + durch ihre Fähigkeit, die am Boden zerstört blutbildenden Organe zu besiedeln, nicht nur nicht von denen der AGM-Region unterscheiden, sondern auch effektiver Hämatopoese wieder herzustellen, wie in dem Dottersack sie enthielten fast 37-mal mehr .

Es sollte in Versuchen festgestellt werden, wobei die hämatopoetischen Zellen des Dottersacks mit Markerantigene GSK (c-kit + und / oder CD34 + und CD38 +), die direkt in die Leber oder die Bauch Vene Nachkommen von weiblichen Mäusen eingeführt wurden Injektionen von Busulfan bis 18. Tag der Schwangerschaft erhalten. In diesen neugeborenen Tieren eigene Myelopoese aufgrund stark niedergedrückt worden, um die Beseitigung von hämatopoetischen Stammzellen durch Busulfan verursacht. Nach der Transplantation HSZ des Dottersackes für Monate und im peripheren Blut des Empfängers identifiziert Blutkörperchen Spender Marker enthält - zu. Es wird festgestellt, dass der Dottersack von GSK-Gehalt von lymphatischen Zellen reduziert, myeloischen und erythroiden Abstammungslinien von Blut, Thymus, Milz und Knochenmark, wobei das Niveau des Chimärismus höher war im Fall von intra-, nicht intravenös Dottersack-Zellen. Die Autoren schlagen vor, dass HSCs der Dottersack von Embryos frühen Phasen der Entwicklung (bis zu 10 Tage) für die erfolgreiche Abwicklung der hämatopoetischen Organe der erwachsenen Empfänger in der Notwendigkeit einer vorläufigen Zusammenarbeit mit der hämatopoetischen Mikroumgebung der Leber. Es ist möglich, dass in der Embryonalentwicklung ein einzigartiges Entwicklungsstadium ist, wenn die Zellen des Dottersackes, in erster Linie in der Leber Migration und dann auf die Fähigkeit erwerben, das Stroma bildenden Organe des erwachsenen Empfängers zu kolonisieren.

In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass der Chimärismus von Zellen des Immunsystems häufig nach der Transplantation von Knochenmarkzellen in bestrahlte Empfänger geschlechtsreif beobachtet wird - in den Blutzellen des Spenders letzte Phänotypen in ausreichend großen Mengen werden bei den B- und T-Lymphozyten und Granulozyten Empfänger, die mindestens gefunden dauern 6 Monate.

Morphologische Methoden hämatopoetischen Zellen in Säugetieren nachgewiesen zuerst am 7. Tag der Embryonalentwicklung und präsentieren hämatopoetischen Inseln innerhalb des Gefäßes des Dottersackes. Jedoch wird die natürliche hämatopoetische Differenzierung im Dottersack begrenzt primären Erythrozyten Kern zu erhalten und fetalen Hämoglobins zu synthetisieren. Allerdings traditionell wurde angenommen, dass der Dottersack die einzige Quelle des HSC ist der blutbildenden Organe des Fötus Migration und definitive Hämatopoese bei erwachsenen Tieren zur Verfügung stellen, da das Auftreten von HSC im Körper des Embryos ist der Verschluss des Gefäßsystems des Embryos und Dottersack. Zur Unterstützung dieser Sicht entsprechend Daten, die in in vitro-Klonierung von Zellen des Dottersackes führen zu Granulozyten und Makrophagen, ein in vivo - Milzkolonien. Dann während Transplantationsversuchen wurde festgestellt, dass die hämatopoetischen Zellen des Dottersacks, der in den Dottersack der Lage sind, nur in den primären roten Blutkörperchen in der Mikroumgebung der Leber von Neugeborenen und Erwachsenen SCID-Mäusen zu differenzieren am Boden zerstört Thymus oder Stroma-Feeder erwerben die Fähigkeit, die hämatopoetische Organe mit Wiederherstellung aller neu zu besiedeln Linien der Hämopoese sogar bei erwachsenen Empfängertieren. Im Prinzip erlaubt dies, sie als echte GSKs zu klassifizieren - als Zellen, die in der postnatalen Periode funktionieren. Es wird angenommen, dass der Dottersack, zusammen mit der AGM-Region, eine Quelle der HSZ für definitive Hämatopoese bei Säugetieren jedoch nach wie vor von ihrem Beitrag zur Entwicklung des hämatopoetischen Systems ist unklar. Ich verstehe nicht, die biologische Bedeutung und Existenz in der frühen Embryonalentwicklung von Säugetieren, zwei blutbildenden Organe mit ähnlichen Funktionen.

Die Suche nach Antworten auf diese Fragen geht weiter. In vivo konnte die Anwesenheit von Dottersack von Embryo 8-8,5-Tage-Zelle Lymphopoese bei der Verringerung der subletal bestrahlten SCID-Mäuse, die mit schweren Mangel an T und B-Lymphozyten beweisen. Die hämatopoetischen Zellen des Dottersacks wurden sowohl intraperitoneal als auch direkt in das Gewebe der Milz und Leber injiziert. Nach 16 Wochen wurden TCR / CD34 \ CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten und B-220 + IgM + B-Lymphozyten, markiert mit MHC-Spenderantrhogenen, in den Empfängern nachgewiesen. Im Körper, 8-8,5-Tage-Embryonen von Stammzellen, die zu einer solchen Wiederherstellung des Immunsystems fähig sind, fanden die Autoren nicht.

Dottersack hämatopoetischen Zellen besitzen ein hohes proliferative Potential und können langfristiger Selbstreproduktion in vitro. Einige Autoren haben diese Zellen als Grundlage für die langfristige HSC (ca. 7 Monate) die Erzeugung von Erythroidvorläuferzellen unterscheidet sich von Knochenmark-Vorläufern von erythroiden Linie Passagierung längere Dauer, große Kolonien identifiziert, eine erhöhte Empfindlichkeit auf Wachstumsfaktoren und verlängerte Proliferation. Weiterhin unter geeigneten Kultivierungsdottersackzellen in vitro Bedingungen gebildet und Vorläuferzellen der lymphatischen Serie.

Diese Daten deuten darauf hin, eine allgemeine Quelle des Dottersacks GSK, wobei weniger engagiert und haben daher große proliferative Potential als Knochenmark-Stammzellen. Doch trotz der Tatsache, dass der Dottersack pluripotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen, langfristige Unterstützung verschiedene Linien von hämatopoetischen Differenzierung in vitro enthält, wobei das einzige Kriterium für die Brauchbarkeit von GCW ist ihre Fähigkeit, längere hämatopoetischen Organe des Empfängers, hämatopoetischen Zellen wieder zu bevölkern, die genetisch defiziente oder beschädigt sind. Somit ist die entscheidende Frage, ob die pluripotenten hämatopoetischen Zellen des Dottersackes wandern und hämatopoetischen Organe besiedeln und tselesoorbrazno testes Werk überarbeitet werden, was ihre Fähigkeit, die blutbildenden Organe von geschlechtsreifen Tieren, die mit der Bildung der großen hämatopoetischen Linien neu zu besiedeln demonstriert. In Embryonen von Vögeln in den 70-er Jahren wurden intraembrionalnye Quellen endgültigen HSC identifiziert, die bereits in Frage die etablierten Vorstellungen über die Entstehung von adnexal GSK, darunter Vertreter anderer Klassen der Wirbeltiere genannt wurde. In den letzten Jahren gab es Veröffentlichungen über das Vorhandensein von Säugetieren und Menschen ähnliche intraembrionalnyh Stellen enthält GSK.

Wieder einmal stellen wir fest, dass die grundlegenden Kenntnisse in diesem Bereich sehr wichtig sind für die praktische Zelltransplantation, da nicht nur helfen, die bevorzugte Quelle für HSC zu definieren, sondern auch die Besonderheiten der Wechselwirkung von primären hämatopoetischen Zellen aus genetisch fremden Organismen zu etablieren. Es ist bekannt, dass die Verabreichung von menschlichen hämatopoetischen Stammzellen in der fötalen Leber sheep Organogenese Embryo im Stadium zur Herstellung von chimären Tieren führt, Blut und Knochenmark sind 3 bis 5% der humanen hämatopoetischen Zellen, die stabil bestimmt. In diesem Fall brauchen menschliche HSZ nicht ihren Karyotyp ändern, während eine hohe Proliferationsrate beibehalten wird und die Fähigkeit zu unterscheiden. Darüber hinaus bedeutet das transplantierte xenogenen HSC nicht mit dem Immunsystem und phagozytischen Zellen des Wirtsorganismus in Konflikt steht und wird nicht in Tumorzellen transformiert, die die Basis der intensiven Entwicklung von Methoden zur intrauterine Korrektur der erblichen genetischen Krankheit gebildet WSR oder HSCs transfiziert defiziente Gene verwenden.

Aber in welchem Stadium der Embryogenese ist eine solche Korrektur angemessener? Zellen zum ersten Mal, um die Hämatopoese bei Säugetieren bestimmt erscheinen unmittelbar nach der Implantation (Tag 6 der Trächtigkeit), wenn die morphologischen Eigenschaften der hämatopoetischen Differenzierung und vermutlichen hämatopoetischen Organe sind noch nicht verfügbar. In diesem Stadium können die dispergierten Mausembryozellen die hämatopoetischen Organen bestrahlte Empfänger repopulate Erythrozyten und Lymphozyten, die sich von den Wirtszellen oder Hämoglobin bzw. Marker glitserofosfatizomerazy und zusätzliche chromosomale Typs zu bilden (Tb) der Spenderzellen. Bei Säugetieren, wie Vögel, zusammen mit dem Dottersack zur Schließung des gesamten Gefäßbettes direkt in den Körper des Embryos in dem paraaortale splanhnoplevre erscheint hämatopoetischen Zellen. Von AGM-zugewiesenen Bereich hämatopoetischen Zellen AA4.1 + Phänotyp, wie multipotenten hematopoietischen Zellen identifiziert bilden T- und B-Lymphozyten, Granulozyten, Megakaryozyten und Makrophagen. Phänotypisch sind diese multipotenten Vorläuferzellen sehr nahe an HSCs Knochenmark bei erwachsenen Tieren (CD34 + c-kit +). Die Zahl der multipotenten AA4.1 + Zellen unter allen AGM-Zelle ist klein - sie sind nicht mehr als 1/12 Teil davon.

Im menschlichen Embryo wurde auch eine homologe AGM-Region von Tieren, eine intraembryonale Region, die HSC enthält, gefunden. Darüber hinaus sind beim Menschen mehr als 80% multipotente Zellen mit hohem Proliferationspotential im Körper des Embryos enthalten, obwohl solche Zellen im Dottersack vorhanden sind. Eine detaillierte Analyse ihrer Lokalisierung zeigte, dass Hunderte von solchen Zellen zu kompakten Gruppen zusammengebaut sind, die sich in unmittelbarer Nähe des Endothels der ventralen Wand der dorsalen Aorta befinden. Phänotypisch sind sie CD34CD45 + Lin-Zellen. Im Gegensatz dazu sind solche Zellen im Dottersack ebenso wie in anderen hämatopoetischen Organen des Embryos (Leber, Knochenmark) einfach.

Folglich menschliche embryonale AGM-Region enthält Clustern von hämatopoetischen Zellen, die eng mit der ventralen Aorta dorsalis Endothel sind. Dieser Kontakt kann verfolgt und immunochemischen Ebene - und Cluster von hämatopoetischen Zellen und Endothelzellen vascular endothelial growth factor, FLT-3-Liganden und ihre Rezeptoren FLK-1 und STK-1, sowie Transkriptionsfaktor exprimierenden Leukämie-Stammzellen. Das AGM-Bereich mesenchymalen Derivate dargestellt dichte tyazhem abgerundeten Zellen entlang der dorsalen Aorta und mit dem Ausdruck Tenascin C - Glykoprotein Grundsubstanz aktiv in den Prozessen der Zell-Zell-Interaktionen und Migration beteiligt.

Multipotenten Stammzellen AGM-Kreis nach der Transplantation schnell Hämatopoese in erwachsenen Mäusen und ausgesetzt, um eine lange Zeit (bis zu 8 Monate) eine wirksame Hämatopoese wiederherzustellen. Im Dottersack von Zellen mit solchen Eigenschaften offenbarten die Autoren nicht. Die Ergebnisse dieser Studie werden von anderen Arbeiten bestätigt, die zeigten, dass die frühen Phasen der Entwicklung von Embryonen (10,5 Tage) AGM-Region ist die einzige Quelle der Zellen, die die Definition von GCW, myeloischen und lymphatischen Wiederherstellung der Hämatopoese bei erwachsenen bestrahlte Empfänger treffen.

Von AGM zugewiesenen Bereich Stroma-Linie AGM-S3, die die Erzeugung von Zellen in Kultur CFU-GM verpflichtet Vorläufern, BFU-E, CFU-E und CFU Mischtyp unterstützen. Der Gehalt des letzteren während der Kultivierung auf der Feeder-Unterschicht von AGM-S3-Zellen erhöht sich von 10 auf 80 mal. Daher wird in der Mikroumgebung der AGM-Region vorhanden Stromazellen, unterstützt effizient das Blut, so dass er AGM-Bereich kann auch embryonale blutbildenden Organe dienen - die definitive Quelle von HSC, das heißt, GSK hämatopoetischen Gewebe eines erwachsenen Tieres zu bilden.

Erweiterte immunofenotipirovanie zelluläre Zusammensetzung AGM-Region zeigte, dass es nicht nur multipotente hämatopoetische Zellen befinden, sondern auch Zellen verpflichtet, die myeloiden und lymphoiden (T- und B-Lymphozyten) Differenzierung. Wenn jedoch die molekulare Analyse von einzelnen CD34 + c-kit + -Zellen aus AGM-Region, die die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung ergab die Aktivierung nur die beta-Globin und Myeloperoxidase aber nicht lymphoiden kodierenden Gene die Synthese von CD34, Thy-1 und 15 teilweise Aktivierung lineage spezifische Gene typisch für frühe ontogenetische Stadien der Entstehung von HSC- und Progenitorzellen. Da die Zahl kommiti- Rowan Vorläufer in AGM-Bereich 10-Tage-Embryo um 2-3 Größenordnung niedriger als in der Leber, kann man argumentieren, dass gerade am Tag 10 des embryonalen Hämatopoese in AGM beginnt, während in erster Linie die hämatopoetischen Linien sind bereits während dieser Zeit im Einsatz.

Tatsächlich im Gegensatz zu früher (9-11 Tage) von hämatopoetischen Stammzellen des Dottersacks und dem Bereich der Hauptversammlung, die hämatopoetische Mikroumgebung des Neugeborenen repopulating, aber nicht für Erwachsene, hämatopoetischen Vorläuferzellen 12-17 Tage fötale Leber erfordert nicht frühen postnatalen Mikroumgebung und besetzen die Organe der Hämatopoese eines erwachsenen Tieres nicht schlechter als ein Neugeborenes. HSCs nach der Transplantation von fötalen Leber erwachsenen Hämatopoese in bestrahlte Empfängermäuse war polyklonalen in der Natur. Außerdem markierte Kolonien unter Verwendung wird gezeigt, dass der Betrieb der etablierten Klonen klonalen Aufeinanderfolge vollständig gehorcht war, im erwachsenen Knochenmark nachgewiesen. Daher GSK fötale Leber markiert, so viel milderen Bedingungen ohne prestimulyatsii exogene Zytokine, bereits über die grundlegenden Eigenschaften von adulten HSZ nicht in der frühen post embryonale Mikroumgebung benötigt wird, in den Zustand tiefer Ruhe nach der Transplantation und klonoobrazovanie nacheinander in Übereinstimmung mit dem Modell klonalen Nachfolge mobilisiert.

Offensichtlich sollten wir etwas näher auf das Phänomen der Klonensukzession eingehen. Die Erythropoese trägt hämatopoetische Stammzellen, die ein hohes Proliferationspotential und die Fähigkeit zur Differenzierung in allen Linien von Vorläufer-Blutzellen aufweisen. Bei normaler Hämatopoese bleiben die meisten hämatopoetischen Stammzellen im dermatologischen Zustand und werden zur Proliferation und Differenzierung mobilisiert, wobei aufeinanderfolgende Klone gebildet werden. Dieser Vorgang wird als klonale Sukzession bezeichnet. Experimentelle Hinweise auf eine klonale Sukzession im hämatopoetischen System wurden in Studien mit GSK, markiert mit retroviralem Gentransfer, erhalten. In erwachsenen Tieren wird die Hämatopoese durch viele gleichzeitig funktionierende hämatopoetische Klone aufrechterhalten, die von GSK stammen. Basierend auf dem Phänomen der klonalen Sukzession wurde ein Repopulationsansatz zur Identifizierung von GCS entwickelt. Dieses Prinzip unterscheidet langfristige hämatopoetische Stammzellen (LT-HSC), die in der Lage sind, das hämatopoetische System während des gesamten Lebens wiederherzustellen, und einen Kurzzeit-GSK, der diese Funktion für einen begrenzten Zeitraum ausführt.

Wenn wir die hämatopoetischen Stammzellen in Bezug auf repopulyatsionnogo Ansatz, die charakteristisch für hämatopoetische fötale Leberzellen prüfen, ist ihre Fähigkeit, eine Kolonie, die in der Größe ist viel höher als die mit einer Zunahme der GSK Nabelschnurblut oder Knochenmark zu schaffen, und dies gilt für alle Arten von Kolonien. Diese Tatsache weist bereits auf ein höheres proliferatives Potential der hämatopoetischen Zellen der embryonalen Leber hin. Ein einzigartiges Merkmal von hämatopoetischen Progenitorzellen fötalen Leber - kürzer, wenn verglichen mit anderen Quellen des Zellzyklus, der aus dem Gesichtspunkt der Effizienz Repopulation des Hämatopoese in Transplantation wichtig ist. Analyse der zellulären Zusammensetzung von hämatopoetischen Suspension aus Quellen reifen Organismus erhalten wurde, zeigt, dass in vorteilhafter Weise in allen Stadien der Ontogenese von nukleierten Zellen terminal differenzierte Zellen dargestellt wird, die Anzahl und den Phänotyp, die auf dem Alter des Spenders hämatopoetischen ontogenetischer Gewebe abhängen. Insbesondere wird eine Suspension von mononuklearen Knochenmark und Nabelschnurblut-Zellen um mehr als 50% besteht aus reifen Zellen des lymphoiden Linie, während weniger als 10% der Lymphozyten in der fötalen Leber hämopoetische Gewebe gefunden. Darüber hinaus stellten die myeloischen Linie Zellen in fötaler Leber und fötale erythroide vorteilhaft nächstes wird, während im Nabelschnurblut und Knochenmark-Granulozyten-Makrophagen-Elemente durchsetzen.

Wichtig ist die Tatsache, dass die fötale Leber einen vollständigen Satz der frühesten hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält. Unter den letzteren sei darauf hingewiesen erythroiden, granulopoeticheskie, megakariopoeticheskie und multikoloniebildenden Zellen werden. Ihre primitiveren Vorläufern - LTC-IC - sind in der Lage sich zu vermehren und in vitro für 5 oder mehr Wochen zu unterscheiden, und auch die funktionelle Aktivität nach der Einpflanzung in den Körper des Empfängers in allogenen zu halten und sogar xenogene Transplantation in immundefizienten Tieren.

Biologische Machbarkeits Vorherrschen in fötalen erythroiden Leberzellen (bis zu 90% der gesamten hämatopoetischen Zellen) aufgrund der Notwendigkeit Erythrozytenmasse zum schnellen Blutvolumen des sich entwickelnden Fötus erhöht. In der fötalen Leber Erythropoese dargestellt Kern erythroiden Vorläufer verschiedene Reifegrade fötale Hämoglobins (a2u7) enthalten, die durch eine höhere Affinität für Sauerstoff effektive Absorption des letzteren aus mütterlichem Blut gewährleistet. Intensivierung der Erythropoese in fötaler Leber wird mit einem lokalen Anstieg der Synthese von Erythropoietin (EPO) in Verbindung gebracht. Es ist bemerkenswert, dass die Umsetzung des hämatopoetischen Potentials von hämatopoetischen fötalen Leberzellen ausreichend allein Erythropoietin Anwesenheit, während lineage Einsatzes für die Erythropoese Knochenmark HSCs und Nabelschnurblut aus einer Kombination von Zytokinen und Wachstumsfaktoren erfordert von EPO, SCF, GM-CSF und IL-3. Zu diesen frühen Zellen hämatopoetische Vorläufer isoliert aus fötaler Leber ohne Rezeptoren für EPO, reagiert nicht auf exogene Erythropoietin. Zur Induktion der Erythropoese in einer Suspension von fötalen Leber mononukleären Zellen erfordert die Anwesenheit von fortgeschritteneren eritropoetinchuvstvitelnyh Zellen mit dem Phänotyp CD34 + CD38 +, die den EPO-Rezeptor exprimieren.

In der Literatur gibt es noch keinen Konsens über die Bildung von Hämopoese in der Embryonalperiode. Die funktionelle Bedeutung der Existenz von extra- und intraembryonalen Quellen von hämatopoetischen Vorläuferzellen wurde nicht festgestellt. Jedoch gibt es keinen Zweifel, dass die menschliche Leber in der Embryonalentwicklung ist das Zentralorgan der Hämatopoese und für 6-12 Wochen der Schwangerschaft ist die primäre Quelle von hämatopoetischen Stammzellen, die Milz, Thymus und Knochenmark besiedeln, erreichen GDR verwandte Funktionen in prä- und postnatalen Zeiträumen Entwicklung.

Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass die embryonale Leber im Vergleich zu anderen Quellen durch den höchsten Gehalt an HSC gekennzeichnet ist. Ungefähr 30% der CD344-Zellen der embryonalen Leber weisen einen Phänotyp von CD38 auf. Gleichzeitig beträgt die Anzahl der lymphoiden Progenitorzellen (CD45 +) in den frühen Stadien der Hämatopoese in der Leber nicht mehr als 4%. Es wurde festgestellt, dass sich die Anzahl der B-Lymphozyten mit der Entwicklung des Fötus von der 7. Bis zur 17. Schwangerschaftswoche mit einem monatlichen "Schritt" von 1,1% progressiv erhöht, während der Grad der GSC dauerhaft verringert wird.

Die funktionelle Aktivität von hämatopoetischen Stammzellen hängt auch von der Periode der embryonalen Entwicklung ihrer Quelle ab. Untersuchung der Leberzellkoloniebildende Aktivität von menschlichen Embryonen 6-8 Minuten und 9-12 Minuten Schwangerschaftswoche, wenn sie in halbfestem Medium in Gegenwart von SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 und EPO zeigten, dass die Gesamtzahl der Kolonien in 1 , 5-mal höher, wenn HSV-Embryonenleber früh in der Entwicklung gesät wird. Zur gleichen Zeit ist die Zahl der Lebervorläuferzellen Myelopoese als CFU-GEMM, bei 6-8 Wochen der Embryonalentwicklung mehr als das Dreifache der Zahl an 9-12 Wochen der Schwangerschaft ist. Im Allgemeinen war die koloniebildende Aktivität von hämatopoetischen Leberzellen von Embryonen des ersten Trimesters der Schwangerschaft signifikant höher als die des zweiten Trimesters der fetalen Leberzellen.

Die obigen Daten deuten darauf hin, dass die fötale Leber in der frühen Embryogenese ist nur mit einem hohen Gehalt von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen nicht charakterisiert, aber die hämatopoetischen Zellen sind durch eine Vielzahl von Differenzierung in verschiedene Zelllinien gekennzeichnet. Diese Merkmale der funktionellen Aktivität von hämatopoetischen Stammzellen der embryonalen Leber können eine gewisse klinische Bedeutung haben, da ihre qualitativen Eigenschaften eine ausgeprägte therapeutische Wirkung bei der Transplantation selbst einer kleinen Anzahl von Zellen, die in der frühen Schwangerschaft erhalten wurden, erwarten lassen.

Dennoch bleibt das Problem der Anzahl der hämatopoetischen Stammzellen, die für eine effektive Transplantation erforderlich sind, offen und relevant. Es wird versucht, sie zu lösen, indem das hohe Potential der Selbstreproduktion von hämatopoetischen Zellen der embryonalen Leber in vitro mit ihrer Stimulation durch Zytokine und Wachstumsfaktoren genutzt wird. Mit konstanter Perfusion im Bioreaktor des frühen GSC der embryonalen Leber, nach 2-3 Tagen am Ausgang ist es möglich, die Anzahl der hämopoetischen Stammzellen 15-mal höher als ihr Grundniveau zu erhalten. Zum Vergleich ist anzumerken, dass zur Erzielung einer 20-fachen Steigerung der HSC-Nabelschnurblut-Ausbeute unter den gleichen Bedingungen mindestens zwei Wochen benötigt werden.

Somit unterscheidet sich die embryonale Leber von anderen Quellen von hämatopoetischen Stammzellen mit einem höheren Gehalt an sowohl gebundenen als auch frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen. In einer Kultur mit Wachstumsfaktoren bilden embryonale Leberzellen mit dem CD34 + CD45Ra1 CD71l0W-Phänotyp 30 mal mehr Kolonien als ähnliche Nabelschnurblutzellen und 90 mal mehr als die HSC des Knochenmarks. Die in diesen Quellen des Unterschiedes im Gehalt von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen ausgeprägt gemischte Kolonien bildenden - die Zahl des CFU-GEMM in fötaler Leber überschreitet, dass im Nabelschnurblut und Knochenmark, jeweils 60 und 250 mal.

Wichtig ist die Tatsache, dass mehr als 60% der Leberzellen bis zur 18. Woche der embryonalen Entwicklung (während des Beginns der Hämatopoese im Knochenmark) in der hämopoetischen Funktion Implementierung beinhaltet. Da vor der 13. Woche der fötalen Entwicklung beim Menschen fehlen Thymus und Thymozyten bzw. Sind, Transplantation von hämatopoetischen fötalen Leberzellen von 6-12 Wochen der Schwangerschaft reduziert deutlich das Risiko der Reaktion „Graft versus Host“ und erfordert nicht die Auswahl eines histokompatibles Spender, da es relativ einfach erlaubt zu erreichen hämopoetischer Chimärismus.