Molekulargenetische Methoden zur Diagnose von Erbkrankheiten

DNA-Technologieverfahren werden verwendet, um die Lokalisierung in einem bestimmten Chromosom des mutierten Gens verantwortlich für die Entstehung bestimmter Formen von Erbkrankheiten zu bestimmen. Da das Gen ein DNA-Segment und Genmutation - Schaden an der Primärstruktur von DNA (eine Mutation von allen Änderungen in der DNA-Sequenz verstanden, unabhängig von ihrem Standort und dem Einfluss auf die einzelnen Lebensfähigkeit) dann Sondieren Präparationen von Metaphase Patientenchromosomen Erbkrankheit, möglich festzustellen, Lokalisierung des pathologischen Gens. Methoden der Molekulargenetik die Möglichkeit zur Diagnose von Krankheiten, bei einer veränderten DNA-Struktur zu schaffen, damit sie die Lokalisierung von Erbkrankheiten zu ermitteln. Molekulargenetische Methoden können Mutationen aufdecken, die mit dem Ersatz einer einzigen Base zusammenhängen.

Die wichtigste Stufe bei der Identifizierung eines Gens ist seine Isolierung. DNA kann aus jeder Art von Gewebe und Zelle, die Kerne enthält, isoliert werden. Die Schritte der DNA-Isolierung umfassen schnelle Lyse der Zellen durch Zentrifugation mit der Entfernung von Fragmenten von Zellorganellen und Membranen, enzymatischer Zerstörung von Proteinen und ihrer Extraktion aus der Lösung mit Phenol und Chloroform, DNA-Konzentration durch Ausfälle in Ethanol.

In genetischen Laboratorien wird DNA am häufigsten aus Blutleukozyten isoliert, für die der Patient 5-20 ml venöses Blut in einer sterilen Röhre mit einer gerinnungshemmenden Lösung (Heparin) erhält. Leukozyten werden dann gemäß den oben beschriebenen Schritten getrennt und verarbeitet.

Die nächste Stufe der Materialvorbereitung für das Studium - Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme) - DNA „Schnitt“ in Fragmente an Stellen mit streng spezifischen Basensequenz wird durch bakterielle Enzyme durchgeführt. Restriktasen erkennen spezifische Sequenzen von 4-6, seltener 8-12 Nucleotide in einem doppelsträngigen DNA-Molekül und teilen sie an den Stellen der Lokalisierung dieser Sequenzen, die Restriktionsstellen genannt werden, in Fragmente. Die Anzahl der erzeugten Restriktions-DNA-Fragmente wird durch die Häufigkeit der Restriktionsstellen bestimmt, und die Größe der Fragmente wird durch die Verteilung dieser Stellen entlang der Länge des ursprünglichen DNA-Moleküls bestimmt. Je öfter die Restriktionsstellen lokalisiert sind, desto kürzer sind die DNA-Fragmente nach der Restriktion. Gegenwärtig sind mehr als 500 verschiedene Arten von Restriktionsenzymen bakteriellen Ursprungs bekannt, und jedes dieser Enzyme erkennt seine spezifische Nukleotidsequenz. Zukünftig können Restriktionsstellen als genetische Marker für DNA verwendet werden. Die durch Restriktion gebildeten DNA-Fragmente können entlang der Länge durch Elektrophorese in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel angeordnet werden, und somit kann ihr Molekulargewicht bestimmt werden. Üblicherweise wird eine spezifische Färbung (häufiger Ethidiumbromid) verwendet, um die DNA im Gel nachzuweisen, und das Gel wird im transmittierten Licht des ultravioletten Bereichs des Spektrums betrachtet. Orte der DNA-Lokalisierung haben eine rote Farbe. Jedoch Endonukleasen eine Person bei der Verarbeitung von mehreren DNA-Restriktions so viele Fragmente unterschiedlicher Länge ausgebildet ist, dass sie durch Elektrophorese getrennt werden, fehlschlagen, ist es nicht möglich, visuell die einzelnen DNA-Fragmente zu identifizieren Elektrophoretogramm (hergestellt einheitliche Färbung auf der ganzen Länge des Gels). Daher wird ein Hybridisierungsverfahren mit markierten DNA-Sonden verwendet, um die gewünschten DNA-Fragmente in einem solchen Gel zu identifizieren.

Jedes einzelsträngige DNA- oder RNA-Segment kann an seine komplementäre Kette binden (hybridisieren), und Guanin ist immer mit Cytosin, Adenin mit Thymin assoziiert. Dies ist die Bildung eines doppelsträngigen Moleküls. Wenn eine einzelsträngige Kopie des klonierten Gens mit einer radioaktiven Markierung markiert ist, wird eine Sonde erhalten. Die Sonde ist in der Lage, ein komplementäres DNA-Segment zu finden, das dann durch Radioautographie leicht identifiziert werden kann. Eine radioaktive Sonde, die einem Arzneimittel aus gestreckten Chromosomen zugesetzt wird, erlaubt es, das Gen auf einem bestimmten Chromosom zu lokalisieren: bestimmte DNA-Proben können mit einer DNA-Sonde im Southern Blotting identifiziert werden. Die Hybridisierung tritt auf, wenn der Testabschnitt der DNA ein normales Gen enthält. In dem Fall, in dem eine abnormale Sequenz von Nukleotiden vorliegt, das heißt, die entsprechenden Chromosomenstrukturen enthalten ein mutiertes Gen, findet keine Hybridisierung statt, was es ermöglicht, die Lokalisierung des pathologischen Gens zu bestimmen.

Um DNA-Sonden zu erhalten, wird das Gen-Klonierungsverfahren verwendet. Das Wesen des Verfahrens besteht darin, dass das DNA-Fragment, das das Klonieren Teilchen eingefügt in, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, ein Gen oder eine Region des Gens entspricht (circular extrachromosomale DNA in Bakterienzellen und Gene, die Resistenz gegen die Antibiotika tragen), und dann die Bakterien mit einem Plasmid mit einem eingebauten menschlichen Gen multipliziert werden. Aufgrund der Synthesevorgänge in dem Plasmid ist es möglich, Milliarden von Kopien des menschlichen Gens oder seiner Stelle zu erhalten.

Ferner werden DNA-Kopien, die mit einer radioaktiven Markierung oder Fluorochromen markiert sind, als Sonden verwendet, um nach komplementären Sequenzen unter dem Pool von untersuchten DNA-Molekülen zu suchen.

Gegenwärtig gibt es viele verschiedene Methoden, die DNA-Sonden zur Diagnose von Genmutationen verwenden.

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