Molekulargenetische Methoden zur Diagnose von Erbkrankheiten

Mit Methoden der DNA-Technologie lässt sich die Lokalisation eines mutierten Gens in einem bestimmten Chromosom bestimmen, das für die Entstehung gewisser Formen von Erbkrankheiten verantwortlich ist. Da ein Gen ein DNA-Abschnitt ist und eine Genmutation eine Schädigung der Primärstruktur der DNA darstellt (unter Mutation versteht man alle Veränderungen der DNA-Sequenz, unabhängig von ihrer Lokalisation und ihrem Einfluss auf die Lebensfähigkeit eines Individuums), lässt sich durch die Untersuchung von Präparaten der Metaphasenchromosomen eines Patienten mit einer Erbkrankheit die Lokalisation des pathologischen Gens feststellen. Molekulargenetische Methoden ermöglichen die Diagnose von Krankheiten auf der Ebene der veränderten DNA-Struktur und die Bestimmung der Lokalisation von Erbkrankheiten. Mit molekulargenetischen Methoden lassen sich Mutationen identifizieren, die mit dem Austausch auch nur einer einzigen Base verbunden sind.

Der wichtigste Schritt der Genidentifizierung ist die Isolierung. DNA kann aus allen Gewebearten und Zellen mit Zellkernen isoliert werden. Die Schritte der DNA-Isolierung umfassen: schnelle Zelllyse, Entfernung von Fragmenten zellulärer Organellen und Membranen durch Zentrifugation, enzymatische Zerstörung von Proteinen und deren Extraktion aus der Lösung mit Phenol und Chloroform sowie Konzentration von DNA-Molekülen durch Fällung in Ethanol.

In genetischen Laboren wird DNA meist aus Blutleukozyten isoliert. Dazu werden dem Patienten 5–20 ml venöses Blut entnommen und in ein steriles Reagenzglas mit einer Antikoagulanslösung (Heparin) gegeben. Anschließend werden die Leukozyten abgetrennt und gemäß den oben beschriebenen Schritten verarbeitet.

Der nächste Schritt der Materialvorbereitung für die Forschung besteht darin, die DNA in Fragmente an Stellen mit einer streng spezifischen Basensequenz zu zerlegen. Dies geschieht mithilfe bakterieller Enzyme – Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme). Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzen von 4–6, seltener 8–12 Nukleotiden in einem doppelsträngigen DNA-Molekül und zerlegen es an den Stellen dieser Sequenzen, den sogenannten Restriktionsstellen, in Fragmente. Die Anzahl der resultierenden Restriktionsfragmente der DNA wird durch die Häufigkeit des Auftretens der Restriktionsstellen bestimmt, und die Größe der Fragmente wird durch die Art der Verteilung dieser Stellen entlang des ursprünglichen DNA-Moleküls bestimmt. Je häufiger die Restriktionsstellen lokalisiert sind, desto kürzer sind die DNA-Fragmente nach der Restriktion. Derzeit sind über 500 verschiedene Arten von Restriktionsenzymen bakteriellen Ursprungs bekannt, und jedes dieser Enzyme erkennt seine eigene spezifische Nukleotidsequenz. Restriktionsstellen könnten künftig als genetische Marker der DNA genutzt werden. Die durch die Restriktion gebildeten DNA-Fragmente können durch Elektrophorese in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel ihrer Länge nach geordnet und so ihr Molekulargewicht bestimmt werden. Typischerweise wird DNA in einem Gel durch spezifische Färbung (normalerweise Ethidiumbromid) und Betrachtung des Gels im durchgelassenen Ultraviolettlicht identifiziert. Die Stellen der DNA-Lokalisierung sind rot gefärbt. Beim Menschen entstehen jedoch bei der Verarbeitung von DNA durch mehrere Restriktionsenzyme so viele Fragmente unterschiedlicher Länge, dass sie durch Elektrophorese nicht getrennt werden können, d. h. es ist nicht möglich, einzelne DNA-Fragmente bei der Elektrophorese visuell zu identifizieren (es wird eine gleichmäßige Färbung über die gesamte Länge des Gels erzielt). Daher wird zur Identifizierung der gewünschten DNA-Fragmente in einem solchen Gel die Hybridisierungsmethode mit markierten DNA-Sonden verwendet.

Jedes einzelsträngige DNA- oder RNA-Segment kann an einen komplementären Strang binden (hybridisieren), wobei Guanin stets an Cytosin und Adenin an Thymin bindet. Auf diese Weise entsteht ein doppelsträngiges Molekül. Markiert man eine einzelsträngige Kopie eines geklonten Gens mit einem radioaktiven Marker, erhält man eine Sonde. Die Sonde kann ein komplementäres DNA-Segment finden, das dann mittels Autoradiographie leicht identifiziert werden kann. Wird einem Präparat aus gestreckten Chromosomen eine radioaktive Sonde hinzugefügt, kann das Gen auf einem bestimmten Chromosom lokalisiert werden: Mithilfe einer DNA-Sonde lassen sich beim Southern Blotting bestimmte Bereiche identifizieren. Eine Hybridisierung erfolgt, wenn der untersuchte DNA-Abschnitt ein normales Gen enthält. Liegt eine abnorme Nukleotidsequenz vor, d. h. die entsprechenden Chromosomenstrukturen enthalten ein mutiertes Gen, findet keine Hybridisierung statt, wodurch die Lokalisierung des pathologischen Gens bestimmt werden kann.

Zur Gewinnung von DNA-Sonden wird die Genklonierungsmethode verwendet. Der Kern der Methode besteht darin, dass ein DNA-Fragment, das einem Gen oder einem Genabschnitt entspricht, in ein Klonierungspartikel, üblicherweise ein bakterielles Plasmid (ringförmige extrachromosomale DNA, die in Bakterienzellen vorkommt und Antibiotikaresistenzgene trägt), eingefügt wird. Anschließend werden die Bakterien mit dem Plasmid mit dem eingefügten menschlichen Gen vermehrt. Dank der Syntheseprozesse im Plasmid können Milliarden von Kopien des menschlichen Gens oder seines Abschnitts gewonnen werden.

Die resultierenden DNA-Kopien, die mit einem radioaktiven Marker oder Fluorochrome markiert sind, werden dann als Sonden verwendet, um im untersuchten Pool von DNA-Molekülen nach komplementären Sequenzen zu suchen.

Derzeit gibt es viele verschiedene Methoden, bei denen DNA-Sonden zur Diagnose von Genmutationen eingesetzt werden.

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