Mesenchymale Stammzellen

Unter den regionalen Stammzellen nehmen mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen besonderen Platz ein, dessen Derivate die Stroma-Matrix aller Organe und Gewebe des menschlichen Körpers bilden. Priorität in der Forschung von MSC gehört Vertretern der russischen biologischen Wissenschaft.

In der Mitte des letzten Jahrhunderts im Labor von Friedenstein wurde erstmals homogene Kultur von multi Stromatumoren Knochenmarkstammzellen isoliert. Mesenchymalen Stammzellen an ein Substrat für eine lange Zeit beibehalten befestigt eine hohe Proliferationsrate, und Kulturen bei niedriger Einsaatdichte nach der Fixierung auf einem Substrat aus Fibroblasten-Zellklonen gebildet keine phagozytische Aktivität. MSCs Proliferation Stopp beendet ihre spontane Differenzierung in vitro in Knochenzellen, Fett, Knorpel, Muskel oder Bindegewebe. Weitere Untersuchungen zeigten osteogenes Potenzial von Fibroblasten-ähnlichen Stromazellen des Knochenmarks von verschiedenen Arten von Säugetieren, sowie die koloniebildende Aktivität. In Experimenten in vivo wurde gezeigt, dass sowohl Hetero- und orthotope Transplantation von Fibroblasten-koloniebildende Zelle abgeschlossen bildet Knochen, Knorpel und faserige Fettgewebes. Da die stromale Stammzellen des Knochenmarks durch eine hohe Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung von Kontra innerhalb der gleichen Zelllinie gekennzeichnet, dass sie multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen bezeichnet.

Es ist anzumerken, dass seit 45 Jahren Grundlagenforschung an mesenchymalen Stammzellen reale Bedingungen für den Einsatz ihrer Derivate in der klinischen Praxis geschaffen wurden.

Heute besteht kein Zweifel, dass alle Gewebe des menschlichen Körpers aus den Stammzellen verschiedener Zelllinien als Folge von Proliferation, Migration, Differenzierung und Reifung entstehen. In jüngerer Zeit wurde jedoch angenommen, dass Stammzellen im Körper des Erwachsenen gewebespezifisch sind, das heißt, sie können nur spezialisierte Zelllinien der Gewebe herstellen, in denen sie sich befinden. Diese konzeptuelle Situation wurde durch die Tatsache der Transformation von hämatopoetischen Stammzellen nicht nur in zelluläre Elemente des peripheren Blutes, sondern auch in ovale Leberzellen widerlegt. Darüber hinaus waren neurale Stammzellen in der Lage, sowohl Neuronen als auch gliale Elemente sowie früh festgelegte Linien von hämatopoetischen Vorläuferzellen hervorzurufen. Im Gegenzug können mesenchymale Stammzellen, die normalerweise zelluläre Elemente aus Knochen, Knorpel und Fettgewebe produzieren, in neurale Stammzellen umgewandelt werden. Es wird angenommen, dass im Prozess des Wachstums, der physiologischen und reparativen Geweberegeneration, nicht gebundene Vorläuferzellen aus gewebespezifischen Stammreserven erzeugt werden. Zum Beispiel kann die Muskelgewebereparatur durch mesenchymale Stammzellen realisiert werden, die aus dem Knochenmark in die Skelettmuskulatur wandern.

Obwohl eine solche Quer Austauschbarkeit Stammzellen die Möglichkeit der klinischen Verwendung der mesenchymalen Stammzellen als Quelle für die Zelltransplantation und Zell Vektor der genetischen Information nicht alle Forscher erkennen nicht als multi Stromazellen des Knochenmarks-Stammzellen umstritten, die relativ leicht sein kann, isolieren und zu propagieren in Kultur in vitro. Zur gleichen Zeit in der wissenschaftlichen Literatur immer wieder Berichte über das Potenzial von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks Stroma erscheinen. Als Beweis präsentierte Forschungsprotokolle, die unter dem Einfluss von spezifischen Induktoren von transdifferentiation von MSCs umgewandelt werden in Nervenzellen, Kardiomyozyten und Hepatozyten. Bei einigen Wissenschaftlern ist jedoch die Möglichkeit der Reaktivierung und Expression von Genen der frühen Embryogenese höchst fraglich. Zugleich versteht jeder, dass, wenn die Bedingungen, die multipotente mesenchymale Stammzellen Pluripotenz von WSR in der regenerativen Medizin und Kunststoff automatisch aufgelöst viele Probleme der ethischen, moralischen, religiösen und rechtlicher Art erweitern gefunden. Ferner wird in diesem Fall, da die Quelle der Stammregenerationsfähigkeit des Patienten autologe Stromazellen sind gelöst und das Problem der Immunabstoßung von Zelltransplantation. Wie real diese Aussichten sind, wird die nahe Zukunft zeigen.

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Verwendung von mesenchymalen Stammzellen in der Medizin

Die Klinik Einsatz von Derivaten von mesenchymalen Stammzellen ist in erster Linie verursacht mit der Reduzierung von Gewebedefekten verbunden ist durch umfangreiche und tiefe thermische Schädigungen der Haut. Präklinische experimentelle Bewertung der Angemessenheit der allogenen Fibroblasten-ähnliche mesenchymale Stammzellen für die Behandlung von tiefen Verbrennungen durchgeführt. Es wird gezeigt , dass die Fibroblasten-ähnliche Knochenmark mesenchymale Stammzellen eine einschichtige in der Kultur bilden, die es ermöglicht , sie verpflanzen die Regeneration von tiefen Brandwunden zu optimieren. Die Autoren weisen darauf hin, dass embryonale Fibroblasten eine ähnliche Eigenschaft besitzen, deren klinische Anwendung jedoch durch bestehende ethische und rechtliche Probleme begrenzt ist. Eine tiefe thermische Verbrennung mit Schäden an allen Schichten der Haut wurde Wistar-Ratten nachempfunden. Die Fläche der Verbrennung betrug 18-20% der gesamten Hautoberfläche. Die erste experimentelle Gruppe umfasste Ratten mit tiefer thermischer Verbrennung und Transplantation von allogenen fibroblastenähnlichen mesenchymalen Stammzellen. Die zweite Gruppe bestand aus Tieren mit einer tiefen thermischen Verbrennung und der Transplantation allogener embryonaler Fibroblasten. Die dritte Gruppe bestand aus Kontrollratten mit einer tiefen thermischen Verbrennung, die keine Zelltherapie durchführten. Eine Suspension von Fibroblasten stammenden mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten wurde einen Brandwundenoberfläche in einer Menge von 2 × 10 pipettiert angewandt ⁴ Zellen am 2. Tag nach der Exzision von burn Modellierung und nekrotischen Schorf gebildet. Nach der Zelltransplantation wurde die Verbrennungsoberfläche mit einem mit einer isotonischen Natriumchloridlösung mit Gentamycin befeuchteten Gazetuch bedeckt. Fence Knochenmarkszellen MSCs mit anschließender Induktion von Fibroblasten - Linie in mesenchymalen Stammzellen in erwachsenen Wistar - Ratten aus der Oberschenkel- hergestellt zu erhalten. Embryonale Fibroblasten wurden aus den Lungen von 14 bis 17 Tage alten Embryonen erhalten. Embryonale Fibroblasten und Knochenmarkszellen , ein Pre-MSCs wurde kultiviert in Petrischalen bei 37 ° C in einem C02 iikubatore, in einer Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 95% Feuchtigkeit zu erhalten. Embryonale Fibroblasten wurden für 4-6 Tage kultiviert, während für die Bildung einer Monoschicht von MSC 14 bis 17 Tage benötigt wurden. Anschließend MSCs durch Kryokonservierung als Ausgangsmaterial für Fibroblasten abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen gehalten , die durch Auftauen und Züchten MSCs für 4 Tage hergestellt. Anzahl von fibroblasten erzeugten mesenchymalen Stammzellen ist mehr als 3 - mal die Anzahl der embryonalen Fibroblasten während des gleichen Kulturperiode entstehen. Zur Identifizierung von Zellen in transtslantirovannyh Wunden in Schritt verbrennen ihr Genom Kulti markierten Vektor unter Verwendung von viralen Shuttle auf der Basis eines rekombinanten Adenovirus Typ V Träger 1AS-2 codierendes Gen ß-Galactosidase E. Coli. Lebende Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation wurden immunhistochemisch in Kryoschnitten unter Zugabe von X-Gal-Substrat nachgewiesen, was eine charakteristische blau-grüne Färbung ergibt. Als Ergebnis der visuellen Dynamik, planimetrische und histologischer Auswertung Zustand von Brandwunden, wurde es , dass auch am 3. Tag nach der Transplantation der Zellen in isolierten Gruppen erscheinen signifikante Unterschiede bei Wundheilungsprozess gefunden. Besonders ausgeprägt wurde dieser Unterschied am 7. Tag nach der Zelltransplantation. Die Tiere der ersten Gruppe, die Fibroblasten-ähnlichen mesenchymalen Stammzellen transplantiert wurden, erworben Wunde gleichmäßig rosig intensive Farbe, Granulationsgewebe über ihre gesamte Fläche auf der Ebene der Epidermis aufgewachsen, und Brennen die Oberfläche erheblich in der Größe verringert wird. Der auf der Oberfläche der Wunde gebildete Kollagenfilm war etwas dünner, aber er bedeckte weiterhin den gesamten Verbrennungsbereich. Die Tiere der zweiten Gruppe, die embryonalen Fibroblasten transplantiert wurden, wird Granulationsgewebe auf das Niveau der Oberhaut der Wundränder angehoben, sondern nur an einigen Stellen, die gleichzeitig plazmoreya aus der Wunde war intensiver als in Gruppe 1, und anfänglich gebildeter Kollagenfilm praktisch verschwunden. Bei Tieren, die keine Zelltherapie erhielten, war die Verbrennungswunde am 7. Tag ein blasses, gegrabenes, nekrotisches Gewebe, das mit Fibrin bedeckt war. Plasmoorrhea wurde überall auf der Brandoberfläche festgestellt. Histologisch, die Tiere der 1. Und 2. Gruppe eine Abnahme der zellulären Infiltration und Entwicklung des Gefäßsystems zeigte, diese Zeichen der beginnenden Regenerator Verfahren wurden in den Ratten in Gruppe 1 schwerer gewesen. In der Kontrollgruppe gab es Anzeichen einer zellulären Infiltration der Wunde, das histologische Muster der neu gebildeten Gefäße fehlte. 15-30 th Tag der Beobachtung der Tiere der ersten Gruppe Bereich burn Oberfläche war deutlich geringer als bei den Ratten von anderen Gruppen und Granulationsfläche war mehr entwickelt. Bei den Tieren der zweiten Brenn Oberfläche Gruppe ist auch mit der Größe von Brandwunden in der Kontrollgruppe von Ratten sanken im Vergleich , das aufgrund der marginalen epithelization war. In der Kontrollgruppe burn Oberflächenstellen blieb blass Körnungen mit seltenen, erscheinen darauf Äderchen, Inselchen fibrinöses Plaque weiterhin moderat plazmoreya über burn Oberfläche, was blieb , waren schwer lösbare Schorf ist. Im Allgemeinen reduzierten die Tiere der dritten Gruppe auch die Größe der Wunde, aber die Wundränder blieben hinterschnitten.

Somit wird während einer vergleichenden Studie von Wundheilungsraten Fibroblasten stammendes mesenchymalen Stammzellen und fötale Fibroblasten verwendet wird, und ohne die Verwendung von Zelltherapie Beschleunigung der Heilung von Verbrennungen Oberfläche als Ergebnis der Transplantation von Fibroblasten stammenden mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten gekennzeichnet. Jedoch war im Fall der Verwendung von allogenen mesenchymalen Stammzellen von Fibroblastenwundheilungsrate höher als bei der Transplantation von embryonalen Fibroblasten. Dies manifestierte Veränderung der Regenerationsphasen des Prozesses bei der Beschleunigung - zelluläre Infiltration Perioden zu reduzieren, erhöht die Geschwindigkeit der Proliferation vaskulärer Netzwerk sowie die Bildung von Granulationsgewebe.

Die Ergebnisse der dynamischen Planimetrie zeigen, dass die Rate der spontanen Wundheilung (ohne Zelltherapie) am niedrigsten war. Am 15. Und 30. Tag nach der Transplantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen von Fibroblasten Wunde Heilungsrate war höher als bei der Transplantation von embryonalen Fibroblasten. Histochemische Verfahren zum Nachweis von Beta-Galactosidase zeigte, dass während des gesamten Beobachtungszeitraum Fibroblasten-ähnlichen mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten auf der Oberfläche und tiefen regenerierenden Zellen Wunden transplantiert lebensfähig bleiben nach der Transplantation von. Die Autoren schlagen vor, dass eine höhere Rate von Brandwunden Regeneration rostostimuliruyushih bioaktiven Faktoren mesenchymalen Stammzellen von Fibroblasten-konditionierte Freisetzung durch diese Zellen während der Reifung mit.

Transplantation autologer oder allogener Keratinozyten und allogenen Fibroblasten zur Behandlung von Brandwunden und in der Klinik eingesetzt. Es soll beachtet werden, dass die chirurgische Behandlung von Kindern mit umfangreichen tiefen Verbrennungen aufgrund der hohen Vielzahl von Trauma und chirurgischen Eingriffen erheblichen Blutverlust ist eine komplizierte Aufgabe, auf den verschiedenen Reaktionen Infusionsmedien verwendet. Die Hauptschwierigkeiten bei der Umsetzung der Haut und die plastischen Chirurgie mit ausgedehnten tiefen Verbrennungen, mehr als der Bereich 40% der Körperoberfläche, aufgrund der Schwere ihres Zustandes und der Mangel an Ressourcen von Spenderhaut. Die Verwendung von Mesh-Grafts mit einem Verhältnis großer Perforation löst nicht das Problem, da das Bild nach epiteliziruyutsya Zelle Perforation sehr langsam, und oft tut Hauttransplantationen lysiert werden oder trocken. Solche Beschichtungen Wunden wie ksenokozha, cadaveric Allotransplantate verbrennen, sind synthetische Filmbeschichtungen nicht immer ausreichend wirksam, so dass die Entwicklung neuer Methoden zur Schließung von burn Oberflächenschichten von kultivierten Keratinozyten und Fibroblasten. Insbesondere ist ein Verfahren unter Verwendung von kultivierten Brennflächen allofibroblastov des Schließens während der Transplantation bietet ausgeprägte stimulierende Wirkung auf der Proliferation epidermotsitov in der Wunde Grenze bei Verbrennungen erhalten und in Keratinozyten-Transplantate Gitterbahnen. Im Budkevich L. Et al (2000) zeigt die Ergebnisse dieses Verfahrens für die Behandlung von Verbrennungen bei Kindern angewendet wird. 31 Kinder mit thermischen Traumata im Alter zwischen 1 und 14 Jahren wurden beobachtet. Bei drei Kindern Gesamtfläche Wunden IIIA-B brennen - IV Grad betrug 40%, 25 - 50-70%, auch auf dem drei - 71-85% der Körperoberfläche. Frühe chirurgische necrectomy mit der Transplantation von kultivierten allofibroblastov und autodermaplasty kombiniert. In der ersten Stufe der Behandlung wurde nekrotisches Gewebe Exzision durchgeführt, die zweiten - auf der Transplantation von kultivierter allofibroblastov Trägerfolie, die dritten (48 Stunden nach der Transplantation von kultivierter allofibroblastov) - Entfernung der Matrix und Hautlappen mit autodermoplasty Perforierung Verhältnis von 1: 4. Drei Patienten ins Krankenhaus mit schweren Verbrennungen Krankheit zugelassen, kultiviert allofibroblasty wurden auf Granulieren Wunden transplantiert. Die Transplantation von kultiviertem allofibroblastov einmal durchgeführt in 18 Kindern, zweimal - bei 11, 3 bis 2 Patienten. Die Fläche der Wundoberfläche, die von der Zellkultur bedeckt wurde, betrug 30 bis 3500 cm². Die Wirksamkeit von kultiviertem allofibroblastov ausgewertet durch den Gesamtanteil der Verpflanzung von Hautlappen, die Zeit der Heilung von Verbrennungen und die Zahl der Todesfälle starke thermische Schädigung. Die Transplantattransplantation war bei 86% der Patienten abgeschlossen. Ein teilweises Nichtauftreten von Hautlappen wurde in 14% der Fälle festgestellt. Trotz fortlaufender Behandlung starben sechs (19,3%) Kinder. Die gesamte Hautläsion in ihnen betrug 40 bis 70% der Körperoberfläche. Die Transplantation von kultivierten allofibroblastov hatte keinen Zusammenhang mit dem Tod von Brandverletzungen ein einzelner Patienten.

Die Analyse der Ergebnisse der Behandlung, die Autoren, dass die bisherigen Verbrennungen mit dem Leben unvereinbar, tiefe thermische Schädigung der Haut Bereich von 35-40% der Körperoberfläche zu behandeln (für kleine Kinder - bis zu 3 Jahren - sind entscheidend tiefe Verbrennungen mit einer Fläche von 30%, für ältere Kinder Alter - über 40% der Körperoberfläche). Wenn die chirurgische Transplantation von kultiviertem necrectomy allofibroblastov autodermaplasty und anschließenden Hauttransplantationen mit großen Verbrennungen, Durchdringungsfaktor IIIB - IV Grad bleiben kritisch, aber im Moment gibt es Aussichten in vielen Fällen das Leben sogar solche Opfer zu retten. Chirurgische necrectomy in Verbindung mit der Transplantation von kultivierten allofibroblastov und autodermaplasty bei Kindern mit tiefen Verbrennungen erwies sich als besonders wirksam bei Patienten mit einem Defizit von Spenderstellen mit fortgeschrittenen Läsionen der Haut sein. Aktive chirurgische Taktik und Umpflanzen kultiviert allofibroblastov fördern die schnelle Stabilisierung des Allgemeinzustandes von solchen Patienten, die Verringerung der Zahl der infektiösen Komplikationen der Verbrennungskrankheit, die Schaffung günstiger Bedingungen für die Verpflanzung, reduzieren die Zeit, die verlorene Haut und die Dauer der Krankenhausbehandlung wieder herzustellen, die Häufigkeit der Todesfälle bei Patienten mit ausgedehnten Verbrennungen zu reduzieren. So Transplantation von kultivierten allofibroblastov gefolgt autodermaplasty Hautlappen Erholung bei Kindern mit schweren Verbrennungen erreicht, die bisher zum Scheitern verurteilt angesehen wurden.

Es ist weithin anerkannt, dass das Hauptziel der Behandlung einer Verbrennungskrankheit darin besteht, die vollständige und schnelle Wiederherstellung geschädigter Haut zu maximieren, um die resultierenden toxischen Wirkungen, infektiösen Komplikationen und Austrocknung des Körpers zu verhindern. Die Ergebnisse der Anwendung von kultivierten Zellen hängen weitgehend von der Bereitschaft zur Transplantation der Verbrennungswunde selbst ab. In Fällen der Transplantation von kultivierten Keratinozyten überleben 55% (Fläche) der transplantierten Zellen auf der Wundoberfläche nach chirurgischer Necrektomie, wohingegen bei Transplantationswunden die Transplantationsrate auf 15% reduziert wird. Daher erfordert eine erfolgreiche Behandlung von ausgedehnten tiefen Hautverbrennungen in erster Linie eine aktive chirurgische Taktik. In Gegenwart von Brandwunden Grad IIIB-IV wird die Brandoberfläche sofort von nekrotischem Gewebe freigesetzt, um die Auswirkungen der Intoxikation zu reduzieren und die Anzahl der Komplikationen der Brandkrankheit zu reduzieren. Die Anwendung solcher Taktiken ist der Schlüssel zur Verkürzung der Zeit von der Verbrennung bis zur Schließung der Wunden und der Verweildauer von Patienten mit ausgedehnten Verbrennungen im Krankenhaus und auch zur deutlichen Reduzierung der Todesfälle.

Die ersten Berichte über die erfolgreiche Verwendung von kultivierten Keratinozyten zur Abdeckung der Brandoberfläche erschienen in den frühen achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts. Anschließend wurde diese Manipulation mit Hilfe von Schichten kultivierter Keratinozyten durchgeführt, die am häufigsten aus Autostrukturen, viel seltener aus Allokeratinozyten, erhalten wurden. Die Technik der Autokeratiozytoplastik erlaubt jedoch nicht die Schaffung einer Zellbank, während die Zeit, die benötigt wird, um ein ausreichendes Transplantat aus Keratinozyten herzustellen, groß ist und 3-4 Wochen beträgt. Während dieser Zeit steigt das Risiko der Entwicklung von infektiösen und anderen Komplikationen der Verbrennungskrankheit stark an, was die Gesamtaufenthaltsdauer der Patienten im Krankenhaus signifikant verlängert. Außerdem überleben Autokeratinocyten praktisch nicht, wenn sie in granulierende Brandwunden transplantiert werden, und die hohen Kosten spezieller Wachstumsmedien und biologisch aktiver Keratinocytenwachstumsstimulantien begrenzen ihre klinische Anwendung signifikant. Andere biotechnologische Verfahren, wie die Kollagenoplastik, die Transplantation von kryokonservierten Xenoiden und die Verwendung verschiedener Biopolymerbeschichtungen erhöhen die Wirksamkeit der Behandlung von großflächigen, aber nicht tiefen Verbrennungen. Das Verfahren zur Beschichtung der Wundoberfläche mit kultivierten Fibroblasten unterscheidet sich fundamental dadurch, dass die Hauptkomponente des kultivierten Zellpools nicht Keratinozyten, sondern Fibroblasten sind.

Eine Voraussetzung für die Entwicklung des Verfahrens dienten als Beweis dafür , dass Perizyten, die die kleinen Gefäße sind pro- genitornymi mesenchymalen Zellen in der Lage zu verwandeln sich in Fibroblasten, die viele Wachstumsfaktoren produzieren und liefern die Wundheilung durch die starke stimulierende Wirkung auf die Proliferation und Adhäsion von Keratinozyten umgeben. Verwendung von kultivierten Fibroblasten zur Wundschließfläche unmittelbar identifizierte eine Reihe signifikanter Vorteile dieses Verfahrens gegenüber der Verwendung von kultivierten Keratinozyten. Insbesondere erfordert die Herstellung von Fibroblasten in Kultur nicht die Verwendung von speziellen Kulturmedien und Wachstumsförderer, die die Kosten der Transplantation mehr als 10 mal die Kosten für den Erhalt Keratinozyten reduziert. Fibroblasten sind leicht zu Passagierung unterzogen, bei denen sie ihre Oberfläche Histokompatibilitatsantigene teilweise verlieren, was wiederum macht es möglich , für die Herstellung von allogenen Transplantationen von Zellen zu verwenden und ihre Banken erstellen. Verkürzt Empfang Transplantationen, bereit für den Einsatz in einer Klinik von 3 Wochen (Keratinozyten) 1-2 Tage (für Fibroblasten). Primärkulturen von Fibroblasten können an autodermoplasty und Zellaussaatdichte bei Empfang Subkulturen von humanen Fibroblasten genommen durch Kultivieren von Zellen aus Hautfragmenten erhalten werden , ist nur 20 × 10 ³ pro 1 cm ².

Zur Untersuchung der Wirkung von Fibroblasten und ihre regulatorischen Proteinen in der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten, eine vergleichenden Analyse der Eigenschaften und die Morphologie der Keratinozyten-Proliferation auf Substraten aus Kollagen Typ I und III und Fibronektin in Kokultur mit humanen Fibroblasten. Humane Keratinozyten wurden aus Fragmenten der Haut von Patienten mit Verbrennungen, die während der Operation der Autodermoplastik entnommen wurden, isoliert. Die Dichte der Keratinozyten betrug 50 x 10³ Zellen pro cm². Die klinische Wirksamkeit der Transplantation von kultivierten Fibroblasten wurde in 517 Patienten ausgewertet. Alle Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt: 1. - Erwachsene mit Verbrennungen betroffen IIA, B - IV Grad; 2. - Kinder mit tiefen Verbrennungen von IIIB - IV Grad. Beurteilung der Dynamik der strukturellen und funktionellen Organisation der Monoschichtkultur von Fibroblasten in Bezug auf die Rolle bei der Regeneration von Glykosaminoglykanen, Fibronektin, Kollagen und erlaubt die Autoren der dritte Tag, als die günstigsten Bedingungen der Verwendung von Fibroblasten-Kulturen für die Herstellung von Transplantaten zu bestimmen. Untersuchung der Auswirkungen auf dem Fibroblasten-Proliferation und die Differenzierung von Keratinozyten zeigte, dass unter in vitro-Fibroblasten eine ausgeprägte stimulierende Wirkung, vor allem auf Keratinozyten-Adhäsionsvorgänge, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu erhöhen und die Rate mehr als 2 mal die Befestigung. Die Stimulation der Adhäsionsprozesse wird begleitet von einer Erhöhung der Intensität der DNA-Synthese und dem Grad der Proliferation der Keratinozyten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von Fibroblasten und der extrazellulären Matrix von ihnen gebildeten eine Voraussetzung für die Bildung ist tonofibrillyarnogo Vorrichtung Keratinozyten interzellularen Verbindungen und letztlich für Keratinozyten-Differenzierung und Basalmembran Bildung. Bei der Behandlung von Kindern mit tiefen Verbrennungen etablierten klinische Wirksamkeit der Transplantation allofibroblastov Kultur, vor allem bei Patienten mit ausgedehnten Läsionen der Hautentnahmestellen in einem Defizite. Komplex morfofunktcionalnoe Studie zeigte, dass Transplantats gekennzeichnet Fibroblasten aktive DNA-Synthese, sowie Kollagen, Fibronektin und Glycosaminoglycane, die in den Zellen von der extrazellulären Matrix erzeugt werden. Die Autoren schlagen vor, einen hohen Anteil an Verpflanzung von transplantierten Fibroblasten (bis 96%), eine scharfe Verringerung hinsichtlich ihrer Vorbereitung (innerhalb von 2-3 Stunden statt 24 bis 48 Wochen im Fall von Keratinozyten), eine wesentlichen Beschleunigung der Epithelisierung der Brennoberfläche und eine deutliche Reduzierung des Preises (in 10 Zeiten) der Technologie des Wachstums des Transplantats aus Fibroblasten im Vergleich zur Keratinozytentransplantation. Die Verwendung der Transplantation von kultivierter allofibroblastov ermöglicht es, das Leben von Kindern mit kritischen Verbrennungen zu speichern - thermischer Schädigung mehr als 50% der Körperoberfläche, die zuvor mit dem Leben nicht vereinbar gedacht. Es ist bemerkenswert, dass die allogene Transplantation von embryonalen Fibroblasten auch überzeugend nicht nur einer schnellere Regeneration von Wunden und Rekonvaleszenz Patienten mit verschiedenem Grad und Bereich, sondern auch eine deutliche Reduzierung der Sterblichkeit unter Beweis gestellt.

Autologe Fibroblasten wird in solch komplizierten und plastischen Chirurgie als Ersatz Korrektur Schaden der Stimmbänder verwendet. In der Regel für diesen Zweck verwendet Rinder-Kollagen, Dauer der Wirkung, die durch seine Immunogenität begrenzt ist. Als ein fremdes Protein, Rinder-Kollagen, Kollagenase empfindlich auf den Empfänger und können Immunreaktionen auslösen, um das Risiko zu verringern, die die Technologie von Kollagenpräparaten entwickelt wurde, mit Glutaraldehyd vernetzt ist. Ihr Vorteil ist eine größere Stabilität und niedrigere Immunogenität, die praktische Anwendung in der Beseitigung von Mängeln und Stimmband Atrophie gefunden hat. Injektionen von autologen Kollagen wurden erstmals im Jahr 1995 verwendet. Verfahren vorgesehen Konservierung der Primärstruktur von autologem Kollagenfasern, einschließlich enzymatisch katalysierten intramolekularen Vernetzungen. Die Tatsache, dass die natürliche Kollagenfasern beständiger gegen Abbau durch Proteasen sind als rekonstituierten Kollagen-Telopeptide wobei geschnitten. Integrität Telopeptide wichtig für die Quartärstruktur der Kollagenfasern und die Vernetzung zwischen benachbarten Kollagenmolekülen. Im Gegensatz zu Präparaten aus Rinderkollagen, autologem Kollagen verursacht keine Immunreaktionen im Empfänger, aber es ist nicht ausreichend wirksam als Mittel füllt. Anhaltende Korrektur kann durch lokale Produktion von Kollagen durch autologe Fibroblastentransplantation erreicht werden. Allerdings ergab die Untersuchung der Wirksamkeit der Transplantation autologer Fibroblasten in der Klinik einige Schwierigkeiten. In der ersten Zeit nach dem klinischen Wirkung Fibroblasten-Transplantation war schwächer als nach der Verabreichung von Rinder-Kollagen verglichen. Wenn kultivierte autologe Fibroblasten nicht die Möglichkeit der Umwandlung von normalen Fibroblasten in abnormal ausschließen kann, die so genannten Myofibroblasten, verantwortlich für die Entwicklung der Fibrose und Vernarbung, wie durch die Verringerung der Kollagen-Gel nachgewiesen, aufgrund der spezifischen Wechselwirkung von Fibroblasten und Kollagenfibrillen. Darüber hinaus verlieren Fibroblasten nach der seriellen Passage in vitro die Fähigkeit, extrazelluläre Matrixproteine zu synthetisieren.

Nichtsdestotrotz wurde zur Zeit die Technik der Kultivierung von autologen humanen Fibroblasten experimentell eliminiert, wobei die obigen Nachteile beseitigt wurden und keine onkogene Transformation von normalen Fibroblasten erfolgte. Mit diesem Verfahren erhaltene autologe Fibroblasten werden verwendet, um die Defekte der Weichteile des Gesichts zu füllen. In einer Studie von H. Keller und Koautoren (2000) wurden 20 Patienten im Alter von 37 bis 61 Jahren mit Falten und atrophischen Narben behandelt. Hautbiopsien (4 mm) BTE Region, die wir in sterilen Röhrchen zum Labor transportiert, die 10 ml Kulturmedium (Dulbecco Antibiotikum mikoseptikom, Pyruvat und fötalen Rinderserum). Das Material wurde in 3-5 Kulturschalen mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben und in einem Thermostat mit einer Atmosphäre, die 5% CO 2 enthielt, inkubiert. Nach 1 Woche wurden die Zellen durch Trypsinierung von den Schalen entfernt und in 25 cm 2 -Fläschchen gegeben. Die Zellen werden in einer Menge von 4 x 107. Die signifikante und lang anhaltenden klinische Wirkung an Patienten verabreicht wurde bei Patienten mit Korrektur Nasolabialfalten beobachtet, und bei Patienten mit Narben nach 7 und 12 Monaten nach der dritten Transplantation autologer Fibroblasten. Laut Durchflusszytometrie produzierten kultivierte Fibroblasten eine große Menge an Typ-I-Kollagen. In vitro-Studien zeigen die normale Kontraktilität von injizierbaren Fibroblasten. Zwei Monate nach subkutaner Verabreichung von kultivierten Fibroblasten in einer Dosis von 4 · 10 Zellen wurden Nacktmäuse nicht nachgewiesen. Injizierbare Fibroblasten verursachten bei Patienten keine Narbenbildung und diffuse Fibrose. Nach Ansicht des Autors können die implantierten autologen Fibroblasten ständig Kollagen produzieren, was eine kosmetische Verjüngung bewirkt. Da in diesem Fall die Lebensdauer von differenzierten Zellen begrenzt ist, sind Fibroblasten, die von einem jungen Patienten entnommen werden, wirksamer als diejenigen, die bei älteren Menschen erhalten werden. In der Zukunft wird angenommen, dass die Möglichkeit der Kryokonservierung einer Fibroblastenkultur, die von einem jungen Spender stammt, später zu einem älteren Patienten seine eigenen jungen Zellen transplantiert. Zusammenfassend ist es nicht völlig richtig, dass autologe Fibroblasten unter der Bedingung ihrer funktionellen Erhaltung das ideale Mittel zur Korrektur von Defekten in den Weichteilen des Gesichts sind. Gleichzeitig stellt der Autor selbst fest, dass im Verlauf der Forschung auch einige problematische Situationen im Zusammenhang mit der Verwendung eines autologen Fibroblasten-Kollagen-Systems aufgetreten sind. Der klinische Effekt war oft schwächer als bei der Verwendung von Rinderkollagen, was bei Patienten zu Enttäuschungen führte.

Im Allgemeinen sind die Literaturdaten zu den Aussichten einer klinischen Anwendung mesenchymaler Stammzellen recht optimistisch. Es wird versucht, autologe multipotente mesenchymale Vorläuferzellen des Knochenmarks zur Behandlung von degenerativen Gelenkläsionen zu verwenden. Die ersten klinischen Versuche mit kultivierten mesenchymalen Vorläuferzellen bei der Behandlung von komplexen Knochenbrüchen werden durchgeführt. Autologe und allogene mesenchymale Stromazellen des Knochenmarks-Zellen verwendet, um Knorpelgewebe für die Transplantation in der Korrektur der Gelenkknorpeldefekten aufgrund von Trauma oder Autoimmunläsionen zu erzeugen. Praktizierten Verfahren der klinischen Anwendung von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen von Knochendefekten bei Kindern mit schweren Osteogenesis Fortschritt durch Mutationen von Typ-I-Kollagen-Gen verursacht zu korrigieren. Nach mieloabelyatsii Kinder-Empfänger von transplantierten Knochenmark von HLA-kompatiblen gesunden Spender als unfraktioniertes Knochenmark eine ausreichende Menge an mesenchymalen Stammzellen enthalten kann zu schweren Knochendefekt aufzufüllen. Nach der Transplantation von allogenem Knochenmark hatten solche Kinder positive histologische Veränderungen der Trabekelknochen, eine Zunahme der Wachstumsgeschwindigkeit und eine Verringerung der Häufigkeit von Knochenfrakturen. In einigen Fällen wird ein positives klinisches Ergebnis erzielt, indem eng verwandte Knochenmark und Osteoblasten transplantiert werden. Zur Behandlung der angeborenen Brüchigkeit von Knochen aufgrund eines Ungleichgewichts von Osteoblasten und Osteoklasten in Knochengewebe wird auch MSK-Transplantation verwendet. Die Wiederherstellung der Knochenbildung in diesem Fall wird durch die Chimärisierung des Pools von Stamm- und Vorläufer-Stromazellen im Knochengewebe von Patienten erreicht.

Die Methoden zur genetischen Veränderung von Spender-Mesenchym-Stammzellen werden verbessert, um genetische Defekte von Stromageweben zu korrigieren. Es wird angenommen, dass mesenchymale Stammzellen wird in Kürze in der Neurologie zur Richtungs Chimerisierung Gehirnzellen verwendet werden und einen Pool von gesunden Zellen erzeugen können defizientes Enzym oder Faktor verantwortlich für die klinischen Manifestationen der Krankheit zu schaffen. Die Transplantation von mesenchymalen Stammzellen kann verwendet werden, um Knochenmarkstroma bei Krebspatienten nach Radio- und Chemotherapie und in Kombination mit Knochenmarkzellen wiederherzustellen - um die Hämopoese wiederherzustellen. Entwicklung der Substitutionstherapie bei der Beseitigung der Mängel des Muskel-Skelett-Systems richtet MSCs fördern Engineering in der Design-Matrix Biomaterialien oder biomimics bilden Skelette bewohnen die Nachkommen von mesenchymalen Stammzellen.

Quellen von mesenchymalen Stammzellen

Die Hauptquelle der mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks hämatopoetischen Stammzellen, die in Säugetieren ständig in Blutzellen zu differenzieren und das Immunsystem, während die mesenchymalen Stammzellen kleine Populationen von Fibroblasten-ähnlichen Knochenmarkstromazellen vorgestellt und helfen, den undifferenzierten Zustand der hämatopoetischen Stammzellen aufrechtzuerhalten. Unter bestimmten Bedingungen unterscheiden mesenchymalen Stammzellen in Zellen von Knorpeln und Knochen. Wenn sie auf einem Kulturmedium in niedrigen Dichte Anpflanzung mononukleären Knochenmark-Stromazellen plattierten bilden Kolonien von adhärenten Zellen, die in der Tat, Fibroblasten multi mesenchymalen Vorläuferzellen sind. Einige Autoren haben vorgeschlagen, dass Knochenmark nicht gebundenen mesenchymalen Stammzellen abgelagert, die dank der Fähigkeit zur Selbsterneuerung und hohe Differenzierungspotenzial, bieten alle Gewebe des Körpers Vorgänger mesenchymalen Stromazellen während des gesamten Lebens Säugetierorganismus.

Im Knochenmark bilden Stromazellenelemente ein Netzwerk, das den Raum zwischen Sinusoiden und Knochengewebe ausfüllt. Der Gehalt an ruhender MSC im Knochenmark eines Erwachsenen ist vergleichbar mit der Anzahl hämatopoetischer Stammzellen und überschreitet nicht 0,01-0,001%. Mesenchymale Stammzellen, die aus Knochenmark isoliert wurden und keiner Kultivierung unterzogen wurden, sind frei von adhäsiven Molekülen. Solche MSCs exprimieren kein CD34, ICAM, VCAM, Typ I und III Kollagen, CD44 und CD29. Daher werden in vitro keine mesenchymalen Stammzellen auf dem Kultursubstrat fixiert, sondern weiterentwickelte Vorläuferderivate von mesenchymalen Stammzellen, die bereits Komponenten des Zytoskeletts und Rezeptorapparats von Zelladhäsionsmolekülen gebildet haben. Stromazellen mit dem Phänotyp CD34 werden sogar im peripheren Blut gefunden, obwohl sie im Knochenmark viel weniger als CD34-positive mononukleäre Zellen sind. Die aus dem Blut isolierten und in die Kultur transferierten CD34-Zellen heften sich an das Substrat an und bilden Kolonien von Fibroblasten-ähnlichen Zellen.

Es ist bekannt, dass in der Embryonalperiode die stromale Basis aller Organe und Gewebe von Säugetieren und Menschen aus einem gemeinsamen Pool von mesenchymalen Stammzellen vor und auf der Stufe der Organogenese stammt. Daher wird angenommen, dass in einem reifen Körper die meisten mesenchymalen Stammzellen in Binde- und Knochengewebe sein sollten. Es wurde festgestellt, dass die Mehrheit der zellulären Elemente des Stroma des losen Binde- und Knochengewebes durch engagierte Vorläuferzellen repräsentiert wird, die jedoch die Fähigkeit zur Proliferation und zur Bildung von Klonen in vitro behalten. Mit der Einführung solcher Zellen in den gesamten Blutfluss werden mehr als 20% der mesenchymalen Vorläuferzellen unter die stromalen Elemente des hämatopoetischen Gewebes und der Parenchymorgane implantiert.

Eine mögliche Quelle für mesenchymale Stammzellen ist Fettgewebe, unter dessen Stammzellen die unterschiedlich stark ausgeprägten Adipozytenvorläufer identifiziert wurden. Least reife Vorläuferelemente der Fettgewebes - stromal-vaskuläre Zellen, die die gleichen wie multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen des Knochenmarks ist, in Adipozyten unter der Wirkung von Glucocorticoiden unterscheiden können, insulinähnlichen Wachstumsfaktor und Insulin. In der Kultur von Stromazellen vaskulären Zellen differenzieren sich in Adipozyten und Chondrozyten und Fettgewebe Knochenmark stammenden Zellen, Adipozyten und Osteoblasten bilden.

In den Muskeln wurden auch Stroma-Stamm-Quellen gefunden. In der Primärkultur von Zellen, die aus menschlichen Skelettmuskeln isoliert sind, werden sternförmige Zellen und mehrkernige Myotuben nachgewiesen. In Gegenwart von Pferdeserum stellate-Zellen proliferieren in vitro ohne Anzeichen von Zelldifferenzierung und nach der Zugabe von Dexamethason zu dem Kulturmedium der Differenzierung durch das Auftreten von Zellelementen Zellen mit dem Phänotyp von Skelett- und glatten Muskeln, Knochen, Knorpeln und Fettgewebe gekennzeichnet ist. Folglich sind sowohl zugesagte als auch nicht festgeschriebene multipotente mesenchymale Progenitorzellen im menschlichen Muskelgewebe vorhanden. Es wird gezeigt, dass eine Population von Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur kommt von nicht gebundenen multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen des Knochenmarks, und unterscheidet sich von myogene Satellitenzellen.

Im Myokard neugeborener Ratten fand auch Klebstoff Sternzellen, geeignet für das Differenzierungspotential von multipotenten Zellen mesenchymalen Progenitorzellen, wie sie unter dem Einfluss von Dexamethason zu unterscheiden sie sich in Adipozyten, Osteoblasten, Chondrozyten, glatte Muskelzellen, Myotuben von Skelettmuskel und Herzmuskelzellen. Es hat sich gezeigt, dass vaskuläre glatte Muskelzellen (Perizyten) multi undifferenzierten perivaskuläre mesenchymalen Vorläuferzellen abgeleitet sind. In der Kultur des perivaskulären mesenchymalen Stammzellen exprimieren ein-smooth muscle actin und Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor und sind in der Lage zumindest glatte Muskelzellen zu differenzieren.

Ein besonderer Platz hinsichtlich der Stammreserven ist das knorpelige Gewebe, dessen extrem niedriges Reparaturpotential vermutlich auf einen Mangel an multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen oder Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren zurückzuführen ist. Es wird angenommen, dass die multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen, die der Chondro- und Osteogenese vorher gespendet wurden, aus anderen Gewebequellen in das knorpelige Gewebe eindringen.

Der Ursprung des Gewebes und die Bedingungen für die Processe mesenchymaler Progenitorzellen in den Sehnen sind ebenfalls nicht belegt. Ekspermentalnye Beobachtungen legen nahe, dass in der frühen postnatalen Kaninchen Achillessehne Zellen in Primärkulturen in der ersten Passage und behält die Expression von Kollagen Typ I und Decorin, aber bei weiterer Kultivierung verlieren sie tenotsitov Differenzierungsmarker.

Es sollte angemerkt werden, dass die Antwort auf die Frage, ob in der Tat in verschiedenen Geweben von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen lokalisiert in ihrem Stroma immer vorhanden sind, oder Gewebe Pool von mesenchymalen Stammzellen wird durch die Migration von Stromazellen des Knochenmarks-Stammzellen kompensiert, ist es noch abgewartet.

Zusätzlich zu dem Knochenmark und anderen mesenchymalen Gewebezonen eines erwachsenen Organismus kann eine andere Quelle von MSC Nabelschnurblut sein. Es hat sich gezeigt, dass Vene Nabelschnur gezeigt Blut enthält Zellen, die ähnliche morphologische und antigenen Eigenschaften mit multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen haben in der Lage sind Haftung und nicht schlechter als multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen Ursprungsknochenmark durch mögliche Differenzierung. In Kulturen von mesenchymalen Stammzellen von Nabelschnurblut wurden 5 bis 10% nicht-bindende multipotente mesenchymale Vorläuferzellen nachgewiesen. Es stellte sich heraus, dass ihre Zahl im Nabelschnurblut zu Schwangerschaftsalter umgekehrt proportional ist, die indirekte Beweise für die Migration von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen in verschiedenen Geweben während der fetalen Entwicklung. Es gab erste Informationen über die klinische Anwendung der mesenchymalen Stammzellen isoliert aus Nabelschnurblut sowie embryonale abgeleitet Biomaterial, das auf der bekannten Fähigkeit von embryonalen Stammzellen basiert integrieren und Funktion prizhivlyatsya in Organen und Gewebesystemen erwachsenen Empfänger.

Die Suche nach neuen Quellen für mesenchymale Stammzellen

Die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen embryonalen Ursprungs, wie andere fötale Zellen, schafft eine Reihe von ethischen, rechtlichen, rechtlichen und legislativen Problemen. Daher wird die Suche nach extraembryonalem zellulären Spendermaterial fortgesetzt. Versuch war nicht erfolgreich klinische Anwendung von Fibroblasten der menschlichen Haut, es nicht nur durch die hohe finanzielle Leistungsfähigkeit der Technik, sondern auch eine schnelle Differenzierung von Fibrozyten in Fibroblasten mit deutlich weniger Potenzial Proliferation und Herstellung eine begrenzte Anzahl von Wachstumsfaktoren bestimmt. Weitere Fortschritte bei der Untersuchung der Biologie von MSK und multipotenten mesenchymalen Knochenmarkvorläufern ermöglichten die Entwicklung einer Strategie für die klinische Verwendung von autologen mesenchymalen Stammzellen. Die Technologie ihrer Isolierung, Kultivierung, ex vivo Reproduktion und gerichteten Differenzierung erforderte vor allem die Untersuchung des molekularen Markerspektrums von MSCs. Ihre Analyse zeigte, dass es in den Primärkulturen von menschlichem Knochengewebe mehrere Arten von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen gibt. Der Pro-Osteoblasten-Phänotyp wurde in Zellen gefunden, die einen Marker für stromale Vorläuferzellen STRO-1 exprimieren, jedoch keinen Osteoblastenmarker tragen - alkalische Phosphatase. Solche Zellen sind durch eine geringe Fähigkeit, eine mineralisierte Knochenmatrix zu bilden, sowie durch das Fehlen der Expression von Osteopontin und des Parathyroidhormonrezeptors gekennzeichnet. Derivate von STRO-1-positiven Zellen, die keine alkalische Phosphatase exprimieren, werden durch intermediäre und vollständig differenzierte Osteoblasten repräsentiert. Es wurde festgestellt, dass die zellulären Elemente von klonierten Linien von STRO-1-positiven Zellen von menschlichen Trabekelknochen in der Lage sind, sich zu reifen Osteozyten und Adipozyten zu differenzieren. Die Richtung Differenzierung dieser Zellen ist abhängig von der Exposition von polyungesättigten Fettsäuren, proinflammatorische Zytokine - IL-1b und Tumornekrosefaktor a (TNF-a) sowie anti-inflammatorische und immunsuppressive TGF-b.

Später wurde gefunden, dass multipotente fehlen mesenchymalen Vorläuferzellen spezifisch nur sie inhärenten Phänotyp, sondern exprimieren komplexen Marker, die charakteristisch für mesenchymale, endothelialen, epitheliale und Muskelzellen in Abwesenheit von Expression des hämatopoetischen Zellantigens immunphänotypische - CD45, CD34 und CD14. Darüber hinaus produziert mesenchymalen Stammzellen und konstitutiv induzierbar hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, Interleukine, Chemokine und und in multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen exprimierten Rezeptoren für einige Wachstumsfaktoren und Zytokinen. Unter Stromazellen Grundlagen des menschlichen Körpers gefunden dormantnye oder Zellen mit Immunophänotyp ruht, fast identisch mit dem Antigen-Profil von rohen 5-Fluorouracil multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen - diese und andere Zellen CD117 exprimieren, Kennzeichnung „erwachsene“ Stammzellen.

Daher wurde ein Zellmarker, der für mesenchymale Stammzellen einzigartig ist, noch nicht etabliert. Es wird angenommen, dass ruhende Zellen uncommitted Populationen von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen sind, da sie nicht von Zellmarkern verpflichtet Osteoarthritis (CBFA-1) oder Adipogenese (PPAR-y-2) auszudrücken. Die verlängerte Exposition von langsam proliferierenden ruhenden Zellen mit fötalem Kälberserum führt zur Bildung von terminal differenzierten Vorläufern, die durch schnelles Wachstum gekennzeichnet sind. Das klonale Wachstum solcher Stamm-Mesenchymzellen wird durch FGF2 unterstützt. Es scheint, dass das Genom abgeleitete Stromazellen Stammzellen „geschlossen“ dicht genug über das Fehlen der spontanen Differenzierung in MSCs wurde berichtet, -. Ohne besondere Bedingungen für die Begehung den auch sie in Zellen mesenchymalen Serie nicht umgesetzt werden.

Um zu untersuchen, die Populationsstruktur mesenchymalen Stammzellen abstammen Differenzierungsmarkerproteine auf den stromalen Zelllinien und Primärkulturen durchsucht. In klonalen Kolonie-Assay-Knochenmarkzellen in vitro festgestellt, dass auf Primärkulturen von EGF unterzogen, wenn die durchschnittlichen Größe der Kolonien erhöht und verringert klonalen Expression von alkalischer Phosphatase, während die Zugabe von Hydrocortison-Expression von alkalischer Phosphatase aktiviert, die ein Marker der osteogenen Differenzierung von MSCs Ausrichtung ist. Monoklonale Antikörper gegen STRO-1 waren es möglich, zu trennen und zu Studienpopulationen von STRO-1-positiven adhärenten Zellen in einem heterogenen System Dexter-Kulturen. Das Spektrum von Cytokinen reguliert nicht nur die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen und lymphoiden Zellen, sondern auch in der Bildung, die Bildung und die Resorption von Skelettgeweben durch para-, auto- und endokrine Mechanismen teilnehmen. Rezeptor-vermittelte Freisetzung von sekundären Botenstoffen wie cAMP solche, Diacylglycerin, Inositoltriphosphat und Ca2 + sind auch für die Markeranalyse der verschiedenen Kategorien von stromalen Gewebe von Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren verwendet. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als Marker erlaubt stromal lymphoiden Organen gehören, retikuläre Zellen T und B-abhängigen Zonen herzustellen.

Seit einiger Zeit werden wissenschaftliche Auseinandersetzungen um die Frage nach der Entstehung von MSC aus der hämatopoetischen Stammzelle geführt. In der Tat wachsen bei der Explantation der Suspension von Knochenmarkzellen in Monolayer-Kulturen diskrete Kolonien von Fibroblasten in ihnen. Es hat sich jedoch gezeigt worden, dass die Gegenwart von Vorläufern von Fibroblast Kolonien und verschiedenen Keimen Differenzierung von hämatopoetischen Gewebe als Teil des Knochenmarks kein Beweis für ihren gemeinsamen Ursprung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Verwendung Diskriminanzanalyse von Knochenmark-Stammzellen gefunden, dass die Mikroumgebung bei heterotope Transplantation wird hämatopoetischen Zellen des Knochenmarks überführt, die das Vorhandensein, im Knochenmark, unabhängig von histogenetischen MSC Population von hämatopoetischen Zellen beweist.

Darüber hinaus ermöglichte das selektive Klonierungsverfahren, eine neue Kategorie von stromalen Vorläuferzellen in Monolayer-Kulturen von Knochenmarkzellen zu entdecken, um deren Anzahl zu bestimmen, um ihre Eigenschaften, proliferative und differenzierende Potenzen zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass Stromafibroblasten-ähnliche Zellen in vitro proliferieren und diploide Kolonien bilden, die mit der Rückkehr der Transplantation in den Körper die Bildung neuer hämatopoetischer Organe bereitstellen. Die Ergebnisse der Untersuchungen einzelner Klone zeigen an, dass es eine Population von Zellen in ihre proliferative und Differenzierungspotential der Lage ist, die Rolle von Stammzellen des stromalen Gewebes, Gistogeneticheskaja unabhängig von hämatopoetischen Stammzellen in den Stromazellen Vorläuferzellen zu erreichen. Zellen dieser Population zeichnen sich durch selbsttragendes Wachstum aus und differenzieren sich zu Progenitorzellen aus Knochen, Knorpel und retikulärem Knochenmarksgewebe.

Von großen Interesse sind die Ergebnisse von Studien Chailakhyan R. Et al (1997-2001), die Kaninchen gezüchtete Knochenmark stammenden Stromazellen Progenitorzellen, Meerschweinchen, Mäuse und ein MEM-Kulturmedium mit fötalem Kälberserum ergänzt. Die Autoren führten die Explantation mit einer Anfangsdichte von 2-4 x 103 Knochenmarkzellen pro 1 cm2 durch. Als Zubringer wurden homologe oder heterologe strahlungsinaktivierte Knochenmarkszellen in einer Dosis verwendet, die die Feeder-Wirkung beibehielt, jedoch ihre Proliferation vollständig blockierte. Zweiwöchige primäre diskrete Kolonien von Fibroblasten wurden trypsinisiert, um monoklonale Stämme zu produzieren. Der Nachweis klonalen Ursprung Kolonien wurden unter Verwendung von chromosomaler Marker in Mischkulturen von Knochenmark von männlichen und weiblichen Meerschweinchen, Zeitrafferaufnahmen lebender Kulturen erhält, sowie in Mischkulturen von Knochenmark von syngenen Mäusen und CBA SVAT6T6. Transplantation Aufschlämmung von frisch isolierten Knochenmarkzellen in vitro oder stromalen Fibroblasten unter der Nierenkapsel gezüchtet wurde in ivalonovyh porösen Gerüsten oder Gelatine, sowie inaktivierte Kaninchen Spongiosa-Matrix durchgeführt. Transplantations-Klone in den Knochendeckel Oberschenkeln Meerschweinchens von Weichgewebe und Knochenhaut gereinigt, schneiden die Epiphyse und gründlich ihr Knochenmark zu waschen. Der Knochen wurde in Fragmente (3-5 mm) geschnitten, getrocknet und mit einer Dosis von 60 Gy bestrahlt. In den Knochenbedeckungen wurden einzelne Fibroblastenkolonien platziert und intramuskulär implantiert. Zur intraperitonealen Transplantation der stromalen Fibroblasten in vitro gezüchtet, verwenden wir Typen eine Diffusionskammer (V = 0,015 cm 3, h = 0, l mm) und D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Wenn die Dynamik des Wachstums von klonalen Stämme Chailakhyan R. Et al Studium (2001) fanden heraus , dass die einzelnen Zellen, koloniebildende Fibroblasten, sowie deren Nachkommen große proliferative Potential haben. Bis zur 10. Passage betrug die Anzahl der Fibroblasten in einigen Stämmen 1,2-7,2 × 10 ⁹ Zellen. Im Verlauf ihrer Entwicklung führten sie bis zu 31-34 zelluläre Duplikationen durch. So heterotope Transplantation von Knochenmark stammenden Stromazellen von Vorläufern gebildet Stämmen mehr Dutzende Klonen aus der Übertragung von Knochenmark - Mikroumgebung und Bildung in der neuen Zone hämatopoetischen Organtransplantation führte. Die Autoren stellten die Frage , ob einzelne Klone können Knochenmark - Mikroumgebung Stromazellen tolerieren, oder es erfordert die Zusammenarbeit mehrerer verschiedener clonogene Stromatumoren Vorläufer? Und wenn einzelne Klone werden in der Lage sein , die Mikroumgebung zu übertragen, ob es voll alle drei Keime Blut, oder verschiedene Klonen bieten die Bildung von hämatopoetischen Mikroumgebung für verschiedene Keime? Um diese Probleme anzugehen wurde Technologie der Anbau Stroma - Vorläuferzellen in dem Kollagen - Gel entwickelt , das Sie von der Oberfläche von Fibroblasten gewachsenen Kolonien für nachfolgende heterotopischen Transplantation schießen kann. Einzelne Klone stromalen Fibroblasten, Knochenmarkszellen aus CBA Mäusen und Meerschweinchen gezüchtet, mit einem Fragment des Gelcoats und transplantierten heterotope geschnitten zusammen - unter die Nierenkapsel von syngenen Mäusen oder autologe Muskelbauch Meerschweinchen. Bei der Transplantation in den Muskel wurden die Kolonien auf dem Gel in die Knochenhüllen eingebracht.

Wir haben festgestellt, dass von 50 bis 90 Tagen nach der Transplantation von Fibroblasten-Kolonie Knochenmark in 20% der Fälle wurden in der Transplantationsbereich Entwicklung von Knochen oder Knochen und hämatopoetischen Geweben beobachtet. Bei 5% der Empfängertiere enthielten die gebildeten Herde des Knochengewebes eine mit Knochenmark gefüllte Höhle. Innerhalb Knochenzylinder haben solche Foci eine abgerundete Form und eine Kapsel von Knochengewebe konstruiert, mit Osteozyten und Osteoblasten-Schicht gut entwickelt. Knochenmarkhöhle enthält retikuläre Gewebe mit myeloiden und erythroiden Zellen, die Anteile, die nicht von dem in dem normalen Knochenmark unterscheiden. Die Nierentransplantat war ein typischer medullären Körper durch natives Knochenmarktransplantation gebildet, wo Knochenkapsel nur die Markhöhle von der Nierenkapsel umfasst. Das Kapuzengewebe umfasste myeloide, erythroide und megakaryozytäre Elemente. Das Stroma der Markhöhle hatte ein gut entwickeltes Sinus-System und enthielt typische Fettzellen. Zur gleichen Zeit im Bereich der Transplantation von einigen Kolonien Knochen ohne Anzeichen von Hämatopoese wurde sie unter der Nierenkapsel gefunden. Studie von proliferativen und Differenzierung Potenz einzelner Klone wurden auf monoklonalen Kaninchen Knochenmark Stämme fortgesetzt werden die Zellen in Kulturmedium resuspendiert und in einem separaten ivalonovoy Schwamm mit einem Gewicht von 1-2 mg unter die Nierenkapsel der Knochenmarkspender Kaninchen versteckt. Eine solche Autotransplantation wurde den Zellen von 21 monoklonalen Stämmen unterzogen. Die Ergebnisse wurden in 2-3 Monaten berücksichtigt. Die Autoren stellten fest, dass 14% der transplantierten Knochenmark monoklonalen Stämme gebildeter Körper von Knochen und Knochenmarkhöhle mit hämatopoetischen Zellen gefüllt zusammengesetzt. In 33% der Fälle transplantierten Stämme kompakte Knochen mit verschieden großen Hohlräumen gebildet ostootsitami in osteoblastische und entwickelten Schicht gemauert. In einigen Fällen Schwämme transplantierten Klone Retikulum ohne Knochen oder hämatopoetische Zellen entwickelt. Manchmal retikuläre Stromabildung aufgetreten mit einem gut ausgebauten Netz von Sinusoiden, aber nicht die hämatopoetischen Zellen besiedelt. Somit waren die erhaltenen Ergebnisse ähnlich zu denjenigen, die bei der Transplantation von Klonen auf einem Kollagengel erhalten wurden. Wenn jedoch die Klone Transplantation auf dem Substrat resultiert in der Bildung von Markgewebe gezüchtet beträgt 5% des Knochens - 15% und die retikuläre Stoff - in 80% der Fälle, die Transplantation monoklonale Stämme Bildung von Knochenmarkszellen wurden in 14% der Fälle von Knochen beobachtet - in 53% und retikulär - in 53% der Fälle. Nach Ansicht der Autoren, zeigt dies an, dass die Bedingungen für die Durchführung der proliferative und Differenzierungspotentiale von stromalen Fibroblasten, wenn sie auf poröse Gerüste transplantiert optimalere als mit ihren Transplantate in Knochen und deckt das Kollagensubstrat. Es ist nicht ausgeschlossen, dass die Verwendung von fortgeschrittenen Methoden des Anbaus und die Transplantation von Klonen Feedback kann die Bedingungen für die Durchführung ihrer Klone Differenzierungspotenziale verbessern und diese Beziehungen ändern. Eine oder andere Weise, aber der Hauptwert der Forschung liegt in der Tatsache, dass einige der Klone Stromazellen fähig Knochengewebe zu bilden, während stromal hämatopoetischen Mikroumgebung gewährleistet sofort für drei Sprossen von Knochenmarkblut: erythroiden, myeloiden und Megakaryozyten, wodurch ein ausreichend großen hämatopoetischen Gewebe Tritte und etwas Knochenmasse.

Weiterhin haben die Autoren das Problem der Fähigkeit für diese Arten von Zelldifferenzierung einzelner klonaler stromaler Vorläuferzellen unter Bedingungen eines geschlossenen Systems von Diffusionskammern gelöst. Darüber hinaus war es notwendig, zu bestimmen, ob einzelne Klone von pluripotenten Exhibit oder Anzeige für potentielle Differenzieren der kooperativen Zusammenwirken mehrerer Klone mit einem festen Zeichen Zelldifferenzierung erforderlich ist, unterschiedlichen Verhältnis davon bestimmt die bevorzugte Bildung von Knochen, Knorpel oder retikulären. Durch die Kombination von zwei methodische Ansätze - monoklonale Isolaten Markstromazelle Vorläuferzellen Knochen und verpflanzen sie in die Diffusionskammern, Chailakhyan R. Et al (2001) erhaltenen Ergebnisse, die das Verständnis der strukturellen Organisation des Knochenmarks Stroma zu nähern erlaubt. Transplantation monoklonalen Stämme stromal Progenitorzellen in Typ O-Zellen führte zur Bildung von sowohl Knochen- und Knorpelgewebe, demonstriert die Fähigkeit von Nachkommen einer koloniebildenden gleichzeitig Stromazellen bilden Knochen und Knorpel. Die Annahme, dass Knochen- und Knorpelgewebe aus der gemeinsamen Stroma-Vorläuferzelle stammt, wurde wiederholt wiederholt exprimiert. Diese Hypothese hatte jedoch keine korrekte experimentelle Bestätigung. Knochen- und Knorpelbildung in Diffusionskammern notwendig war, die Existenz von Stammzellen umfasst stromale Knochenmarkvorläuferzellen zu beweisen gemeinsam, diese beiden Arten von Geweben.

Dann wurden 29 klonale Stämme der zweiten und dritten Passagen, die aus den Primärkulturen des Kaninchenmarks erhalten wurden, in Diffusionskammern gebracht und intraperitoneal mit homologen Tieren implantiert. Studien haben gezeigt, dass 45% der monoklonalen Knochenmark-Stämme osteogene Potenzen haben. Ausnahmsweise enthielt das retikuläre Gewebe 9 Kammern, aber zusammen mit Knochen und Knorpelgewebe war es in 13 weiteren Kammern vorhanden, was 76% aller Stämme ausmachte. In Kammern vom Typ O, bei denen eine Differenzierung sowohl für Knochen- als auch für Knorpelgewebe möglich war, wurden 16 Stämme untersucht. In vier Kammern (25%) wurde sowohl Knochen- als auch Knorpelgewebe gebildet. Es sollte erneut angemerkt werden, dass in den Studien von R. Chailakhian und Co-Autoren (2001) einzelne Vorläuferzellen 31 bis 34 Verdopplungen im Zellstamm aufwiesen, und ihre Nachkommenschaft war 0,9-2,0 × 10 ⁹ Zellen. Die Anzahl der Mitosen, denen die Vorläuferzellen der polyklonalen Stämme ausgesetzt waren, war praktisch die gleiche wie die der Zellen der monoklonalen Stämme. Gleichzeitig hing die Geschwindigkeit der Entwicklung von polyklonalen Stämmen, insbesondere in der ersten Phase ihrer Bildung, in beträchtlichem Ausmaß von der Anzahl der Kolonien ab, die für die Initiierung von Stämmen verwendet wurden. Diploide Stämme von humanen embryonalen Fibroblasten (WI-38) bildeten, wenn sie bei 12-15 Stufen der Duplikation neu gebildet wurden, ebenfalls Kolonien, die sich im Durchmesser und im Inhalt der Zellen in ihnen unterschieden. Große Kolonien mit mehr als 103 Zellen waren nur 5-10%. Mit der Zunahme der Anzahl der Divisionen nahm der Prozentsatz der großen Kolonien ab. Die mono- und polyklonalen Stromazellen des Knochenmarks erhalten Fibroblasten - Stämme einen diploiden Chromosomensatz nach 20 oder mehr Verdoppelungen, und die Tendenz der Entwicklung war vergleichbar mit der Dynamik der diploiden Stämme embryonale Fibroblasten. Die Analyse des Differenzierungspotentials von einzelnen stromalen Vorläuferzellen des Knochenmarks, das durch die Transplantation von monoklonalen Stämmen in Diffusionskammern durchgeführt wurde, zeigte, dass die Hälfte von ihnen osteogen ist. Große Kolonien machten 10% ihrer Gesamtzahl aus. Folglich entsprach die Anzahl der osteogenen koloniebildenden Zellen etwa 5% ihrer Gesamtpopulation. In der Gesamtmasse der von den Autoren identifizierten osteogenen Progenitorzellen gab es Zellen, die gleichzeitig Knochen und Knorpelgewebe bilden konnten. Es wurde zuerst festgestellt, dass für diese zwei Arten von Gewebe im erwachsenen Körper eine gemeinsame Vorläuferzelle existiert: 25% der getesteten Klone wurden durch ähnliche Zellen erzeugt, und ihre Anzahl unter der allgemeinen Population von Vorläuferzellen betrug mindestens 2,5%.

Somit hat die heterotope Transplantation einzelner Klone von Knochenmarkfibroblasten neue Aspekte der strukturellen Organisation der Population von mesenchymalen Vorläuferzellen eröffnet. Gefunden stromal Progenitorzellen fähig spezifischen Mikroumgebung sofort für alle hämopoetischen Stamm übertragen, die Zahl unter den untersuchten Klone größer auf verschiedene Modelle von 5 bis 15% beträgt (0,5-1,5% der Gesamtzahl der Vorläuferzellen erkannt). Zusammen mit den Klonen, die die vollständige Knochenmark-Mikroumgebung tragen, gibt es Vorläuferzellen, die nur für die Osteogenese bestimmt sind, die im offenen System Knochengewebe bilden, das die Entwicklung der Hämopoese nicht unterstützt. Ihre Anzahl von der Gesamtzahl der Vorläuferzellen beträgt 1,5-3%. Einige dieser Zellen können Knochengewebe mit einem begrenzten Zeitraum der Selbstwartung bilden. Folglich ist die Population von stromalen Progenitorzellen in ihrem Differenzierungspotential heterogen. Unter ihnen gibt es eine Kategorie von Zellen, die die Rolle von Stammstromazellen beanspruchen, die in allen drei Richtungen, die für das Knochenmarkstromagewebe charakteristisch sind, differenzieren können und so Knochen-, Knorpel- und Netzgewebe bilden. Diese Daten erlauben uns zu hoffen, dass mit Hilfe verschiedener Zellmarker der Beitrag jeder Art von Stromazellen zur Organisation einer spezifischen Mikroumgebung und zur Unterstützung der Hämatopoese in Dexter'schen Kulturen bestimmt werden kann.

Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen

In den letzten Jahren festgestellt, dass in stationären Kulturen von Knochenmark mesenchymale Zellen multipotente Vorläufer eine begrenzte Population kleiner agranular Zellen präsentiert (RS-1) Zellen, durch eine geringe Fähigkeit der Besiedlung und der Abwesenheit von Ki-67-Antigen-Expression spezifisch für proliferierende Zellen gekennzeichnet ist. Die antigenen Parameter der ruhenden RS-1-Zellen unterscheiden sich von dem Antigenspektrum von schnell proliferierenden commitierten stromalen Vorläuferzellen. Es wurde gefunden, dass eine hohe Proliferationsrate festgelegter Vorläuferzellen nur in Gegenwart von RS-1-Zellen beobachtet wurde. Im Gegenzug erhöhen RS-1-Zellen die Wachstumsrate unter dem Einfluss von Faktoren, die von den reifsten Derivaten multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen sezerniert werden. Es scheint, dass RS-1-Zellen eine Unterklasse nicht kommissionierter MSCs sind, die in der Lage sind, zu recyceln. In vitro resistent gegenüber 5-Fluorouracil stromal Progenitorzellen des Knochenmarks durch einen niedrigen Gehalt an RNA und hohen Expressionsniveaus von Ornithin-Decarboxylase-Gen charakterisiert - Marker nicht-proliferierenden Zellen.

Die intensive Vermehrung der Stroma-Vorläuferzellen beginnt nach der Fixierung auf dem Substrat. Wenn dies ausgedrückt Markerprofil von schlecht differenzierten Zellen: SH2 (TGF- Rezeptor (3), SH3 (Domäne Signalprotein), Kollagen Typ I und III, Fibronektin, Adhäsionsrezeptor VCAM-1 (CD106) und ICAM (CD54), Cadherin-11 , CD44, CD71 (Transferrin-Rezeptor), CD90, CD120a und CD124, aber ohne die Expression von charakteristischen Markern hämatopoietischer Stammzellen (CD34, CD14, CD45). Klonwachstum wiederholt mesenchymalen Stammzellen agierten ermöglicht eine Kultur von vielen genetisch homogenen stromal Vorläufer pluripotent herzustellen Zellen. 2-3 der Durchgang ihrer Anzahl erreicht 50-300.000.000. In der Kultur von ausreichender Dichte nach der Proliferation von Stromazellen Progenitorzellen zu stoppen, im Gegensatz zu Fibroblasten hämatopoetischen Geweben in Adipozyten differenzieren, Myozyten, Knorpelzellen und Knochengewebe. Die Kombination der drei Differenzierungsregulationssignale das 1-Methyl-izobutilksantin (Induktor der intrazellulären cAMP-Bildung), Dexamethason (einem Inhibitor der Phospholipase a und C) und Indomethacin (einem Cyclooxygenase-Inhibitor, Thromboxan-senkende Aktivität und) dreht sich im Adipozyten bis zu 95% der Vorläufer-Mesenchymzellen. Adipozyten Bildung von unreifer Stromazellen Expression von Lipoprotein-Lipase-Gen bestätigt, histochemische Identifizierung von Apolipoproteinen und peroxysomalen Rezeptoren. Zellen des gleichen Klon von TGF-b in Serum-freiem Medium beeinflusst erzeugt eine homogene Population von Chondrozyten. Die mehrschichtige Zellkultur von Knorpel extrazellulären Matrix entwickelt gekennzeichnet bestehend aus Proteoglycan und Kollagen Typ II. Das Nährmedium mit 10% fötalen Serum Effekt Differenzierungssignalen Komplex, bestehend aus b-Glycerophosphat (donator anorganischer Phosphat), Ascorbinsäure und Dexamethason, in dem gleichen Vorläufer Progenitorzellen stromale Kultur führt zur Bildung von Zellaggregaten. In solchen Zellen, gibt es eine fortschreitende Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase und Osteopontin Ebenen, um die Bildung von Knochenmineralisation anzeigt, die Zellen, die eine fortschreitende Zunahme an intrazellulärem Calcium bestätigt.

Nach einigen, auf der Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen teilt auf unbestimmte Zeit und Wiedergabe von verschiedenen Typen von mesenchymalen Abstammungslinie Zellen mit einem hohen Grad an Plastizität kombiniert. Wenn in die Ventrikel verabreicht werden, oder der weißen Substanz wandern mesenchymalen Stammzellen in das Parenchym des Nervengewebes und differenzieren sich in neuronale oder gliale abgeleitete Zelllinie. Darüber hinaus gibt es Informationen über MSC transdifferentiation in hämatopoetische Stammzellen sowohl in vitro und in vivo. Eine tiefer gehende Analyse in einigen besonders hohe Duktilität von MSCs bestimmt Studien, die in ihrer Fähigkeit, sich in Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen, Kardiomyozyten, glatten Muskelzellen und Skelettmuskel-Zellen zu differenzieren manifestiert. In einer Reihe von Studien Potential von MSCs in vitro und in vivo transdifferentsirovochnogo festgestellt, dass endständig multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen aus Knochenmark-Ursprung in Zelllinien zu differenzieren, die Knochen, Knorpel bilden, Muskel-, Nerven- und Fettgewebe, sowie Sehnen und das Stroma, die Hämatopoese unterstützt .

Jedoch in anderen Studien werden konnten keine Anzeichen von Restriktions Pluripotenz Genom von mesenchymalen Stammzellen und Stromazellen nicht Vorläuferzellpopulationen festgestellt, aber möglich pluripotenten Stromazellen überprüfen wurde mehr als 200 MSC Klone untersucht, isoliert aus einer Primärkultur. Die überwiegende Mehrheit der in vitro-Klone behielten die Fähigkeit, in osteogenen, chondrogenen und adipogenen Richtungen zu differenzieren. Wenn die Wahrscheinlichkeit der Migration der Empfängerzellen mit Ausnahme durch Transplantation von mesenchymalen Stammzellen unter der Nierenkapsel oder in Diffusionskammern schien es, dass Stromazellen Progenitorzellen in situ heterogene Phänotyp behalten, die allein entweder das Fehlen eines Zone Transplantats Beschränkungsfaktoren oder die Abwesenheit von pluripotente MSCs anzeigt. Zugleich erlaubt die Existenz einer seltenen Art von somatischen pluripotenten Stammzellen, die gemeinsamen Vorläufer von adulten Stammzellen sind.

Auf multi-, aber nicht wahr pluripotenten mesenchymalen Stammzellen eine sehr kleine Fraktion von Knochenmarkszellen dar und ist in der Lage, unter bestimmten Umständen, wenn sie in vitro kultiviert, ohne in der Differenzierung proliferieren, durch ihre induzierte lineage Bindung von Zellen in Knochen, Knorpel, Fett, Muskelgewebe nachgewiesen als sowie in den die Hämatopoese unterstützenden Tenozyten und Stromaelementen. Typischerweise kontinuierliche Exposition in einem Kulturmedium mit fötalen Kälberserum Ausgang MSCs in stromal von engagierten Progenitorzellen provoziert, erfahren die Nachkommen von denen spontane endgültiger Differenzierung. In vitro möglich direktionale Osteoblasten Bildung zu erreichen, indem man die Medium Anlage Dexamethason, ß-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, während die Kombination von Differenzierungssignalen Dexamethason und Insulin induziert die Bildung von Adipozyten.

Festgestellt, dass, bevor die Stufe der terminalen Differenzierung von Knochenmark-MSCs Eingabe bestimmte Kulturbedingungen zu schaffen, zunächst in mesenchymalen Stammzellen fibroblastenartige unterscheiden. Derivate dieser Zellen in vivo sind in der Bildung von Knochen, Knorpel, Sehnen, Fett und Muskelgewebe sowie stromalen Stütz Hämatopoese beteiligt. Viele Autoren verstehen den Begriff „multipotente mesenchymale Vorläuferzellen“, wie er tatsächlich MSCs und die engagierten Stromatumoren Vorläuferzellen und Knochenmark mesenchymale Gewebe. Klonale Analyse von mesenchymalen multipotenten Progenitorzellen Ursprungsknochenmark zeigte, dass etwas mehr als ein Drittel des differenzierten Klone in Osteo-, hondro- und Adipozyten, während andere Klonen Zellen osteogenes Potenzial hat, und eine Form nur hondro- und Osteozyten. Dieser Klon von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen als IUP-9 unter geeigneten Bedingungen Mikro differenzierte in Zellen mit einem Phänotyp und funktionellen Eigenschaften nicht nur von Osteoblasten, Chondrozyten und adic potsitov aber Stromazellen, die Hämatopoese unterstützen. Isoliert von fetalen Ratten-Knochenmarkzellen RCJ3.1 differenzierte mesenchymalen Zellen verschiedenen Phänotypen klonen. Durch die kombinierte Wirkung von Ascorbinsäure, b-Glycerophosphat und Dexamethason aus zellulären Elementen dieses Klons wird zunächst mehrkernige Myozyten gebildet und dann nacheinander, Adipozyten, Chondrozyten und Inselchen mineralisiertem Knochen. Die Population von granulären Zellen aus dem Periost von Rattenfötus entspricht nicht gebundene multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen, wie durch eine niedrige Proliferationsgeschwindigkeit gekennzeichnet, keine Differenzierungsmarker exprimieren, und in Kulturbedingungen unterschieden bilden hondro-, Osteo- und Adipozyten und glatte Muskelzellen.

Somit ist zu erkennen, dass die Frage der plyuri- oder Multipotenz Genom von mesenchymalen Stammzellen noch offen ist, was folglich die Darstellung der Progenitorzellen Differenzierungspotential von Stromazellen beeinflusst, die auch nicht vollständig installiert ist.

Die experimentell nachgewiesene und wichtige Eigenschaft von mesenchymalen Stammzellen ist ihre Fähigkeit, die Gewebsnische zu verlassen und im allgemeinen Blutkreislauf zu zirkulieren. Um das genetische Programm der Differenzierung zu aktivieren, sollten solche zirkulierenden Stammzellen in die geeignete Mikroumgebung fallen. Es wird gezeigt, dass, wenn unreif in verschiedenen Organen und Geweben systemisch an den Blutstrom MSCs Empfängertiere verabreicht implantierten Zellen, dann differenziert in Blutzellen, Myozyten, Adipozyten, Chondrozyten und Fibroblasten. Folglich gibt es in den lokalen Gewebszonen eine signalregulierende Wechselwirkung zwischen nicht-gutgeschriebenen und gebundenen stromalen Vorläuferzellen und auch zwischen ihnen und umgebenden reifen Zellen. Es wird angenommen, dass die Differenzierungsinduktion wird parakrine Regulationsfaktoren mesenchymalen Ursprungs und nemezenhimalnogo (Wachstumsfaktoren, Eicosanoide, extrazelluläre Matrixmoleküle), die die räumlichen und zeitlichen Beziehungen in der Mikroumgebung von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen bereitzustellen durch. Daher sollte eine lokale Beschädigung des mesenchymalen Gewebes zur Bildung einer Mikroumgebung Zonen führen multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen unterscheiden sich qualitativ von den komplexen Regulationssignalen intakter Gewebe, in denen physiologische Prozesse statt reparative Regeneration auftreten. Dieser Unterschied ist im Hinblick auf die Spezialisierung des Zellphänotyps in einer normalen und durch Schädigung induzierten Mikroumgebung extrem wichtig.

Nach den Vorstellungen werden hier die Mechanismen des fundamentalen Unterschieds zweier bekannter Prozesse - physiologische Regeneration und entzündliche Proliferation - gelegt. Die erste von ihnen endet mit der Wiederherstellung der spezialisierten zellulären Gewebezusammensetzung und ihrer Funktion, während das Ergebnis des Proliferationsprozesses die Bildung von reifen Bindegewebselementen und der Funktionsverlust der geschädigten Gewebezone ist. Für die Entwicklung optimaler Programme für den Einsatz multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen in der regenerativ-plastischen Medizin ist daher eine sorgfältige Untersuchung der Eigenschaften des Einflusses von Mikroumweltfaktoren auf die Differenzierung von MSCs notwendig.

Die Abhängigkeit der Struktur der Abteilung der Stammzellen von den zellulären para- und autokrinen Regulatoren, deren Ausdruck von den äusserlichen Signalen moduliert wird, zweifelt niemand. Unter den Funktionen der regulatorischen Faktoren sind die Kontrolle der asymmetrischen Teilung von MSCs und die Expression von Genen, die die Stadien der Provision und die Anzahl der Zellteilungen bestimmen, am wichtigsten. Externe Signale, von denen die weitere Entwicklung von MSC abhängt, werden durch ihre Mikroumgebung bereitgestellt. Im unreifen Zustand proliferieren MSCs für eine lange Zeit, während sie die Fähigkeit zur Differenzierung in der Adipozytenlinie, Myofibroblasten, Stroma von hämatogenem Gewebe, Knorpelzellen und Knochen behalten. Es zeigt sich, dass eine begrenzte Population zirkulierender SB34 negativen stromalen Zellelemente aus dem allgemeinen Kreislauf zu dem Knochenmarkstroma Gewebe zurückgeführt wird, wird in eine Zeile transformiert, wo CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Rezirkulation von Vorläufer-Mesenchymzellen im Blutstrom das Gewebegleichgewicht von stromalen Stammzellen in verschiedenen Organen unterstützt, indem ein gemeinsamer Pool von unreifen Knochenmarkstromaelementen mobilisiert wird. Differenzierung von MSCs in Zellen mit mehrfachen mesenchymalen Phänotypen und ihre Beteiligung an der Reparatur oder Regeneration von Knochen, Knorpeln, Sehnen und Fettgewebe in vivo durch adoptiven Transfer Modelle in Versuchstieren demonstriert. Nach anderen Autoren, entfernte Migration von MSCs vaskulärem Bett ist mit einer lokalen Verschiebung kombiniert oder korotkodistantnym multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen im Gewebe an der Reparatur Knorpel, Muskelregeneration und anderen Reduktionsreaktionen.

Lokale Stammreserven der Stromagewebebasis spielen die Rolle der Zellquelle bei den Prozessen der physiologischen Geweberegeneration und werden durch den Ferntransport von MSCs wieder aufgefüllt, wenn die stromalen Gewebevorräte aufgebraucht sind. Jedoch in Not Mobilisierung von zellulärem reparative Fähigkeit, wie Polytrauma, in die reparative Prozesse der Regenerierung nimmt MSCs gesamten Zug, und der Umfang durch den Blutstrom mesenchymalen Vorläuferzellen aus Knochenmark gewonnen werden.

Transplantation von mesenchymalen Stammzellen

Es gibt gewisse Parallelen zwischen den Prozessen der physiologischen Regeneration von Geweben und ihrer Bildung während der intrauterinen Entwicklung. Die Embryonalentwicklung von Menschen und Säugetieren, abgeleitet die Bildung von verschiedenen Arten von spezialisierten Zellen von Ecto, Meso- und endodermisches Keimschichten Pool, aber mit der obligatorischen Teilnahme des Mesenchym. Das lose zelluläre Netzwerk von embryonalem Mesenchymgewebe führt zahlreiche regulatorische, metabolische, skelettale und morphogenetische Funktionen aus. Bookmark provisory Körper wird erst nach dem kondensierenden Mesenchym auf Kosten des Wachstums klonogenen Vorläuferzellen durchgeführt, die primäre morphogenetische Signale organogenesis erzeugen. Die stromalen Derivate des embryonalen Mesenchyms bilden ein zelluläres Gerüst von provisorischen Organen und bilden die Grundlage für ihre zukünftige Energieversorgung durch den Anbau von primären Blut- und Lymphgefäßen. Mit anderen Worten erscheinen die stromalen Elemente der mikrozirkulatorischen Einheit der fetalen Organe vor der Bildung ihrer strukturell funktionellen Einheiten. Darüber hinaus ermöglicht die aktive Migration von Mesenchymzellen während der Organogenese eine räumliche Orientierung von sich entwickelnden Organen aufgrund der Markierung ihrer Volumengrenzen durch Beschränkung von homeotischen Noch-Teps. Auf dem Stroma-Gerüst befindet sich auch eine Ansammlung von strukturellen und funktionellen Einheiten von parenchymatösen Organen, die oft morphogenetisch und funktionell völlig verschiedene Zellen enthalten. Folglich sind mesenchymale Funktionen in der Embryogenese primär und werden durch die Erzeugung regulatorischer Signale realisiert, die die regionale Proliferation und Differenzierung von Vorläuferepithelzellen aktivieren. Embryonale Mesenchymzellen produzieren Wachstumsfaktoren wie LEG, HGF-b, CSF, für die parenchymale Progenitorzellen entsprechende Rezeptoren aufweisen. In dem reifen reifen Gewebe des erwachsenen Organismus erzeugt das Stromazellennetzwerk auch Signale, um die Lebensfähigkeit und Proliferation von Vorläuferzellen nicht-mesenchymalen Ursprungs aufrechtzuerhalten. Jedoch wird das Spektrum stromal Regulationssignale in postnatale Ontogenese anderen (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, Flt-3, LIF usw.) und zielt darauf ab, eine physiologische Regeneration oder Reparatur von beschädigten Gewebszonen zu ermöglichen. Darüber hinaus sind die spektralen Eigenschaften von stromalen Regulationsfaktoren in jeder Art von Gewebe und sogar innerhalb desselben Organs unterschiedlich. Insbesondere Hämatopoese und Lymphopoese auf die Vermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen und immunkompetenten Zellen tritt nur in bestimmten Organen, in der stromalen Mikroumgebung wirkt Bedingungen für die Reifung von hämatopoetischen und lymphoiden Zellen bereitstellt. Es ist bis zu regulatorischen Faktoren Mikroumgebung auf die Fähigkeit von hämatopoetischen und lymphatischen Zellen abhängt, den Körper zu vermehren und reifen in seine mikrostrukturellen Nischen zu besiedeln.

Unter den Komponenten der extrazellulären Matrix, die multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen produzieren sollte bemerkt Fibronektin, Laminin, Kollagen und Proteoglykane wurde, sowie CD44 (Hyaluronan und Osteopontin-Rezeptor), um den Hauptteils in der Organisation der interzellulären Wechselwirkungen und die Bildung von extrazellulären Matrix im Knochenmark und Knochenaufnahme . Es ist bewiesen, dass Knochenmark mesenchymale, multipotente Zellen redshestvenniki Stroma-Mikroumgebung, die Bereitstellung der induktiven und regulatorischen Signale nicht nur die MSC, sondern auch hämatopoetische Vorläufer und nemezenhimalnye Knochenmarkstammzellen erstellen. Es ist bekannt, dass bei der Hämatopoese beteiligt MSCs durch ihre Fähigkeit gemessen in stromalen Zellen zu unterscheiden, die die Hämatopoese unterstützen, wobei das aktive Leitung MSK-Signal direkt von hämatopoetischen Stammzellen erhalten. Aus diesem Grund dient das Netzwerk der stromalen Vorläuferzellen in der Kultur als Nährboden für die Entwicklung aller Klone hämatopoetischer Zellen.

In einer reifen Organismus Intensität der Hämodialyse und Lymphopoese in einem dynamischen Gleichgewicht mit der „Ausgabe“ von reifen Blutzellen und Zellen des Immunsystems in der Peripherie. Da Stromazellen des Knochenmarks selten Zellen und lymphatische Organe aktualisiert, erhebliche Umstrukturierung Stromatumoren Strukturen treten nicht in ihnen. Bringen Sie das System des dynamischen Gleichgewichts ist möglich, mit Hilfe von mechanischen Schäden an Organen Hemo oder Lymphopoese, die auf die gleiche Art von sequentiellen Veränderungen führt, die nicht nur und nicht so sehr von hämatopoetischen oder lymphatischen Zellen beeinflussen, als Stroma Strukturen Orgel beschädigt. Bei dem Verfahren des reparative Regeneration primär gebildeten stromal Rahmen, die dann hämatopoetischen oder Immunzellen neu zu besiedeln. Diese seit langem bekannte Tatsache macht posttraumatischem Regeneration günstiges Modell für die Stroma-Mikroumgebung von blutbildenden Organen zu studieren. Insbesondere ist für die Untersuchung von reparative Regeneration von Knochenmark verwendet mechanisch Entleeren Markhöhle der langen Knochen - Kürettage, so dass schnell und effektiv die hämatopoetischen Gewebe von einem dynamischen Gleichgewichtszustand bringen. Wenn der Prozess von reparative Regeneration von hämatopoetischen und Stromazellen des Knochenmarks Komponenten nach der mechanischen Entleeren des medullären Hohlraums der Meerschweinchen gefunden Tibia studieren, dass zwischen den Indikatoren Regeneration von hämatopoetischen und Stromazellen (die Zahl hämatopoetischer Zellen, die Konzentration und die Menge an stromalen Progenitorzellen) gibt es keine direkte Korrelation besteht. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Zunahme der Bevölkerung von Stromazellen Vorläuferzellen zu einem frühen Zeitpunkt nach Ausschabung auftritt und ich stromalen Fibroblasten ist fosfatazopolozhitelnymi, die charakteristisch für osteogenes Gewebe ist. Es wurde auch festgestellt, dass die Kürettage 3-5 langen Knochen zum Wachstum der Zellpopulation führen im Knochenmark und nicht-operierten Knochen auch in der Milz, die bei Meerschweinchen ist nur lymphopoietischen Körper.

Morphologische Bild reparative Prozesse im Knochenmark kyuretirovannyh Tibia Meerschweinchen entspricht im allgemeinen Literaturdaten in Tierversuchen anderer Arten erhalten, die Dynamik der Veränderungen, die sie nach der Entfernung des hämatopoetischen Gewebes nehmen ist das gleiche für alle Arten und der Unterschied betrifft nur die Zeitparameter . Morphologisch Phasenverfahren Hämatopoese in Markraum für die Wiederherstellung in aufeinanderfolgenden Prozessen geleert Blutgerinnselbildung grobe Faser Knochen Organisation, deren Resorption von Sinusoiden und Reticularformation Stroma, die hämatopoetische Elemente weiter repopulating. Die Zahl der hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark Geweberegenerationsprozess erhöht parallel Erhöhung des Gehalts von hämatopoetischen Stammzellen.

Gerasimov Yu et al (2001) verglichen die Änderungen in der Anzahl von hämatopoetischen Zellen und die Menge an stromalen Zellvorläufer in den einzelnen Phasen des Regenerationsprozesses. Es stellte sich heraus, dass die quantitativen Veränderungen in Knochenmarkzellen im geheilten Knochen der Dynamik der morphologischen Eigenschaften der Regeneration entsprechen. Reduktion während der ersten drei Tage des Zellinhaltes in Regenerat Autoren führt den Verlust von hämatopoetischen Zellen aufgrund der negativen Auswirkungen der Mikroumgebung, die in der verbleibenden Knochenmark retikuläre Gewebe schafft in der Epiphyse und im letzteren wächst mit Kürettage Brennpunkten osteoid und Gefäßschäden zu bilden. 12.07 th Tag Erhöhung fallen yaderosoderzhaschih Zellen mit dem Erscheinungsbild der einzelnen Brennpunkte in myeloischer hämatopoetischen Stromazellen Proliferationszonen. Am 20. Tag gibt es bedeutende Bereiche von regeneriertem Knochenmark und gut entwickelten Nebenhöhlen, was mit einer signifikanten Zunahme der Gesamtzahl der Zellen einhergeht. Die Anzahl der hämatopoetischen Elemente in diesem Zeitraum beträgt jedoch 68% des Kontrollspiegels. Dies steht im Einklang mit dem zuvor veröffentlichten Daten zeigen, dass die Anzahl der blutbildenden Zellen nach Kürettage Standards nur 35-40 Tage nach der Operation erreicht.

In der frühen posttraumatischen Phase ist die zelluläre Quelle für die Wiederherstellung der Hämopoese die zelluläre Komponente, die in der Kürettage konserviert wird. Die Hauptquelle der Regeneration von hämatopoetischem Knochenmarksgewebe sind später Stammzellen, die die freien stromalen Zonen repopulieren. Für bestimmte Kategorien von Stromazellen (endothelial, retikulär und osteogen) bleiben die Quellen, die ihre Bildung während der Rekonstruktion der Markhöhle liefern, ungeklärt. Die Ergebnisse von Yu.V. Gerasimov und Koautoren (2001) bezeugen, dass im Knochenmark, das nach der Kürettage konserviert wurde, die Konzentration von Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, signifikant höher ist als im normalen Knochenmark. Die Autoren glauben, dass mit Kürettage intensivere selektive Elution von hämatopoetischen Zellen ist im Vergleich mit Stroma-Kolonie-bildenden Zellen, die bei der Bildung von Stroma beteiligt sind und fest mit seiner Grundsubstanz als hämatopoetische Zellen verbunden.

Die Dynamik der Veränderungen in der Anzahl der Zellen, Fibroblasten Kolonien korreliert mit der Intensität der Osteogenese Prozesse nachfolgende trabekulären Knochenresorption und Bildung retikuläre Stroma der bevöl hämatopoetischen Zellen bilden. Die meisten stromalen Progenitorzellen bilden zu den angegebenen Regenerationszeiten ein grobfaseriges Knochengewebe und ein retikuläres Stroma. Bei Frakturen der Oberschenkelknochen in den Bedingungen der verlängerten Osteosynthese am 5. Tag in der Regenerationszone, erhöht sich die Konzentration und Anzahl der Zellen, die die Fibroblastenkolonie bilden, und in der Zeit der intensiven Knochenbildung nimmt ihre Anzahl 6-fach zu. Es ist bekannt, dass Knochenmarkzellen, die Fibroblastenkolonien bilden, osteogene Eigenschaften besitzen. Die Anzahl der stromalen Vorläuferzellen nimmt vor der Kolonisierung des Bereichs des kortikalen Knochenmarks durch hämatopoetische Zellen zu. Dies ist in guter Übereinstimmung mit dem Beweis, dass Stromazellen die Bildung einer hämatopoetischen Mikroumgebung bereitstellen. Offensichtlich entspricht die Schaffung von hämatopoetischen Mikroumgebung zu einem gewissen Maße an Regeneration von Stroma-Gewebe, und erhöht die Anzahl von hämatopoetischen Zellen nach Expansion stromal Brücken geeignet für Hämatopoese.

Von größtem Interesse sind die Daten der Autoren, dass unmittelbar nach der Kürettage die Anzahl der stromalen Progenitorzellen in den entfernten Teilen des Skeletts zunimmt. Ausgehend von der sechsten Stunde, und vom zwanzigsten Tag inklusive des Gegen Tibia ist in mehr als zweifachem Anstieg der Konzentrationen und die Anzahl der Zellen bilden Kolonien von Fibroblasten beobachtet. Der Mechanismus dieses Phänomens ist vermutlich mit der Tatsache verbunden, dass eine massive Knochenmarksverletzung in der Bildung einer großen Anzahl von Blutgerinnseln führt, während gleichzeitig eine beträchtliche Anzahl von Blutplättchen und die Freisetzung in das Blut platelet-derived growth factor (RBSBFO) zu zerstören, die bekanntlich die Proliferation von Zellen verursachen, Kolonien bildenden Fibroblasten, die außerhalb des proliferativen Pools im Körper lokalisiert sind. In Experimenten an Kaninchen fördert die lokale Verabreichung MSCs Wiederherstellung des beschädigten Knorpels chirurgisch des Knies, die mit der Bildung von Chondrozyten aus MSCs abgeleitet eingeführt zugeordnet werden können. Die reparative Regeneration von Knochendefekten bei Laborratten wird jedoch durch die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die in einem keramischen Gerüst eingeschlossen sind, stark verbessert. Deshalb können wir davon ausgehen, dass, wenn Sie nicht RBOK, dann andere Faktoren, von den beschädigten Stromazellen abgeleitet, eine ferne stimulierende Wirkung auf der Proliferation von mesenchymalen Vorläuferzellen in intakten Bereichen des Knochenmarks haben und regen ihre Wanderung in den Bereich des Markgewebedefektes Knochen. Dies wiederum im Gegensatz zu Literaturdaten der vergangenen Jahre, was darauf hinweist, dass Stromazellen für die Mikroumgebung verantwortlich sind, im Gegensatz zu hämatopoetischen Zellen sind nicht in der Lage aus lokalen Quellen zu migrieren und kommen.

Dennoch sind die Ergebnisse der Studie Gerasimov Yu et al (2001) deuten darauf hin, dass die Anwendung von mechanischen Trauma verursacht nicht nur eine scharfe Umstrukturierung von Stroma-Gewebe in kyuretirovannoy Knochen, aber auch signifikante Veränderungen in den Stroma entfernten Knochen intakt, das heißt, es ist eine systemische Antwort stromales Gewebe für lokales Trauma. Und wenn Polytrauma angewandt - mehrere Kürettage - diese Reaktion wird verstärkt und beobachtete nicht nur in den operierten Knochen und entfernten Teilen des Skeletts, sondern auch in den lymphatischen Organen, insbesondere die Milz. Der Mechanismus einer solchen systemischen Reaktion von Knochenmarkstroma und Milz auf lokales Trauma und Polytrauma bleibt unbekannt. Es wird angenommen, daß dieser Prozeß mit der Wirkung des humoralen Faktor freigesetzt mesenchymalen Stromazellen medullären Knochenmarkhöhle verbunden ist. Möglichkeit der Herstellung Stromazellen des Knochenmarks und die Milz organonespetsificheskogo humoralen Faktor verantwortlich für die Zellproliferation, koloniebildende Fibroblasten zeigt Daten über ihre Kolonie Aktivität in Monolayer-Kulturen von Knochenmark zu stimulieren.

In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass, wenn ihre Derivate systemisch multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen verabreicht repopulating nicht nur das Knochenmark, aber auch andere Gewebe, das verwendet wird, insbesondere für die Gentherapie. Es wird gezeigt, dass nach der intravenösen Verabreichung von großen Mengen von MSCs mit dem Genom des Wildtyp-Mäusen, die mit Mutanten-Kollagen-Gen I Donorzellen ersetzen für 9 Monate bis 30% der Zellen in Knochen und Knorpelgewebe des Empfängers, und die transfizierten mesenchymalen Stammmauszellen sezer IL-3 Mensch, bis wirksam die Hämatopoese im Falle ihrer gleichzeitigen Verabreichung mit humanen hämatopoetischen Stammzellen an immundefiziente Mäuse zu unterstützen.

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Genetische Modifikation von mesenchymalen Stammzellen

Zusätzlicher experimenteller Erfolg der genetischen Veränderung sollte durch die Übertragung von Zelltransfektanten immundefizienten Mäusen, die im Blut Antihemophilic Faktor B über 8 Wochen nach der Transplantation auf die Erscheinung führt gefolgt MSCs Transfektion Faktor IX-Gene in menschlichen MSCs festgestellt werden. In diesem Experiment wurde posttranslationale Modifikation von Faktor IX mit γ-Glutamylcarboxylase in transfizierten Zellen durchgeführt. Transduktion von MSCs mit einer retroviralen Vektor-Codierung menschlichen Faktor IX, war weniger erfolgreich, - nachfolgende Einführung dieser Zellen mit Hämophilie Hund in einem therapeutischen Spiegel von Faktor IX, die normale Intensität Koagulation Hämostase unterstützt, nur für 12 Tage.

Die Transplantation von mesenchymalen Stammzellen in das Hirnparenchym von Tieren hat gezeigt, dass unreife Spenderzellen sowohl in der Population von Neuronen als auch in Glia transformiert werden. Zu neuronale Derivate gesunde Spender Mesenchymgewebe macht theoretisch möglich, die Korrektur von genetischen Anomalien des Hirnstoffwechsels bei Patienten mit Gaucher-Krankheit und anderen Störungen des Fettstoffwechsel, Kohlenhydraten oder Ganglioside.

Weiter experimentellen Suchbedingungen Transdifferenzierung der Stammzellen in stromal Vorläuferzellen des Knochenmarks im Nerven- und Lebergewebe. Die Aufmerksamkeit der Forscher konzentriert sich auf Kombinationen von Differenzierungsinduktoren und speziellen Konditionierungsmedien. Insbesondere für die Primärkultur mit 10% fötalen Kälberserum zu isolieren, Knochenzellen Markstromazelle gewaschen und resuspendiert in DMEM / F12-Kulturmedium (1/1) werden mit einer Dichte von 200.000 / cm 2 ausgesät. Nach 24 Stunden werden nicht-adhärente Zellen entfernt und Fibroblast-artige Zellen, die an den Kunststoff gebunden sind, werden für eine Woche kultiviert. Für die Differenzierung von Stromazellen des Knochenmarks zu Neuroblasten konditionierten Medium durch Kultivierung dreitägigen Kultur von primären embryonalen Maus-Fibroblasten erhalten wurde, verwendet, sowie unter DMEM / F12 (1/1) mit 2% fötalem Kälberserum und ergänzt mit 20 ng / ml oder 10-6 M LiF Retinsäure (Neuroinduktoren, die für die neurale Differenzierung von embryonalen Stammzellen von Mäusen und Menschen verwendet werden). Die Differenzierung von Knochenmark-Stromazellen in Vorläuferzellen in Hepatozyten wurde konditionierten Umgebung als Ergebnis der dreitägigen Kultivierung eine Primärkultur von embryonalen Mausleberzellen in DMEM / F12 (1/1) Medium mit 10% fötalem Kälberserum erstellt induziert.

An dieser Stelle sei nochmals darauf hingewiesen, dass die koloniebildenden Zellen des Knochenmarkstroma heteromorph sind und in zwei Typen unterteilt werden können. Der erste Typ umfasst Fibroblasten-ähnliche Zellen, die Filopodien mit großen Kernen und einem oder zwei Nukleolen bilden. Der zweite Typ wird durch kleine Zellen einer spindelförmigen Form dargestellt. Bei beiden Arten von Zellkultur in dem konditionierten Medium auf einer Feeder-Schicht von primärem embryonalen Maus-Fibroblasten erhalten und auf dem Z-4-ten Tag der Kulturzellen erscheinen ähnlich wie Neuroblasten. In diesem Stadium haben sie oft eine spindelförmige Form mit einem oder zwei langen Fortsätzen, die mit Filopodien enden. Pyramiden- oder Sternzellen mit kurzen Dendriten sind weniger verbreitet. Dendriten eine Neuroblasten hat typische Ausdehnung (Niere Wachstum) und in seinem distalen Abschnitt, die anderen Verzweigungs - mit einem deutlichen Wachstumskegel Filopodien, durch das Dendritwachstum erfolgt. Ähnliche morphologische Merkmale (Nieren und Zapfen des Wachstums mit Filopodien), die Neuroblasten eigen sind und sich in Neuronen differenzieren, werden in Arbeiten zur Neurogenese ausführlich beschrieben. Auf dieser Grundlage folgern einige Autoren, dass die Zellen, die sie in Kultur nachweisen, Neuroblasten sind. Insbesondere Schegelskaya E. Et al (2002), nach einer primären Kultur von Stromazellen kultiviert für zwei Wochen in einem ersetzbaren bei jedem Z-and-4.Tag konditioniertem Medium gefunden, dass ein Teil der proliferierenden Zellen, den undifferenzierten Zustand halten. Äußerlich sahen solche Zellen wie Fibroblasten aus und wurden zusammen mit differenzierenden Neuroblasten in Kultur identifiziert. Die meisten Zellen (etwa 80%) befanden sich in unterschiedlichen Stadien der Differenzierung in Zellen des Nervengewebes, hauptsächlich in Neuronen. Die dendritischen Prozesse dieser Zellen standen in engem Kontakt zueinander, so dass sich die Zellen allmählich auf den Substratabschnitten des Nervennetzes in Form langer multizellulärer Stränge bildeten. Dendritische Prozesse von Neuroblasten wuchsen viel länger, einige von ihnen 8-10 Mal höher als die Länge des Körpers des Neurons selbst. Allmählich nahm der Anteil an Pyramiden- und Sternzellen zu. Dendriten von Sternzellen verzweigt. Nach Ansicht der Autoren entspricht die spätere Differenzierung von Pyramiden- und Sternzellen im Vergleich zu spindelförmigen Zellen der Sequenz von Stadien der normalen Neurogenese bei Tieren. Die Autoren schlussfolgern daher, dass Stammzellen des Knochenmarkstroma eine induzierte Neurogenese durchlaufen, bei der in vitro aus Neuroblasten alle drei Haupttypen von Neuronen gebildet werden. Vorläufer von Nervenzellen wurden auch während der Kultivierung von Knochenmarkstromazellen für 3-4 Tage in Medium mit 2% fötalem Serum und 20 ng / ml LIF gefunden. Aber in diesem Fall waren die Stammzellen sehr langsam geteilt, die Differenzierung der Neuroblasten erfolgte nur in 30% der Fälle und sie bildeten keine neuronalen Netzwerke. Verwendung als Nervenzelldifferenzierung Inducer Retinsäure, die in Kultur erhalten Autoren auf 25-30% der Nervenzellen mit einer Dominanz von Gliazellen - Astrozyten und Oligodendrozyten. Neuronen machten nur ein Drittel aller Nervenzellen aus, obwohl sie von allen drei Arten vertreten wurden: fusiforme, pyramidale und sternförmige Zellen. Am 6. Tag der Kultivierung von Zellen Stromatumoren in Retinsäure Medium Nervenzellen wurden differenzierter, während einzelne Axone der Pyramidenneuronen im normalen neuroontogenesis gefunden wurden, dass spätere Bildung der dendritischen Prozesse erscheinen. Nach Ansicht der Autoren, trotz der geringen Ausbeute an Nervenzellen hat das Verfahren Retinsäure induzieren Vorteile: Astrozyten und Oligodendrozyten und myelinisierende Vorschubfunktionen während des Wachstums von Axonen und Dendriten und sind notwendig für die normale Nervengewebebildung arbeiten. Um seine beschädigten Stellen in vivo zu reparieren, ist es daher besser, eine Suspension von Neuronen zu verwenden, die mit Gliazellen angereichert sind.

In der zweiten Versuchsreihe versuchten die Autoren die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Leberzellen zu induzieren. Nach dreitägiger Kultur von Stromazellen Stammzellen des Knochenmarks in dem konditionierten Medium durch Inkubation embryonale Maus-Hepatozyten erhalten, große, kugelförmigen haben förmigen Zellen gefunden worden, oft zweinuklearen, Zytoplasmaeinschlüsse mit verschiedenen Größen. Diese Zellen befanden sich in unterschiedlichen Stadien der Differenzierung und unterschieden sich in Größe, Anzahl der Kerne und Einschlüsse im Cytoplasma. In den meisten dieser Zellen wurde Glykogen nachgewiesen, anhand dessen die Autoren sie als Vorläuferzellen von Hepatozyten identifizierten. Da die Kultur keine Zellen ähneln Neuroblasten, gefolgt von einem Abschluss, die in dem konditionierten Medium durch Kultivierung embryonaler Hepatozyten erhalten detektiert, gibt es keine Faktoren der Differenzierung von Nervenzellen und umgekehrt gibt es Faktoren, die die Differenzierung von Knochenmark-Stromazellen in Vorläuferzellen von Hepatozyten induzieren . Die Autoren schlagen vor, das Vorhandensein von pluripotenten Zellen, die aus Knochenmarkstroma, wie sie in vitro in Zellen von hepatischem oder Nervengewebe in Abhängigkeit von den spezifischen konditionierten Medien und Induktionsspulen zu unterscheiden.

In einigen Arbeiten wird die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Kardiomyozyten, Zellen von Knorpel-, Knochen- und Nervengewebe richtig gezeigt. Es gibt Informationen darüber, dass es unter den Zellen des Knochenmarks Populationen von Stammzellen gibt, die sich zu Hepatozyten differenzieren können. Angesichts dieser Daten können die Ergebnisse der obigen Experimente an Mäusen immer noch als eine weitere Bestätigung der Anwesenheit von pluripotenten mesenchymalen Stammzellen im Knochenmark betrachtet werden, die die Fähigkeit besitzen, sich in Zellen verschiedener Gewebe eines erwachsenen Organismus zu differenzieren.

Transplantation von mesenchymalen Stammzellen

In der klinischen Transplantation von humanen mesenchymalen Stammzellen können für die Expansion von hämatopoetischen Stammzellen und ihren frühen Nachkommen prekommitirovannyh verwendet werden. Insbesondere die Einführung von autologer hämatopoetischer Stammzellen und MSCs Krebspatienten nach einer Chemotherapie durch Hoch beschleunigt Erholung der Neutrophilen und Thrombozyten im peripheren Blut. Autologer und allogener Transplantation von mesenchymalen Stammzellen verwendet, um multiples Myelom, aplastischer Anämie, Thrombozytopenie Behandlung spontaner - Erkrankungen, die mit primären Defekt hämatopoetische stromale Gewebe. Die Effizienz der Zelltherapie bei hämatologischen Erkrankungen in vielen Fällen über, während die Einführung von Stromazellen und von hämatopoetischen Stammzellen, die eine Reduktion der postoperativen Erholungsphase, Blut, Abnahme der Zahl der Todesfälle aufgrund von nicht-selektiven Zerstörung regionaler und zirkulierende Krebszellen, in denen die Matrize und einen eigenen Vorläufer hämatopoetischen Zellen des Patienten manifestiert. MSCs Anwendungen und andere multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen in der klinischen Praxis aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit des Erhaltens Knochenmarkaspirate, Expansion in Kultur und Transfektion des therapeutischen Gens versprechend. So zum Ausgleich von Defekten lokale Geweben eine lokale Implantation von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen und in systemischer Dysfunktion von Geweben mesenchymalen Ursprungs nicht ausgeschlossen verwenden kann, ist ihre Einführung in den allgemeinen Kreislauf.

In ihren Argumenten der Autoren der Werke, in denen vorsichtiger die Perspektiven von MSCs für lokale, systemische Transplantation und Gentherapie aus der Sicht der Biologie Stromazellen analysiert werden. Postnatales Knochenmark wird traditionell als ein Organ angesehen, das aus zwei Hauptsystemen klar exprimierter Zelllinien besteht - dem eigentlichen hämatopoetischen Gewebe und dem zugehörigen Stützstroma. Daher wurden mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks zunächst nur als Quelle für die Strombasis für die Produktion von regulatorischen Faktoren in der hämatopoetischen Mikroumgebung angesehen. Dann widmeten die Forscher der Untersuchung der Rolle von MSC als Stammquelle für Skelettgewebe. Die neuesten Daten weisen auf ein unerwartetes Differenzierungspotential von Knochenmarkstromazellen bei der Bildung eines Nerven- oder Muskelgewebes hin. Mit anderen Worten zeigen mesenchymale Stammzellen transgermale Plastizität - die Fähigkeit, sich zu Zelltypen zu differenzieren, die phänotypisch nicht mit den Zellen des ursprünglichen Gewebes verwandt sind. Allerdings bleiben einige Aspekte der Biologie von Stromazellen des Knochenmarks unklar und ungelösten im allgemeinen biologischen Plan, und in einigen Details, einschließlich der Identifizierung, Art, Ursprung und Entwicklung und Funktion in vivo Stromazellen des Knochenmarks sowie die zulässige Potential Differenzierung ex vivo und die Möglichkeit, therapeutische Verwendung in vivo. Die gewonnenen Daten über die Potenziale von MSCs sowie die Ergebnisse der Forschung zum regenerativen Potenzial anderer Stammzellen stehen in krassem Widerspruch zu den in der Biologie etablierten Dogmen.

Wenn sie unter Bedingungen mit niedriger Dichte kultiviert werden, bilden Stammzellen aus Knochenmarkstammzellen verschiedene Kolonien, von denen jede ein Derivat einer einzelnen Vorläuferzelle ist. Der prozentuale Anteil an stromalen Vorläuferzellen in kernhaltigen Knochenmarkzellen, der durch die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien bestimmt wird, hängt sowohl von den Bedingungen der Kultivierung als auch von den Arten, die zu der MSC gehören, signifikant ab. Zum Beispiel in dem Nagetier um die maximale Menge an stromalen Vorläuferzellen zu erhalten, ist unbedingt erforderlich, in Gegenwart von bestrahlten Feeder-Kultur von Knochenmarkszellen und Serum, während die Kolonie Effizienz des humanen mesenchymalen Stammzellen bilden, unabhängig von der Zuführeinrichtung ist, oder aus dem Kulturmedium. Die Anzahl bekannter mitogener Faktoren, die die Proliferation stromaler Vorläuferzellen stimulieren, ist begrenzt. Diese umfassen PDGF, EGF, FGF, TGF-b und auch IGF1. Unter optimalen Kulturbedingungen überleben die polyklonalen Linien von MSC in vitro mehr als 50 Zellteilungen, was es ermöglicht, Milliarden von Knochenmarkstromazellen aus 1 ml seines Aspirats zu erhalten.

Jedoch ist die Population von Knochenmark-Stromazellen heterogen, dass manifestiert sich als Schwankungen in der Größe der Kolonien, unterschiedlichen Geschwindigkeit ihrer Bildung und eine Vielzahl von Zellmorphologie, die eine Reihe von Fibroblasten-ähnlichen Spindel zu große flache Zellen umfasst. Mit der Entwicklung solcher Kulturpflanzen nach 20 Tagen wird auch phänotypische Heterogenität festgestellt. Einige Kolonien werden stark durch alkalische Phosphatase exprimiert, andere exprimieren sie überhaupt nicht, und Typ-3-Kolonien sind Phosphatase-positiv in der zentralen Region und Phosphatase-negativ in der Peripherie. Getrennte Kolonien bilden Knötchen aus Knochengewebe (der Beginn der Matrixmineralisierung ist markiert, wenn er von Van-Koss mit Alizarinrot oder Calcium angefärbt wird). In anderen Kolonien findet eine Fettansammlung statt, die durch G-Färbung mit Ölrot identifiziert wird. Seltener bilden die Kolonien der mesenchymalen Stammzellen Knorpel, die mit Alcanblau gefärbt sind.

Nach ectopic Transplantation bei Versuchstieren polyklonale bilden MGK Linien ektopische Knochen Stroma mit setchatoobraznoy mit Myelopoese und Adipozyten verbunden ist, als auch, aber selten, mit Knorpelgewebe. In monoklonalen Linien Transplantation von Stromazellen des Knochenmarks in einigen Fällen gibt Chimärismus, wobei das de novo gebildetes Knochengewebe von Knochenzellen zusammengesetzt ist, umfasst Adipozyten Stroma und Spenderursprung, während Zelllinien von hämatopoetischen und Gefäßsystem werden vom Empfänger abgeleitet.

Die Ergebnisse dieser Studien bestätigen die Stammnatur des stromalen Knochenmarkvorläufers, aus dem die klonale Linie erhalten wurde. Sie zeigen auch gleichzeitig, dass nicht alle Klonierungen in Kulturzellen tatsächlich multipotente Stammzellen sind. Einige Forscher glauben, und wir ihre Meinung teilen, dass die genaueste Informationen über das tatsächliche Potenzial der Differenzierung einzelner Klone können nur in vivo nach der Transplantation erhalten werden, anstatt durch den Phänotyp ihrer Derivate in vitro zu bestimmen. Expression in Osteo- Kultur phänotypischen Marker hondro- oder Adipogenese (bestimmt durch mRNA oder über histochemischen Techniken), und auch die Herstellung von mineralisierten Matrix entspricht nicht den Grad der Pluripotenz einzelnen Klon in vivo. Daher ist die Identifizierung von Stammzellen in der Stromazellgruppe nur unter den geeigneten Bedingungen eines biologischen Transplantationstests möglich. Insbesondere Chondrogenese sehr selten in den Transplantations offenen Systemen beobachtet, wohingegen die Bildung von Knorpeln nicht unüblich, in geschlossenen Systemen ist, wie beispielsweise Diffusionskammern oder in mikromassnyh Kulturen von Stromazellen in vitro, wobei lokal niedrige Sauerstoffspannung erreicht, was zur Bildung von Knorpeln beitragen. Daher beeinflussen sogar die Technik der Transplantation sowie unspezifische Kultivierungsbedingungen in vitro den Bereich der MSC-Differenzierung signifikant.

Die experimentelle Transplantation unter Beachtung der gegebenen experimentalen Bedingungen ist der goldene Standard für die Bestimmung des Potentials für die Differenzierung der Knochenmarkstromazellen und das Schlüsselelement ihrer richtigen Aufspürung. In der Vergangenheit waren Knochenmarkstroma-Knochenmarktransplantationsstudien mit einem häufigen Knochenmarktransplantationsproblem verbunden. Es wurde festgestellt, dass die hämopoetische Mikroumgebung durch Transplantation von Knochenmarkstromazellen erzeugt wird und ektopische Entwicklung von hämopoetischem Gewebe in der Transplantationszone bereitstellt. Der Ursprung der Mikroumgebung des Spenders und des hämatopoetischen Gewebes - vom Wirt - ermöglicht es uns, den ektopen Knochen als eine echte "umgekehrte" Knochenmarktransplantation zu behandeln. Die lokale Transplantation von Knochenmarkstromazellen fördert eine effektive Korrektur von Knochendefekten, die ausgeprägter ist als bei einer spontanen reparativen Regeneration. Mehrere präklinische Studien in experimentellen Modellen haben überzeugend gezeigt, dass Knochenmarkstroma-Knochenmarktransplantate in der Orthopädie verwendet werden können, obwohl die gründliche Arbeit und Analyse erforderlich ist, um diese Techniken auch in den einfachsten Fällen zu optimieren. Insbesondere sind die optimalen Bedingungen für die Expansion von osteogenen Stromazellen ex vivo noch nicht etabliert, die Struktur und Zusammensetzung des idealen Trägers bleiben ungenutzt, ebenso wie die Anzahl von Zellen, die für eine Knochenregeneration in großem Umfang notwendig sind.

Zusätzlich zur Anwendung von ex vivo vermehrt Stromazellen des Knochenmarks für die Geweberegeneration mesenchymalen Ursprung unorthodox Duktilität MSC öffnet die mögliche Verwendung für die Regeneration von Nervenzellen oder der Lieferung von Genprodukten im ZNS. Im Prinzip vereinfacht dies die Zelltherapie bei der Bekämpfung des Nervensystems, da keine autologen neuralen Stammzellen vom Menschen benötigt werden. Es wird über die Möglichkeiten der Verwendung von Knochenmarkszellen zur Erzeugung von Kardiomyozyten und myogenen Vorläuferzellen als tatsächlich stromalen und extrinsischen Ursprungs berichtet.

Derzeit laufen Versuche zur systemischen Transplantation von Knochenmarkstromazellen zur Behandlung von häufigen Skeletterkrankungen. Es besteht kein Zweifel, dass Knochenmarksstromazellen eine Population darstellen, die für genetische Störungen bei Erkrankungen des Skeletts verantwortlich ist, was gut durch den Vektortransfer dieser genetischen Information durch diese Zellen veranschaulicht wird, was zur Bildung von pathologischem Knochengewebe bei Versuchstieren führt. Die Fähigkeit von Stromazellen, sich in den Knochen des Skeletts nach Einführung in den allgemeinen Blutstrom zu implantieren, zu vermehren, zu vermehren und zu differenzieren, ist jedoch noch nicht bewiesen.

Dies ist zum Teil auf die Tatsache zurückzuführen, dass das Standardverfahren von Stroma Knochenmark nicht mit hämatopoetischen Geweben transplantiert, so strenge Kriterien für die Bewertung eines erfolgreiche Transplantation von systemischer Verabreichung von Stromazellen hat noch entwickelt werden. Es sollte daran erinnert werden, dass das Vorhandensein von Markergenen in Gewebeextrakten oder die Isolierung in der Kultur von Zellen mit Donorursprung nicht auf das Anwachsen von Zellen, sondern nur auf ihr Überleben hinweist. Selbst intraarterielle Injektion von Stromazellen des Knochenmarks in dem Maus-Glied kann auf praktisch Null-Ergebnis engraftment führen, trotz der Tatsache, dass Spender-abgeleiteten Zellen in großer Zahl im mikrovaskulären Netzwerk Knochenmark zu finden sind. Unglücklicherweise werden solche Zellen gewöhnlich nur auf der Grundlage der Ergebnisse der Bestimmung von Markerdonorgen unter Ex-vivo-Kulturbedingungen als "eingepflanzt" beschrieben. Darüber hinaus ist es notwendig, überzeugende Beweise für eine langfristige Integration in die Gewebe von differenzierten und funktionell aktiven Zellen mit Donorursprung zu liefern. In vielen veröffentlichten Arbeiten, in denen über die Verpflanzung von Knochenmarkstromazellen im Skelett berichtet wird, ist das Fehlen von eindeutigen Daten dieser Art auffällig. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass in einigen korrekten Experimenten an Tieren jedoch eine begrenzte, aber echte Einpflanzung von stromalen Vorläuferzellen nach ihrer systemischen Verabreichung festgestellt wurde.

Diese Daten stehen im Einklang mit den Ergebnissen der Untersuchung der Möglichkeit, myogene Knochenmarksvorläuferzellen über das vaskuläre System an die Muskeln zu liefern. Es sollte jedoch nicht vergessen werden, dass sowohl Skelett- als auch Muskelgewebe während der Entwicklung und des Wachstums auf der Grundlage extravaskulärer Zellbewegungen gebildet werden, die Migrationsprozesse verwenden, die keine Zirkulation im Blut beinhalten. Wenn es tatsächlich einen unabhängigen Zirkulationspfad für die Lieferung von Vorläuferzellen an Festphasengewebe gibt, ist es möglich, die Existenz von physiologisch zirkulierenden mesenchymalen Vorläuferzellen zu erlauben? Welchen Ursprung haben diese Zellen sowohl im sich entwickelnden als auch im postnatalen Organismus und wie durchdringen sie die Gefäßwand? Die Lösung dieser Probleme ist absolut notwendig und erfordert eine gründliche präklinische Analyse. Selbst nachdem die Antworten auf diese Fragen gefunden wurden, bleiben die problematischen kinetischen Aspekte, die mit dem Skelettwachstum und dem Umbau des Bindegewebes verbunden sind, ungelöst. Gleichzeitig scheint die Behandlung von Osteogenesestörungen durch Ersetzen der gesamten Population von mutierten Skelett-Vorläuferzellen durch gesunde Stromazellen eine echte klinische Perspektive zu sein. In diesem Fall können lokale Bruch- oder Deformationszonen aufgrund pathologischer Osteogenese sowie destruktive Veränderungen im Knochengewebe durch kultivierte in vitro-Stromastammzellen korrigiert werden. Daher sollte die Richtung zukünftiger Forschung auf die Probleme der Transformation oder genetischen Korrektur von autologen mutierten osteogenen Progenitorzellen ex vivo gerichtet sein.

Die Gentechnologie von Zellen, kurzzeitig oder permanent, ist zur Grundlage der Zell- und Molekularbiologie geworden, die Quelle vieler wissenschaftlicher Entdeckungen über die Rolle einzelner Proteine im zellulären Metabolismus in vitro und in vivo ist. Die Verwendung von molekularen Techniken Erbkrankheiten und Krankheiten beim Menschen zu korrigieren, ist sehr vielversprechend für die praktische Medizin, da die Eigenschaften von Stromazellen des Knochenmarks-Stammzellen einzigartige Schaltungen Transplantation zur Korrektur von genetischen Erkrankungen des Skeletts zu entwickeln erlaubt. Gleichzeitig können die mesenchymalen Vorläuferzellen leicht vom zukünftigen Empfänger erhalten werden, sie sind genetisch manipulierbar und vermögen sich in kurzer Zeit in großer Anzahl zu vermehren. Die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen vermeidet die Beschränkungen und Risiken, die mit der Lieferung von genetischem Informationsmaterial direkt an den Patienten durch ventröse Vektorstrukturen verbunden sind. Eine solche Strategie ist anwendbar auf embryonale Stammzellen, jedoch sind autologe postnatale Knochenmarkstromazellen das bevorzugtere Material, da ihre Verabreichung mögliche immunologische Komplikationen nach der Transplantation ausschließt. Um kurzfristige Wirkung zu erreichen, beispielsweise, um die Knochenregeneration zu beschleunigen, ist das optimale Verfahren die genetische Veränderung von mesenchymalen Stammzellen elektroporatsrsh, chemische Fusion, Lipofektion, Plasmiden und adenovirale Konstrukte. Insbesondere war die virale Transfektion in BMP-2-Zellen des Knochenmarkstromes bei der Beschleunigung der Regeneration von Knochen im experimentellen Polytrauma wirksam. Die Bildung von adenoviralen Vektorstrukturen ist aufgrund der Abwesenheit von Toxizität bevorzugt. Die genetische Modifikation von Knochenmarkstromazellen ist in diesem Fall jedoch durch eine extrem geringe Stabilität gekennzeichnet. Darüber hinaus erfordern normale transformierte Knochenmarkstromazellen die Verwendung von Vektorträgern mit genetischer Information, die 10 mal infektiöser als andere Zelltypen sind, was den Prozentsatz des Todes von transfizierten Zellen signifikant erhöht.

Für durch niedrige oder Null-biologische Aktivität bestimmter Gene notwendig, verlängerte oder permanente Modifikation von mesenchymalen Stammzellen verursachten rezessive Behandlung von Krankheiten, die die Verwendung von Adeno-assoziierte Viren, Retroviren, Lentiviren und Adeno-retroviral Chimäre erfordert. Transportstellen dieser Viren sind in der Lage, große DNA-Transfekte (bis zu 8 kb) zu tragen. Die wissenschaftliche Literatur hat sich gezeigt, bereits Information über die biologische Aktivität von exogenen Stromazellen des Knochenmarks, transfiziert mit retroviralen Konstrukten, die Synthese von regulatorischen Moleküle codieren, und Markierungen - IL-3, CD2, Faktor VIII, und die bei der Synthese von L-DOPA beteiligten Enzyme. In diesen Arbeiten weisen die Autoren jedoch auf eine Reihe von Einschränkungen hin, die überwunden werden müssen, bevor die praktische Anwendung dieser Technologie beginnt. Das erste Problem besteht darin, den MCK-Ex-vivo-Modifikationsprozess zu optimieren. Es ist bekannt, dass eine verlängerte (3-4 Wochen) Proliferation von Knochenmarkstromazellen in vitro ihre Transfektion reduziert. Gleichzeitig sind mehrere Transfusionszyklen erforderlich, um ein hohes Maß an genetischer Modifikation von MSCs zu erreichen. Das zweite Problem betrifft die Dauer der Expression des therapeutischen Gens, die vier Monate noch nicht überschreitet. Eine natürliche Abnahme der effektiven Genexpression ist auf die Inaktivierung von Promotoren und den Tod modifizierter Zellen zurückzuführen. Im allgemeinen Aussicht Transfer von genetischer Information von mesenchymalen Stammzellen Ergebnissen der Vorstudien mit der Notwendigkeit für eine weitere Optimierung der Transfektionsverfahren ex vivo, die Auswahl eines adäquaten Promotor, den die biologische Aktivität in der rechten Richtung reguliert, und verbessern die Fähigkeit des modifizierten Stromazellen des Knochenmarks zur Selbsterneuerung in vivo nach der Transplantation an. Es soll beachtet werden, dass die Verwendung von retroviralen Konstrukten zur Modifikation von Stromazellen des Knochenmarks in der gewünschten Richtung nicht immer ihre Pflicht Verpflanzung erfordern. Transfizierte mesenchymalen Stammzelle kann eine Korrekturfunktion auf dem Hintergrund des stabilen und Aufenthaltsdurchführen, ohne aktive physikalische Inkorporation zu erfordern und im Bindegewebe funktioniert. In diesem Fall sollten sie als biologische Mini-Pumpe angesehen werden, in vivo Faktor bestimmt der Mangel an denen die Manifestation einer genetischen Krankheit.

Verwendung von transformierten Knochenmarkstromazellen zur Behandlung von dominanten genetischen Erkrankung, die durch die Expression des Gens oder der anormalen pathologischen biologische Aktivität charakterisiert ist, ist viel problematischer, weil in diesem Fall ist es notwendig, die Übertragung oder den Verkauf der genetischen Information verzerrt zu blockieren. Eine der Methoden der Gentechnik ist die homologe Rekombination von embryonalen Stammzellen, um transgene Tiere zu erzeugen. Allerdings ist das extrem niedrige Niveau der homologen rekombinanten, kombiniert mit den Problemen der Identifizierung, Trennung und Ausbau solcher Rekombinanten ist unwahrscheinlich, weit verbreiteten Einsatz dieser Technik in naher Zukunft zu fördern, auch wenn die Entwicklung neuer technologischer Verfahren. Der zweite Ansatz zur Gentherapie ist auf der dominanten Pathologie automatischen Korrektur beschädigter DNA basiert als genetische Mutationen können durch Einführung der exogenen DNA mit der gewünschten Sequenz (kurzen DNA-Oligonukleotiden, oder chimäre RNA / DNA-Oligonukleotiden), die binden an Homologe in dem geschädigte Genom korrigiert werden. Die dritte Ausführungsform stellt pathologische Informationsübertragungsverriegelung, die durch die Verwendung von speziell Oligonucleotiden erreicht, die zu einem bestimmten Gen binden ternäre helikale Struktur zu bilden, die die Möglichkeit der Transkription ausschließt.

Obwohl die Korrektur von genetischen Erkrankungen in der Genomebene optimaler und bevorzugte therapeutische Methode ist, mRNA ist auch ein vielversprechendes Vektor (vielleicht sogar besser zugänglich) für ein dominant negatives Gen blockiert. Um Translation und / oder Erhöhung der mRNA-Abbau zu hemmen, sind seit langem mit Proteinmoleküle Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen oder vollständige Blockierung der Bindung von mRNA biosynthetischen Apparat der Zelle verwendet worden. Zusätzlich induziert doppelsträngige RNA einen schnellen Abbau von mRNA, deren Mechanismus unklar bleibt. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die bloße Eliminierung von mRNA, die von einem mutierten Allel mit kurzen oder einzelnen Mutationen transkribiert wird, die Expression der normalen Allel-mRNA erleichtert. Eine Alternative ist die Verwendung ribozinov Hammerhai und Hairpin, haben die Fähigkeit, hochspezifischen Websites von mRNA mit anschließender Induktion ihrer Spaltung und Inaktivierung während der Translation zu binden. Gegenwärtig wird die Möglichkeit untersucht, diese Methode zur Behandlung der pathologischen Osteogenese zu verwenden. Unabhängig davon, was genau das ist das Ziel - genomische oder cytoplasmatische Elemente Erfolg neuer Gentherapie-Technologie wird durch die Effizienz des Einschlusses von Reagenzien in Stromazellen des Knochenmarks ex vivo, die optimale Wahl eines bestimmten Vektors und stabile Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen exprimieren die gewünschten Faktoren in vivo bestimmt werden.

Die Entdeckung mesenchymaler Stammzellen mit ihren unerwarteten Eigenschaften schafft somit ein neues konzeptionelles Schema für die Entwicklung von Zelllinien. Aber die biologische Rolle von Stroma-Stammzellen zu verstehen, ihre Natur, die Fähigkeit zu transdifferentiation oder Entdifferenzierung, ihre physiologische Bedeutung im Prozess der embryonalen Entwicklung, postnatalen Wachstums, Reifung und Alterung sowie in menschlichen Krankheiten erfordert eine weiteren interdisziplinäre Forschung.