Labordiagnose der Tuberkulose

Tuberkulose ist eine Krankheit, die unter modernen Bedingungen und wissenschaftlichen Errungenschaften leicht zu diagnostizieren ist. Die labordiagnostische Abklärung der Tuberkulose steht im Zentrum anderer diagnostischer Methoden, die nur den röntgenologischen Untersuchungsmethoden nachgeordnet sind.

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Klinischer Bluttest

Bei Patienten mit Tuberkulose sind Veränderungen in der allgemeinen Blutanalyse nicht pathognomonisch. Bei begrenzten und inaktiven Formen der Tuberkulose ist der Erythrozyt in normaler Menge hypochromatisch. Bei massivem infiltriert oder käsige Pneumonie, während Prävalenz von Lymphadenitis, spezifischen Darmläsionen sowie für große Lungen- oder Nachblutungen und Mitteilungs erythropenia Mikrozytose, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrozytose, und besonders poikilotsitoz treffen sich viel seltener, gewöhnlich mit der schweren Anämie. Anzahl der Retikulozyten bei Schritt tuberculosis kompensierten Bereich von 0,1 bis 0,6%, mit subcompensated - 0,6 bis 1,0% und 1% durch Reticulocyten dekompensierter gekennzeichnet.

Wenn tuberculosis in einigen Fällen kann eine moderate Leukozytose sein (bis zu 15 Tausend Leukozyten.), Weniger Strahlung, die in 2-7% der Patienten mit begrenzten und einfachen Prozess vorkommenden Formen und in 12,5% auftritt - durch destruktive und progressive Lungentuberkulose .

Die häufigsten Verschiebungen treten in der Leukozytenformel auf. Markieren Sie sowohl relative als auch absolute Neutrophilie, eine moderate Verschiebung der Leukozytenformel nach links vor Promyelozyten. Myelozyten sind bei unkomplizierter Tuberkulose sehr selten. Eine Zunahme der Anzahl von Neutrophilen mit pathologischer Granularität im Blutbild eines Patienten mit Tuberkulose zeigt immer die Dauer des Prozesses an: Bei Patienten mit schwerer Tuberkulose enthalten fast alle Neutrophilen eine pathologische Granularität. Wenn der Tuberkuloseausbruch aufhört, nähert sich die Kernverschiebung vergleichsweise schnell dem Normalzustand. Die pathologische Granularität von Neutrophilen bleibt gewöhnlich länger bestehen als andere Veränderungen des Hämogramms.

Der Gehalt an Eosinophilen im peripheren Blut variiert auch in Abhängigkeit von der Phase des Prozesses und dem allergischen Zustand des Organismus. Ihre Menge nimmt bei schweren und langwierigen Krankheitsausbrüchen bis zur Anäinophilie ab und steigt umgekehrt mit der Resorption von Infiltraten und Pleuraergüssen sowie bei den Frühformen der Primärtuberkulose an.

Bei den meisten Formen der Primärtuberkulose kommt es zu einer Lymphopenie, die manchmal auch nach Narbenbildung bei bestimmten Veränderungen über mehrere Jahre beobachtet wird. Sekundäre Tuberkulose in der Phase der Exazerbation, abhängig von der Schwere des Prozesses, kann entweder von einer normalen Anzahl von Lymphozyten oder Lymphopenie begleitet werden.

Es nimmt einen besonderen Platz Bestimmung Erythrozytensedimentationsrate Zusätzliche Tests tuberkulöse Verfahren (ESR) mit einem Wert bei der Bewertung des Fließprozesses tuberculosis und Identifizieren seiner aktiven Formen zu bewerten. Erhöhung der ESR zeigt die Anwesenheit des pathologischen Prozesses (infektiöse Entzündungen, eitrigen septischen, Hämoblastose, Hodgkin et al.) Und ist bezeichnend für seine Schwere, aber ein normales Niveau ESR nicht immer zeigen die Abwesenheit der Pathologie. Die Beschleunigung der Erythrozytensedimentation wird durch eine Erhöhung des Gehalts an Globulinen, Fibrinogen, Cholesterin im Blut und eine Abnahme der Viskosität des Blutes erleichtert. Die Verlangsamung der Blutsenkungssekretion ist charakteristisch für die Zustände, die von der Hämokonzentration begleitet werden, die Erhöhung des Inhalts der Albumine und der Gallensäuren.

Das Hämogramm bei Patienten mit Tuberkulose verändert sich während der Behandlung. Hämatologische Verschiebungen verschwinden umso schneller, je erfolgreicher der therapeutische Eingriff ist. Man sollte jedoch die Wirkung verschiedener antibakterieller Medikamente auf die Hämopoese im Auge behalten. Sie verursachen oft Eosinophilie, in einigen Fällen - Leukozytose und häufiger Leukopenie bis Agranulozytose und lymphoid-retikuläre Reaktion. Systematische hämatologische Kontrolle und korrekte Analyse der erhaltenen Daten sind essentiell für die Beurteilung des klinischen Zustandes des Patienten, der Dynamik des Prozesses und der Wirksamkeit der verwendeten Behandlung.

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Klinische Analyse von Urin

Bei der Tuberkulose des Harnsystems ist die Urinanalyse die hauptsächliche labordiagnostische Methode. Sie können Leukozyturie, Erythrozyturie, Proteinurie, Hypoisostenurie, Tuberkulose Mycobacterium, unspezifische Bakteriurie beobachten.

Die Leukozyturie ist das häufigste Symptom der Tuberkulose des Harnsystems vor der spezifischen Chemotherapie und fehlt nur in Ausnahmefällen, zum Beispiel bei vollständiger Obliteration des Ureterlumens. Nechyporenko Test (Bestimmung der Anzahl von Leukozyten in 1 ml Urin) hilft, mehr objektiv die Grad Leukozyturie nefrotuberkuloze zu beurteilen mit und in einigen Fällen ist es bei normaler Urinanalyse zu identifizieren. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass Leukozyturie bei akuter und chronischer Pyelonephritis, Zystitis, Urethritis, Nieren- und Uretersteinen auftreten kann.

Erythrozyturie. Sowie Leukozyturie. Gelten als eines der häufigsten Laborzeichen für Tuberkulose des Urogenitalsystems. Die Häufigkeit der Hämaturie hängt von der Prävalenz des Prozesses ab und nimmt mit der Entwicklung des destruktiven Tuberkuloseprozesses in der Niere zu. Erythrozyturie ohne Leukozyturie ist eher für frühe Stadien der Nierentuberkulose typisch. Hämaturie, die Leukozyturie dominiert, ist ein wichtiges Argument für die Nierentuberkulose in ihrer Differenzierung mit unspezifischer Pyelonephritis.

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Biochemischer Bluttest

Bei Tuberkulose hängen Änderungen biochemischer Parameter hauptsächlich von der Prozessphase, Komplikationen und verschiedenen Begleiterkrankungen ab. Bei Patienten mit inaktiver Tuberkulose der Lunge und anderer Organe sind die Gesamtprotein- und Proteinfraktionen des Blutserums unverändert und bestimmen ihren normalen Gehalt.

Bei akuten Formen der Erkrankung sowie bei Exazerbation und Progression chronischer Tuberkuloseformen nimmt der Albumin-Globulin-Koeffizient ab.

Wesentlich in den Funktionszustand der organischen Schäden und Leber in tuberculosis und ihre Komplikationen der Beurteilung ist die Bestimmung von Serum-Gesamt-Bilirubin und direkter, AST (ACT), Alanin-Aminotransferase (ALT). Dynamische Bestimmung der Aminotransferasen. Bilirubin bei der Behandlung von Tuberkulose-Patienten, insbesondere in schweren Formen, ist ein obligatorischer Bestandteil einer biochemischen Untersuchung von Tuberkulose-Patienten und wird monatlich durchgeführt.

Die Beurteilung des Nierenfunktionszustandes umfasst die Bestimmung des Serumkreatinins und die Berechnung der glomerulären Filtrationsrate nach der Cockcroft-Gault-Formel. Die Berechnung der glomerulären Filtrationsrate unter Verwendung der Reberg-Probe ergibt weniger genaue Ergebnisse.

Das Hauptziel dynamischer biochemischer Studien von Tuberkulosepatienten besteht darin, den Verlauf des Prozesses zu überwachen, Nebenwirkungen von Medikamenten rechtzeitig zu erkennen und die auftretenden homöostatischen Störungen adäquat zu korrigieren.

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Anwendung biochemischer Untersuchungsmethoden bei extrapulmonaler Tuberkulose

Der aussagekräftigste Indikator ist der Gehalt von Tuberculostearinsäure in biologischen Flüssigkeiten, aber seine Definition ist mit technischen Schwierigkeiten verbunden (die Notwendigkeit von Gaschromatographie und Massenspektrometrie).

Prospektive Messung der Aktivität von Adenosin Deaminase - ein Enzym, in Flüssigkeiten bestimmt: Synovial, Perikard, Aszites oder Wirbelsäule. Die Hauptproduzenten der Adenosindeaminase sind Lymphozyten und Monozyten. Die Bestimmung der Aktivität von Adenosindeaminase in biologischen Flüssigkeiten erleichtert die Diagnose von Tuberkulosesynovitis, Lymphknotentuberkulose, Tuberkulosemeningitis, Tuberkuloseserositis.

Einige biochemische Indikatoren werden aufgrund ihrer Nichtspezifität nur in biologischen Flüssigkeiten nahe dem Läsionsfokus bestimmt. Messen Sie das Niveau der Indikatoren als Reaktion auf subkutane oder intradermale Injektion von Tuberkulin (in der Regel vor und 48 und 72 Stunden danach). Danach wird der Inkrementgrad des Markerpegels (in%) in Bezug auf den Anfangspegel berechnet.

Optimale Bestimmung der Aktivität eines organspezifischen Enzyms der Transamnidase im Urin, deren Auftreten bei der Nierebekämpfung verschiedener Art beobachtet wird. Die Untersuchung der Transamidinase ist nur unter Bedingungen der subkutanen Injektion von Tuberkulin gerechtfertigt, um den lokalen Entzündungsprozess zu verschlimmern. Bestimmen Sie die Aktivität von Transamidin im Urin zunächst und 24 bis 72 Stunden nach der Einführung von 50 TE Tuberkulin. Die Vergrößerung der Fermentation in 2 Male und mehr lässt in 82% der Fälle die aktive Schwindsucht der Nieren von der Exazerbation der langdauernden Pyelonephritis unterscheiden.

Bei Tuberkulose der weiblichen Geschlechtsorgane werden die Konzentrationen von Haptoglobin und Malondialdehyd im Blut unter den Bedingungen eines provokativen Tuberkulintests bestimmt. Subkutan injiziertes Tuberkulin in einer Dosis von 50 TE und 72 Stunden später führten eine zweite biochemische Untersuchung durch. Im Falle der Tuberkulose-Ätiologie beträgt der Grad des Anstiegs des Haptoglobinkonzentrats nicht weniger als 28% und der Malondialdehydgehalt beträgt 39% oder mehr. Die Bestimmung der Aktivität von Adenosin-Deaminase in einer aus dem Douglas-Raum erhaltenen Peritonealflüssigkeit wird ebenfalls verwendet. Das Punktatum wird 72 Stunden nach der intradermalen Injektion von Tuberkulin in Dosen von 0,1 TE und 0,01 TE in die Projektion der inneren Geschlechtsorgane an der vorderen Bauchwand nachgeprüft. Zu Gunsten des Tuberkuloseprozesses ist eine Erhöhung der Aktivität der Adenosindeaminase 10% oder mehr im Vergleich zu der anfänglichen.

Wenn das Auge betroffen ist, wird die fokale Reaktion, die im Auge als Reaktion auf antigene Stimulation auftritt, untersucht. Es ist unerwünscht, eine ausgeprägte Reaktion zu entwickeln, begleitet von einer Abnahme der Sehfunktionen. Da die Abschätzung von minimalen fokalen Reaktionen oft schwierig ist, wird zur Objektivierung der Schlussfolgerung empfohlen, parallel und auf dem Grad des Wachstums im Blutserum von Haptoglobin oder Adenosindeaminase zu orientieren.

Alle biochemischen Studien sollten in Verbindung mit anderen Methoden durchgeführt werden.

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Blutgerinnungssystem Forschung

Relevanz des Forschungsstatus des Blutgerinnungssystems von TB wird durch die Anwesenheit einer Anzahl von Patienten mit Lungentuberkulose Hämoptysis oder Lungenblutungen sowie hemocoagulation Komplikationen in der chirurgischen Behandlung von Tuberkulose verursacht. Darüber hinaus beeinflusst der latente Fluss der intravaskulären Hämkoagulation, der von Natur aus die Tuberkulose begleitet, den Verlauf der Erkrankung und die Wirksamkeit der Chemotherapie.

Bei Patienten mit Lungen-TB-Prävalenz der exsudativen Entzündung Komponente des beobachteten Rückgang der Blut Antikoagulation Aktivität. Bei Patienten mit einer niedrigen Prävalenz einer bestimmten Läsion in der Lunge mit einer Dominanz der produktiven hemocoagulation intravaskulären Entzündungskomponente leicht ausgedrückt. Bei Patienten mit Lungentuberkulose mit Bluthusten und Lungenblutungen Zustand Blutgerinnungssystem ist anders: bei Patienten mit niedrigem Blutverlust in der Höhe gemoptoe oder unmittelbar nach ihrer Beendigung ist es ein starker Anstieg der Fähigkeit der Blutgerinnung aufgrund der starken Intensivierung der trombinoobrazovaniya während erhöht „strukturelle“ Blutgerinnung zu halten. Bei Patienten mit massivem Blutverlust wird eine Abnahme des Koagulationspotentials aufgrund einer Abnahme der Konzentration von Fibrinogen beobachtet. Faktor XIII-Aktivität, Thrombozytenzahl. Im Stadium der chirurgischen Behandlung erfahren Patienten mit eingeschränkter Form der Tuberkulose keine leicht signifikanten Störungen des Homöostase-Systems. Patienten mit weit verbreitetem Verfahren in der Durchführung von pnevmon- oder plevropnevmonektomii entwickeln häufig DIC, die die Form der nehmen „zweiten Krankheit.“

Um den Zustand der Blutgerinnung bei Patienten mit Lungentuberkulose zu überwachen durchgeführt die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), Fibrinogen, Thrombin-Zeit, Prothrombin-Index und die Blutungszeit und die Gerinnungszeit werden soll.

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Hormonelle Forschung

Moderne experimentelle und klinische Beobachtungen deuten auf Veränderungen des Hormonstatus bei einer spezifischen tuberkulösen Lungenentzündung hin. Es ist bewiesen, dass die Korrektur der Dysfunktionen der Hypophyse-Nebennieren, Hypophysen-Schilddrüsen-Systeme und die Funktion der Bauchspeicheldrüse in Verbindung mit der anti-TB-Therapie auf der Aktivierung des Fibrogenese und Reparatur an einem Locus spezifischen Entzündung beitragen.

Der Funktionszustand des Hypophysen-Schilddrüsen - Systems wird durch den Gehalt im Blutserum von Trijodthyronin (T beurteilt wird , ₃ ), Thyroxin (T ₄ ), Hypophysen - Schilddrüsen - stimulierende Hormon (TSH). Es wird festgestellt, dass bei 38-45% der Patienten mit Lungentuberkulose eine subklinische Hypothyreose festgestellt wird, und am häufigsten wird eine disseminierte und faserig-kavernöse Form des Prozesses diagnostiziert. Unter diesen gleichen Formen meisten dramatisch reduzierte Mengen von sowohl T ₃ und T ₄, und es kommt ein Ungleichgewicht dieser Hormone in Form das Verhältnis von T zu erhöhen ₄ / T _s.

Die Funktion der Nebennierenrinde wird anhand des Cortisolspiegels im Blutserum und der inkrementellen Funktion des Pankreas durch die Konzentration des immunreaktiven Insulins beurteilt. In der akuten Phase der Infektionskrankheit steigt der Bedarf an endogenem Cortisol und Insulin. Hyperinsulinämie spricht auch für die Insulinresistenz von Körpergeweben, die typisch für jeden aktiven Entzündungsprozess ist, insbesondere spezifisch. Die Bestimmung der Glukokortikoidfunktion der Nebennieren mit aktiver Lungentuberkulose lässt bei der Mehrheit der Patienten das Vorhandensein von Hyperkortizismus erkennen. Normaler Cortisolspiegel Blutkonzentration in dem Patienten mit infektiöser Entzündung in der akuten Periode sollte als relatives Versagen der Glucocorticoid-Funktion der Nebennierenrinde in Betracht gezogen werden, die als Grundlage für das Halt Dosen ausreichende Ersatztherapie von Glucocorticoiden dienen können.

Fast ein Drittel der Patienten mit Lungentuberkulose kann feststellen, dass das Niveau der Insulinämie in ihnen sehr niedrig ist und nähert sich der unteren Grenze der Norm, während 13-20% bemerkenswerten Hyperinsulinismus beobachten. Sowohl der relative Hypo- als auch der Hyperinsulinismus sind Risikofaktoren für die Entstehung von Verstößen gegen den Kohlenhydratstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß. Diese Veränderungen in der funktionellen Aktivität von B-Zellen der Bauchspeicheldrüse erfordern eine regelmäßige Überwachung der Glykämie bei Patienten mit Tuberkulose und rechtzeitige Prävention von Diabetes mellitus. Außerdem. Dies dient als zusätzliche Rechtfertigung für die Zweckmäßigkeit der Verwendung physiologischer Insulindosen bei der komplexen Tuberkulintherapie.

Im Allgemeinen unteren Ebenen der Schilddrüsenhormone und deren Ungleichgewicht Hyperkortisolämie und Hyperinsulinismus größter Reichweite bei Patienten mit schweren Verlauf des tuberkulösen Prozesses, mit umfangreichen Lungenschäden und schweren Symptomen der Tuberkulose Rausch.

Mikrobiologische Diagnose von Tuberkulose

Mikrobiologische Studien sind notwendig, um Patienten mit Tuberkulose zu identifizieren, die Diagnose zu überprüfen, die Chemotherapie zu überwachen und zu korrigieren, die Behandlungsergebnisse zu bewerten, mit anderen Worten, von dem Zeitpunkt an, an dem der Patient vor dem Absetzen mit Tuberkulose registriert wird.

Alle epidemiologischen Programme und Projekte basieren auf einer Bewertung der Anzahl der bakteriellen Ausscheidungen, die nicht ohne Labormethoden zum Nachweis von Mykobakterien-Tuberkulose durchgeführt werden kann. Bei einer Untersuchung der sogenannten unorganisierten Bevölkerung erreicht der Anteil der bakteriellen Eindringlinge 70 oder mehr, was Labormethoden zu einem ausreichend wirksamen Mittel zur Identifizierung von Tuberkulosepatienten in dieser Bevölkerungsgruppe macht.

Traditionelle mikrobiologische Methoden zur Diagnose von Tuberkulose sind bakterioskopische und Kulturstudien. Moderne Methoden betrachten die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis in automatisierten Systemen, die Einstellung von PCR. All diese Methoden verbinden sich jedoch notwendigerweise mit klassischen bakteriologischen Methoden.

Sammlung von Diagnosematerial

Die Wirksamkeit von Laboruntersuchungen hängt in hohem Maße von der Qualität des diagnostischen Materials ab. Die Einhaltung der Regeln für die Sammlung, Lagerung und den Transport von Diagnosematerial und die genaue Implementierung des Algorithmus zur Patientenbeurteilung beeinflusst direkt das Ergebnis und gewährleistet die biologische Sicherheit.

Zum Testen auf Tuberkulose werden verschiedene Materialien verwendet. Aufgrund der Tatsache, dass TB logkih- häufigste Form tuberkulösen Läsionen, Sputum und anderen Arten von abnehmbaren tracheobronchial das Grundmaterial für die Forschung berücksichtigen: die oberen Atemwege Sekrete, erhalten nach Aerosolinhalation: BAL; bronchoalveoläre Spülungen; Material, das durch Bronchoskopie, transtracheale und intrapulmonale Biopsie gewonnen wurde: Aspirat aus den Bronchien, Kehlkopfschläge, Exsudate, Ausstriche aus Wunden usw.

Die Wirksamkeit der Forschung erhöht sich, wenn eine kontrollierte Sammlung von Material von einem Patienten durchgeführt wird. Zu diesem Zweck wird ein speziell ausgestatteter Raum zugewiesen oder spezielle Kabinen gekauft. Die Sammlung von Material ist ein gefährliches Verfahren, daher ist es notwendig, Material für die Forschung unter Beachtung der Regeln der infektiösen Sicherheit zu sammeln.

Das Material für die Untersuchung auf Mycobacterium tuberculosis wird in sterilen Flaschen mit fest verschraubten Kappen gesammelt, um eine Kontamination der Umwelt zu verhindern und das gesammelte Material vor Kontamination zu schützen.

Ampullen zur Sammlung von Diagnosematerial müssen die folgenden Anforderungen erfüllen:

• muss aus schlagfestem Material sein;
• sollte beim Autoklavieren leicht schmelzen;
• genügend Volumen haben (40-50 ml):
• haben eine breite Öffnung für die Sputumsammlung (Durchmesser nicht weniger als 30 mm);
• einfach zu handhaben, transparent oder durchscheinend sein, so dass Sie die Menge und Qualität der entnommenen Probe beurteilen können, ohne den Deckel zu öffnen.

Um optimale Forschungsergebnisse zu erhalten, müssen folgende Bedingungen eingehalten werden:

• Sammeln Sie das Material vor Beginn der Chemotherapie;
• Material für die Studie muss vor der morgendlichen Aufnahme von Nahrung und Medizin gesammelt werden;
• für die Forschung ist es wünschenswert, mindestens 3 Proben von Morgen Schleim zu sammeln. Sammeln Sie Sputum für 3 aufeinanderfolgende Tage;
• Das gesammelte Material muss so schnell wie möglich an das Labor geliefert werden:
• in dem Fall, in dem es unmöglich ist, das Material an das Laboratorium zu liefern, wird es im Kühlschrank bei einer Lufttemperatur von 4 ° C für nicht mehr als 48 Stunden gelagert;
• Beim Transport des Materials muss die Integrität der Fläschchen genau überwacht werden.

Richtig gesammeltes Sputum ist schleimig oder mukopurulent. Das optimale Volumen des getesteten Sputums beträgt 3-5 ml.

Sputum wird unter der Aufsicht eines Arztes gesammelt. Die für die Sputumsammlung verantwortlichen Personen sollten die Umsetzung bestimmter Regeln befolgen:

• Es ist notwendig, dem Patienten den Zweck der Studie und die Notwendigkeit zu erklären, nicht Speichel oder Nasen-Rachen-Schleim zu husten, sondern den Inhalt der tiefen Atemwege. Dies kann als Folge eines produktiven Hustens nach mehreren (2-3) tiefen Atemzügen erreicht werden. Es ist auch notwendig, den Patienten zu warnen, dass er seinen Mund mit kochendem Wasser spülen sollte, um den Hauptteil der Mikroflora, die in der Mundhöhle wächst, und Essensreste, die die Untersuchung von Sputum behindern, zu entfernen;
• ein an der Sputumsammlung beteiligter medizinischer Arbeiter muss neben einem Bademantel und einem Hut eine Maske, Gummihandschuhe und eine Gummischürze tragen;
• Wenn er hinter dem Patienten steht, wird empfohlen, die Flasche so nahe wie möglich an seinen Lippen zu halten und sofort Schleim in den Husten einzuteilen, und es muss vorgesehen sein, dass der Luftstrom vom Gesundheitsarbeiter weggeleitet wird:
• Nach Beendigung der Sputumsammlung sollte der Gesundheitsarbeiter die Ampulle vorsichtig mit einem Deckel verschließen und die Menge und Qualität des gesammelten Sputums beurteilen. Dann wird die Flasche etikettiert und in einen speziellen Bix für den Transport ins Labor gebracht.

Wenn der Patient nicht produziert Schleim, in der Nacht zuvor und am frühen Morgen am Tag der Sammlung des Materials notwendig ihm einen schleimlösende :. Einen Extrakt aus der Wurzel von Eibisch (mukaltin) zu geben, Bromhexin, Ambroxol, usw. - oder irritierend Inhalation mit Hilfe von Geräten im Raum installiert gelten sammeln Schleim. Das auf diese Weise gesammelte Material unterliegt keiner Konservierung und sollte am Tag der Sammlung untersucht werden. Um zu vermeiden, dass er im Labor in der Richtung "culling" wird, sollte er eine besondere Markierung hinterlassen.

Wenn in dieser Einrichtung keine mikrobiologischen Untersuchungen durchgeführt werden, sollte das entnommene Diagnosematerial zentral an das Labor geliefert werden, vorausgesetzt, dass das Material in den Intervallen zwischen den Lieferungen im Kühlschrank oder unter Verwendung von Konservierungsmitteln konserviert wird. Liefern Sie Material in Transportboxen, die leicht desinfiziert werden können. Jede Probe sollte mit dem entsprechenden Etikett versehen sein, und das gesamte Los sollte mit einem Begleitformular ausgefüllt werden.

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Modi und Häufigkeit der Untersuchung von Patienten

Bei der ersten, sogenannten diagnostischen Untersuchung eines Patienten auf Tuberkulose ist es notwendig, mindestens 3 Sputumportionen für 2 oder 3 Tage zu untersuchen. Gesammelt unter der Aufsicht von medizinischem Personal, was die Wirksamkeit der Mikroskopie erhöht.

Das primäre Screening auf Tuberkulose sollte von allen medizinischen Diagnoseeinrichtungen des Gesundheitswesens durchgeführt werden. In jüngster Zeit wurden so genannte Mikroskopiezentren, die mit modernen Mikroskopen und Geräten für epidemische Sicherheit ausgestattet sind, auf der Grundlage klinischer Diagnoselabors organisiert, um die Effizienz der Erstuntersuchung zu verbessern.

In Anti-TB-Einrichtungen wird ein Screening-Test verwendet, der Sputumuntersuchung oder anderes diagnostisches Material für mindestens 3-mal für 3 Tage einschließt. Während der Behandlung werden während der intensiven Chemotherapie-Phase mindestens einmal monatlich mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt. Beim Übergang in die Behandlungsphase werden Studien seltener durchgeführt - mit einem Intervall von 2-3 Monaten, während die Häufigkeit der Studie auf zwei reduziert wird.

Merkmale der Sammlung von Diagnosematerial für extrapulmonale Tuberkulose

Die Besonderheit des pathologischen Materials bei extrapulmonalen Formen der Tuberkulose ist die geringe Konzentration von Mycobacterium tuberculosis darin, die empfindlichere Methoden der mikrobiologischen Untersuchung erfordert, vor allem die Methoden der Aussaat auf dem Nährboden.

Bei Tuberkulose des Urogenitalsystems ist Urin das am besten zugängliche Studienmaterial. Die Urinentnahme sollte von einer speziell ausgebildeten Krankenschwester durchgeführt werden.

Die äußeren Genitalien werden mit Wasser oder mit einer schwachen Lösung von Kaliumpermanganat gewaschen. Die äußere Öffnung der Harnröhre wird sorgfältig behandelt. In einer sterilen Ampulle wird ein durchschnittlicher Anteil des Morgenharns gesammelt: bei Männern natürlich, bei Frauen mit einem Katheter. Urin aus dem Nierenbecken wird in sterilen Röhrchen mit Katheterisierung von einer oder zwei Nieren gesammelt, in letzterem Fall - notwendigerweise getrennt von jeder Niere. Eine kleine Menge dieses Urins wird zentrifugiert, das Sediment wird untersucht.

Bei Männern, Spermien, punktförmigen Hoden wird das Geheimnis der Prostata einer Zentrifugation unterzogen, um einen Niederschlag zu erhalten. Bei jeder Lokalisierung eines spezifischen Prozesses im Genitalbereich bei Männern kann Prostatamassage die Sekretion von Sekreten fördern, die Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Menstruationsblut bei Frauen wird durch Saugen oder Verwenden einer Kafka-Kappe gesammelt. Das erhaltene Material wird von roten Blutzellen befreit, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend zentrifugiert. Der Niederschlag wird untersucht.

Zuteilungen aus dem Gebärmutterhalskanal des Uterus werden in einer gewissen Kafka-Kapazität oder -Kappe gesammelt, das heißt, es ist wünschenswert, 1-2 ml pathologisches Material zu akkumulieren.

Material aus operativen Eingriffen an den Nieren, Genitalien. Mit Biopsien, Scrapings aus dem Endometrium, homogenisieren. Dazu wird es in einen sterilen Mörser gegeben und mit einer sterilen Schere gründlich zerkleinert. Zu dieser Aufschlämmung wurde in einer Menge gleich sein Gewicht steriles Flußsand zugegeben und dann gekrönt mit 0,5-1.0 ml isotonischer Kochsalzlösung auf, und alles wurde, bis eine pastöse Masse unter Zugabe von isotonischer Natriumchloridlösung (4-5 ml) verrieben. Dann lässt man die Masse 1-1,5 Minuten absitzen, der Überstand wird untersucht.

Tuberkulose von Knochen und Gelenken. Das mit einer sterilen Spritze erhaltene Punktier (Abszess) wird in steriles Geschirr gegeben und sofort ins Labor gebracht. Die sterile Pipette, die zuvor mit steriler isotonischer Kochsalzlösung befeuchtet wurde, nimmt 2-5 ml Eiter auf, überführt sie in eine Flasche mit Kügelchen und fügt weitere 2-3 ml isotonische Kochsalzlösung hinzu. Die Flasche wird mit einem Korken verschlossen und in einem Joker-Apparat für 8-10 Minuten geschüttelt. Die homogenisierte Suspension wird untersucht.

Bei fistulösen Formen osteoartikulärer Tuberkulose wird Eiter aus der Fistel entnommen. Der ausgiebige Abfluss wird direkt in einem Reagenzglas gesammelt. Bei spärlicher Ausscheidung von Eiter wird die Fistel mit einer sterilen isotonischen Natriumchloridlösung gewaschen und das Waschwasser, das in einem Teströhrchen oder einem mit Eiter imprägnierten Stück eines Tampons gesammelt wird, zur Untersuchung geschickt.

Das bei chirurgischen Eingriffen an Knochen und Gelenken gewonnene chirurgische Material kann aus eitrig-nekrotischen Massen, Granulationen, Narbengewebe, Knochengewebe, Synovialmembrangewebe und anderen Substraten bestehen. Seine Behandlung wird wie bei Tuberkulose der Nieren durchgeführt.

Die mikrobiologische Untersuchung der Synovialflüssigkeit in einer 3% igen Natriumcitratlösung (Verhältnis 1: 1) zur Verhinderung der Koagulation wird unmittelbar nach der Punktion durchgeführt.

Tuberkulose der Lymphknoten. Der bei der Punktion der Lymphknoten extrahierte Eiter wird ebenfalls untersucht. Als Eiter der Abszesse. Die Gewebe der Lymphknoten, die während der chirurgischen Eingriffe, Biopsien erhalten werden, werden untersucht, wie bei anderen Formen der Tuberkulose.

Die Untersuchung von Stuhlmassen auf Mycobacterium tuberculosis ist äußerst selten, da fast keine positiven Ergebnisse vorliegen.

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Mycobacterium Mikroskopie

Sputum-Mikroskopie ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Methode, die in allen Fällen mit Verdacht auf Tuberkulose verwendet werden sollte. Darüber hinaus wird diese Studie durchgeführt, um die Wirksamkeit der Chemotherapie zu bewerten und die Wiederherstellung oder das Scheitern der Behandlung festzustellen, wenn es keinen Kulturtest gibt.

Zwei Methoden der mikroskopischen Untersuchung werden verwendet:

• Methode der direkten Mikroskopie, wenn ein Abstrich direkt aus dem diagnostischen Material hergestellt wird;
• Verfahren zur Mikroskopie eines Sediments, das aus mit Dekontaminant behandeltem Material für die Kultur hergestellt wurde.

Die erste Methode wird in solchen Laboratorien verwendet, in denen nur mikroskopische Studien durchgeführt werden (klinische und diagnostische Laboratorien des allgemeinen medizinischen Netzes).

Die besten Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung werden durch Konzentration des diagnostischen Materials (zum Beispiel durch Zentrifugation) erhalten.

Um Mycobacterium tuberculosis mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% bei der Durchführung der Mikroskopie nachzuweisen, sollte 1 ml Sputum mehr als 5000 Mikrobenzellen enthalten. Das Sputum von Patienten mit pulmonalen Formen der Tuberkulose enthält in der Regel eine erhebliche Menge an säurefesten Bakterien, die durch die Bakterioskopie sicher nachgewiesen werden können. Die diagnostische Empfindlichkeit dieser Methode kann verbessert werden, indem mehrere Sputumproben von einem Patienten untersucht werden. Ein negatives Ergebnis einer bakterioskopischen Untersuchung schließt die Tuberkulosediagnose nicht aus, da das Sputum einiger Patienten weniger Mykobakterien enthält, als mit der Mikroskopie nachgewiesen werden können. Eine schlechte Präparation des Sputumabstrichs kann auch ein negatives Ergebnis einer bakterioskopischen Untersuchung verursachen.

Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von säurefesten Mykobakterien im Abstrich ist die Farbe nach Tsiol-Nelsen. Das Verfahren basiert auf der Penetration von Karbolfuchsin in eine mikrobielle Zelle durch eine Membran, die eine Wachs-Lipid-Schicht einschließt, während gleichzeitig eine starke und starke Ätzwirkung von Phenol auftritt. Eine anschließende Verfärbung des Schmiermittels mit einer 25% igen Lösung von Schwefelsäure oder 3% iger Salzsäure führt zu einer Verfärbung aller nicht säurefesten Strukturen. Die verfärbten Elemente des Abstrichs werden mit einer 0,3% igen Lösung von Methylenblau gefärbt. Mycobakterien nehmen die üblichen Anilinfarbstoffe nicht wahr, wodurch säurefeste Mykobakterien karminrot gefärbt werden und andere Mikroben und zelluläre Elemente - in blau.

Um die von Tsilyu-Nelsen gefärbten Abstriche zu untersuchen, verwenden Sie ein leichtes binokulares Mikroskop mit einem Immersionsobjektiv (90- oder 100-fache Vergrößerung) und ein Okular mit 7- oder 10-facher Vergrößerung. Erkunden Sie 100 Sichtfelder, die ausreichen, um einzelne Mykobakterien im Abstrich zu identifizieren. Für den Fall, dass das Ergebnis einer solchen Studie negativ ist, wird empfohlen, zur Bestätigung weitere 200 Gesichtsfelder zu betrachten. Notieren Sie die Ergebnisse und geben Sie die Anzahl der nachgewiesenen säurefesten Bakterien (KUM) an.

Zusätzlich zu dieser Technik werden Farbfluorochrome für die Lumineszenzmikroskopie verwendet, wodurch die besten Ergebnisse erzielt werden können. Die Verwendung dieser Methode erhöht die Effizienz der Mikroskopie um 10-15%. Bei der Behandlung von Mykobakterien mit Lumineszenzfarbstoffen (Auramin, Rhodamin etc.) binden diese Substanzen auch an die wachsartigen Strukturen der Mikrobenzelle. Wenn farbige Zellen mit einer anregenden Lichtquelle (einem bestimmten Spektrum von ultravioletter Strahlung) bestrahlt werden, beginnen sie mit orange oder hellrotem Licht auf einem schwarzen oder dunkelgrünen Hintergrund zu leuchten. Aufgrund der hohen Helligkeit und des hohen Kontrastes des sichtbaren Bildes kann die Gesamtvergrößerung des Mikroskops um das 4-10-fache verringert werden, das Gesichtsfeld wird breiter und die Betrachtungszeit des Medikaments nimmt ab. Zusammen mit diesem, aufgrund der viel größeren Tiefe des Feldes, können Sie den Komfort des Studiums erhöhen.

Wenn Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um die gleiche Fläche zu scannen, verbraucht der Abstrich signifikant weniger Zeit als die Lichtmikroskopie der Tsiol-Nelsen-Färbung. Wenn ein Mikroskop an einem Arbeitstag etwa 20-25 solcher Abstriche untersucht, kann er mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie mehr als 60-80 Proben gleichzeitig untersuchen. Erfahrene Mikroskopiker wissen, dass die Färbung von Zellen mit einer Mischung aus Auramin und Rhodamin in gewisser Weise spezifisch für säurefeste Bazillen ist, die in diesem Fall wie goldene Stäbchen aussehen. Saprophyten sind in einer grünlichen Farbe gemalt.

Ein weiterer wichtiger Vorteil des Verfahrens der Fluoreszenzmikroskopie - die Fähigkeit, verändertes Mycobacterium zu erkennen, verloren unter dem Einfluss von negativen Faktoren, einschließlich intensiver Chemotherapie, kislotousotoychivosti Eigenschaft und ist nicht im Zusammenhang mit dieser Färbung Ziehl-Nelsenu nachgewiesen.

Zu den Nachteilen der Fluoreszenzmikroskopie gehören die relativ hohen Kosten des Mikroskops und dessen Betrieb. In zentralisierten oder anderen großen Laboratorien, in denen die Belastung die Norm von 3 Labortechnikern überschreitet, die mit drei herkömmlichen Mikroskopen arbeiten, ist es jedoch billiger, stattdessen ein Fluoreszenzmikroskop zu verwenden.

Bakterioskopische Methoden haben eine ziemlich hohe Spezifität (89-100%). Ungefähr 97% der positiven Ergebnisse, die mit irgendeiner Methode der Mikroskopie erhalten werden, werden durch die Ergebnisse der Aussaat eindeutig bestätigt.

Es sollte angemerkt werden, dass es bei mikroskopischer Untersuchung des Abstrichs von pathologischem Material unmöglich ist, die Spezies zu bestimmen, die zu den identifizierten säurefesten Mycobakterien gehört. Mikroskopierverfahren ermöglichen eine Beurteilung nur auf der Gegenwart oder Abwesenheit von Säure bei der Herstellung von Mikroorganismen zu ergeben, die durch die Existenz in der Natur von einer großen Anzahl von morphologisch ähnlich zu tuberkulösen Mycobakterien Komplex nontubercular säurebeständig Mikroorganismen erklärt werden können.

Die Ergebnisse der Mikroskopie werden in semiquantitativen Einheiten ausgewertet.

Um die Ergebnisse verschiedener Methoden der Mikroskopie vergleichen zu können, werden empirische Koeffizienten eingeführt. Um beispielsweise die Ergebnisse von Abstrichen mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Datenrecherche Lichtmikroskop (1000-fache Vergrößerung) gefärbt zu vergleichen, ist es notwendig, die Anzahl der säurefesten Bacilli durch das Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen zu unterteilen, der entsprechende Koeffizient bei 250-facher Vergrößerung - bis 10, 450-fach - bis 4, mit 630-fach - bis 2.

Merkmale der Mikroskopie für extrapulmonale Tuberkulose

Die direkte Mikroskopie wird ebenso durchgeführt wie die Mikroskopie von Abstrichen, die nach der Anreicherung hergestellt wurden, gefolgt von einer Tsiol-Nelsen-Färbung oder Lumineszenzfarbstoffen. Die direkte Mikroskopie von Abstrichen ist aufgrund einer geringen Konzentration von Mykobakterien in dem Material ineffektiv, und daher ist es rationaler, Anreicherungsmethoden zu verwenden. Am effektivsten ist die Zentrifugation. Wenn das biologische Material viskos ist, wird Zentrifugation mit gleichzeitiger Homogenisierung und Verflüssigung des Materials verwendet, was unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitszentrifugen mit einer Zentrifugalkraft von 3000 g und Hypochloritlösungen durchgeführt wird. Andere Anreicherungsmethoden, wie die Mikroflotation, werden derzeit wegen der Bildung von biologisch gefährlichen Aerosolen nicht verwendet.

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Die kulturelle Methode der Diagnose von Tuberkulose

Die Aussaatmethode oder die Kulturmethode ist empfindlicher als die Abstrichmikroskopie und hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber der Abstrichmikroskopie. Es erlaubt, mehrere Dutzend lebensfähige Mykobakterien im Testmaterial nachzuweisen und hat einen hohen diagnostischen Wert. Dies ist besonders wichtig, wenn das Material von neu diagnostizierten oder behandelten Patienten untersucht wird, die eine kleine Menge an Mykobakterien freisetzen.

Im Vergleich zur Mikroskopie erlaubt die Kulturforschung, die Anzahl der diagnostizierten TB-Patienten um mehr als 15-25% zu erhöhen und Tuberkulose in früheren Stadien zu überprüfen, wenn die Krankheit noch behandlungsfähig ist. Ein sehr wichtiger Vorteil des Kulturtests ist die Möglichkeit, eine Erregerkultur zu erhalten, die im Hinblick auf Arzneimittelempfindlichkeit, Virulenz und andere biologische Eigenschaften identifiziert und untersucht werden kann.

Die Nachteile der Anbaumethoden sind ihre Dauer (die Wartezeit der Materialien beträgt 10 Wochen). Höhere Kosten, Komplexität der Verarbeitung von Diagnosematerial.

Prinzipien der vorausschauenden Behandlung von diagnostischem Material

Herkömmliche mikrobiologische Methoden können nicht zur Durchführung von Studien über Tuberkulose verwendet werden. Dies ist aufgrund der Tatsache. Dass Mycobacterium tuberculosis sehr langsam wächst und die meisten klinischen Proben schnell wachsende pyogene und fäulnisbildende Mikroorganismen, Pilze, enthalten. Ihr schnelles Wachstum auf reichhaltigen Nährmedien beeinträchtigt die Entwicklung von Mykobakterien und erlaubt keine Isolierung des Erregers der Tuberkulose, so dass das diagnostische Material vor dem Aussäen vorbehandelt werden muss. Zusätzlich sind Mykobakterien, die aus den Atemwegen des Patienten freigesetzt werden, gewöhnlich von einer großen Menge Schleim umgeben, was es schwierig macht, sich zu konzentrieren. In dieser Hinsicht ist vor dem Einpflanzen von Sputum und anderen ähnlichen Materialien deren Verflüssigung, Dekontamination notwendig.

Alle Detergentien und Dekontaminate haben eine mehr oder weniger ausgeprägte toxische Wirkung auf Mykobakterien. Als Folge der Verarbeitung können bis zu 90% der Mykobakterien absterben. Um genug von der mykobakteriellen Bevölkerung zu halten, wodurch die Notwendigkeit sparsam Verarbeitungstechniken zu verwenden, die auf der einen Seite ermöglichen, die schnell wachsenden pyogenen Bakterien und faulig zu unterdrücken, und auf dem anderen - die Lebensfähigkeit von Mykobakterien in dem Material zu erhalten.

Je nach dem Material, dessen Homogenitätsgrad und Verschmutzung für die Vorverarbeitung verschiedene Dekontaminations Verwendung: Sputum - 4% iger Natronlauge, Lösungen trohzameschonnogo Natriumphosphat 10%, Benzalkoniumchlorid, Trinatriumphosphat, NALC-NaOH (N-Acetyl-L-cystein Natriumhydroxid) bei einer Endkonzentration von 1% NaOH, in Urin und anderen flüssigen Materialien - Schwefelsäurelösung 3%, für die kontaminierten Proben, fetthaltige Materialien - Lösung von Oxalsäure bis 5%. Zusätzlich werden in einigen Fällen Enzyme, Tenside (Detergentien) verwendet. Die Verwendung von Tween und einigen anderen Detergentien geht mit einem geringeren Tod von Mykobakterienzellen einher (40-50% überleben). Sie können jedoch nur für flüssige Materialien verwendet werden. Die größte Verbreitung in der Welt war NALC-NaOH. In Sätzen produziert. Diese Methode erlaubt mehr als 85% der Bevölkerung von Mykobakterienzellen zuzuordnen. Die Dekontamination von Stoff enthaltenden festen Materialien ist schwieriger, da es schwierig ist, den Grad der Dispersion des Materials während des Homogenisierungsprozesses zu erraten. Zum Beispiel ist die Behandlung von Biopsien von Lymphknoten oft von einer erhöhten Häufigkeit von Kontamination durch fremde Flora begleitet. In diesem Fall kann 1% Etonium verwendet werden.

Inhomogenes Material wird mit Glasperlen in Gegenwart von Dekontaminationsmitteln homogenisiert. Die flüssigen Materialien werden vorzentrifugiert und nur ein Niederschlag wird behandelt.

Aussaat- und Inkubationstechniken

Nach der Vorbehandlung wird das Material zentrifugiert, wodurch die Mykobakterien ausgefällt und ihr Gehalt im Sediment erhöht wird ("slud enrichment"). Der resultierende Niederschlag wird neutralisiert und mit dichten Nährmedien oder Röhrchen mit flüssigen (halbflüssigen) Medien inokuliert (inokuliert). Aus dem Rest des Sediments werden Abstriche für die mikroskopische Untersuchung vorbereitet. Die Seeding-Technik sollte eine Kreuzkontamination des diagnostischen Materials verhindern.

Für eine zuverlässige klinische Interpretation der Ergebnisse einer mikrobiologischen Studie muss die folgende Regel beachtet werden: Mikroskopische und Kulturstudien müssen parallel von der gleichen Probe des diagnostischen Materials durchgeführt werden.

Die inokulierten Röhrchen werden in einem Thermostat bei 37 ^° C für 2 Tage in einer horizontalen Position angeordnet. Dies gewährleistet eine gleichmäßigere Absorption des Materials in das Kulturmedium. Nach 2 Tagen werden die Röhrchen in eine vertikale Position überführt und mit Gummi- oder Silikonstopfen hermetisch verschlossen, um ein Austrocknen des ausgesäten Mediums zu verhindern.

Kulturen werden bei 37 inkubiert ^etwa C für 10-12 Wochen mit regelmäßiger wöchentlicher Betrachtung. Für jede Vorschau werden die folgenden Parameter aufgezeichnet:

• der Zeitraum, der vom Tag des Aussaatwachstums visuell beobachtet wurde;
• Wachstumsrate (Anzahl der CFUs);
• Kontamination der Pflanze durch eine fremde mikrobielle Flora oder Pilze (solche Röhren werden entfernt);
• Mangel an sichtbarem Wachstum. Die Schläuche bleiben bis zur nächsten Betrachtung im Thermostat.

Nährmedien

Verschiedene Nährmedien werden für die Kultivierung von Mykobakterien verwendet; dicht, halbflüssig, flüssig. Keines der bekannten Nährmedien weist jedoch Eigenschaften auf, die das Wachstum aller mykobakteriellen Zellen gewährleisten. In diesem Zusammenhang wird empfohlen, 2-3 Nährmedien unterschiedlicher Zusammensetzung gleichzeitig zu verwenden, um die Wirksamkeit zu erhöhen.

Die WHO empfiehlt die Levenstein-Jensen-Umgebung als Standardmedium für die primäre Isolierung des Erregers der Tuberkulose und zur Bestimmung ihrer Arzneimittelempfindlichkeit. Dies ist eine dichte Eiumgebung, auf der das Wachstum von Mycobakterien am 20. Bis 25. Tag nach dem Impfen eines bakterioskopisch positiven Materials erhalten wird. Kulturen von bakterioskopisch negativem Material erfordern eine längere Inkubationszeit (bis zu 10-12 Wochen).

In unserem Land ist der vorgeschlagene E.R. Finnei-Umgebung Finn-II. Es unterscheidet sich dadurch, dass es anstelle von L-Asparagin Natriumglutamat verwendet, das andere Wege zur Synthese der Aminosäuren von Mycobakterien auslöst. Das Wachstum tritt auf diesem Medium etwas früher auf und die Häufigkeit der Allokation von Mycobakterien ist 6-8% höher als im Lowenstein-Jensen-Medium.

Um die Wirksamkeit der bakteriologischen Diagnostik der extrapulmonalen Tuberkulose zu verbessern, ist es ratsam, modifizierte Finn-II-Medien in den Nährmedienkomplex einzubauen. Um das Wachstum zu beschleunigen, wird dem Finn-II-Nährmedium zusätzlich ein Natriumthioglycolat 0,05% zugesetzt, das die Sauerstoffkonzentration reduziert. Um die Enzymsysteme von Mycobakterien vor toxischen Produkten der Lipidperoxidation in dem Finn-II-Nährmedium zu schützen, wird antioxidierendes α-Tocopherolacetat in einer Konzentration von 0,001 ug / ml zugegeben. Die Aussaat des Diagnosematerials erfolgt nach einem Standardverfahren.

In Russlands Anti-Tuberkulose-Labors werden auch andere Modifikationen von dichten Nährmedien verwendet; vorgeschlagen G.G. Mordwinisches Nährmedium "New", entwickelt von V.A. Anicic Nährmedien A-6 und A-9 usw.

Aufgrund der Schädigung verschiedener metabolischer Systeme der Mikrobenzelle während der Chemotherapie verliert ein Teil der mykobakteriellen Population seine Fähigkeit, sich auf normalen Nährmedien normal zu entwickeln, und erfordert osmotisch ausgeglichene (halbflüssige oder flüssige) Nährmedien.

Bewertung und Aufzeichnung von Aussaatergebnissen von Diagnosematerial

Einige Stämme und Arten von Mykobakterien wachsen langsam, Wachstum kann sogar bis zum 90. Tag auftreten. Die Anzahl solcher Feldfrüchte ist gering, aber dies macht es möglich, Pflanzen in einem Thermostat für 2,5-3 Monate zu widerstehen.

Virulente Kulturen von Mycobacterium tuberculosis wachsen gewöhnlich in dichter Eiumgebung in Form von Kolonien in R-Form verschiedener Größen und Arten. Kolonien trocken, faltig, Elfenbein, leicht pigmentiert. In anderen Medien kann die Kolonie von Mycobacterium tuberculosis feuchter sein. Nach einer Chemotherapie oder während der Behandlung können glatte Kolonien mit feuchtem Wachstum (S-Formen) zugeordnet werden.

Bei der Isolierung von Kulturpflanzen wird eine Reihe spezieller Studien verwendet, um Mycobacterium tuberculosis von Nicht-Tuberkulose-Mykobakterien und säureresistenten Saprophyten zu unterscheiden.

Eine positive Antwort wird nach einer obligatorischen mikroskopischen Untersuchung des gefärbten Tsiol-Nelsen-Abstrichs aus den gewachsenen Kolonien gegeben. Beim Wachstum von Mykobakterien in Abstrichen werden hellrote Stifte gefunden, die einzeln oder in Gruppen liegen und Cluster in Form von Filz oder Geflechten bilden. In jungen Kulturen, vor allem, isoliert aus der Langzeitbehandlung von Patienten mit Chemotherapie unterscheiden Mykobakterien des exprimierten Polymorphismus, bis das Vorhandensein von stabförmigen, mit kurzen, fast coccoid oder verlängerten Versionen, die Myzel ähneln.

Die Wachstumsrate von Mycobakterien wird durch das folgende Schema angezeigt: (+) - 1-20 cfu in vitro (geringe bakterielle Ausscheidung); (++) - 20-100 KBE in vitro (mäßige bakterielle Ausscheidung); (+++) -> 100 KBE in vitro (reichlich bakterielle Ausscheidung). Bei der Labordiagnostik der Tuberkulose genügt es nicht zu beantworten, ob das Mycobakterium durch die eine oder andere Methode nachgewiesen wird. Haben ein detailliertes Verständnis des Ausmaßes und der Art der Mykobakterienpopulation, ihrer Zusammensetzung und Eigenschaften. Es sind diese Daten, die uns erlauben, den Zustand des Prozesses richtig zu interpretieren, Taktiken zu planen und die Behandlung rechtzeitig zu korrigieren.

In den letzten Jahren wurden zur Beschleunigung des Wachstums von Mykobakterien Nährmedien auf Agar-Basis mit verschiedenen Wachstumsadditiven und die Verwendung einer speziellen Gasmischung vorgeschlagen. Um das Wachstum von Mykobakterien auf diesen Medien zu erhalten, wird während der Kultivierung eine Atmosphäre mit einem hohen Gehalt an Kohlendioxid (4-7%) erzeugt. Spezielle CO ₂ -Inkubatoren werden für diesen Zweck verwendet . Die am weitesten entwickelten automatisierten Systeme für die Kultivierung von Mykobakterien: MGIT-BACTEC-960 und MB / Bact.

Ein solches System - MGIT System (Mykobakterien Wachstum anzeigt Röhre), die für die Entwicklung von High-Tech bezieht und für die schnelle bakteriologische Diagnose von Tuberkulose und Mycobacterium Anfälligkeit für First-Line-Medikamente bestimmt sind, und einige Second-Line-Medikamente. MGIT konzentriert sich darauf, es als Teil des VASTES-960-Geräts zu verwenden. Mikroorganismen werden in speziellen Röhrchen mit einem flüssigen Nährmedium auf Basis des modifizierten Middlebrook-7H9-Mediums kultiviert. Um das Wachstum von Mykobakterien zu stimulieren und das Wachstum von Fremdmikroflora zu unterdrücken, werden MGIT Growth Supplement und eine Mischung von PANTA antibakteriellen Arzneimitteln verwendet.

Das Wachstum von Mikroorganismen wird optisch aufgezeichnet. Es basiert auf der Fluoreszenz, die auftritt, wenn Sauerstoff während des Wachstums von Mycobakterien verbraucht wird. Sauerstoffabhängiger fluorochromer Farbstoff wird auf dem Boden eines speziellen Reagenzglases gefunden und mit einer Silikonschicht bedeckt. Reproduction Mykobakterien führt zu einer Abnahme der Menge an Sauerstoff in dem Rohr und Verminderung der Konzentration, die eine Erhöhung der Fluoreszenz verursacht, die unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht Röhren und automatisch registriert Photoeinbaugerät VASTES-960 sichtbar wird. Die Intensität der Lumineszenz wird in Einheiten des Wachstums (GU-Wachstumseinheiten) aufgezeichnet. Die Wachstumsdaten werden im Computer gespeichert und können dort automatisch gespeichert werden. Die Computeranalyse von Wachstumskurven können Informationen über das Vorhandensein einer Vielzahl von Mycobacterium-Pools, einschließlich nontubercular und hilft auch, die Wachstumseigenschaften von Mykobakterien zu bewerten.

Als ein Ergebnis der Zeit des Auftretens solcher Systeme ist mykobakteriellen Wachstum signifikant reduziert, 11 Tage VASTES-960 und 19 Tage auf MB / Bact bis 33 Tage auf dem Standard-Fest Nährmedium mittelt. Es ist zu beachten, dass diese Systeme hochqualifiziertes Personal erfordern. Die Aussaat des Materials auf flüssigen Medien wird notwendigerweise von der Aussaat auf dem Levenstein-Jensen-Medium begleitet, das die Rolle eines Duplikators in den Fällen spielt, in denen das Mycobacterium tuberculosis keine anderen Medien hervorbringt.

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Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien

Die Bestimmung des Spektrums und des Grades der Empfindlichkeit von Mycobakterien gegen Tuberkulosemedikamente ist von großer klinischer Bedeutung, ebenso wie für die epidemiologische Bewertung der Ausbreitung von Tuberkulose mit Arzneimittelresistenz. Darüber hinaus ermöglicht das Monitoring der Arzneimittelresistenz die Beurteilung der Wirksamkeit des Tuberkuloseprogramms insgesamt, da es ein integraler Indikator für die Leistungsfähigkeit aller Komponenten der Tuberkulosebekämpfung ist.

Multiplizität und Zeitpunkt der Medikamentensensitivität:

• vor dem Beginn der Behandlung einmal für die Festlegung der Strategie und Taktik der Behandlung:
• Bei der Isolierung aus erkrankten Kulturen aus verschiedenen Materialien (Sputum, BAL-Flüssigkeit, Urin, Exsudate, Liquor etc.) werden alle isolierten Stämme untersucht:
• am Ende der intensiven Behandlungsphase ohne klinische und radiologische Dynamik:
• wenn es notwendig ist, das Behandlungsschema in den folgenden Fällen zu ändern:
  • Fehlen von Sputumausstrich;
  • erneute Isolierung der Kultur nach Sputum-Abstrich-negativ;
  • eine drastische Zunahme der CMB im Tupfer nach dem anfänglichen Rückgang. Es ist bekannt, dass Stämme von Mycobacterium tuberculosis, die hinsichtlich der Arzneimittelempfindlichkeit heterogen sind, aus dem Material eines Patienten mit Tuberkulose isoliert werden. Die Empfindlichkeit von Stämmen gegenüber Tuberkulosemedikamenten kann sich im Bereich der Arzneimittel, des Grades, der Häufigkeit und der Häufigkeit des Auftretens von Resistenz unterscheiden.

Der Grad der Arzneimittelresistenz von Mycobacterium tuberculosis wird nach festgelegten Kriterien bestimmt, die auf die klinische Signifikanz der Resistenz ausgerichtet sind und von der antituberkulösen Aktivität des Arzneimittels, seiner Pharmakokinetik und Konzentration im Läsionsherd abhängen. Die maximale therapeutische Dosis und so weiter.

Die Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobakterien wird derzeit durch mikrobiologische Methoden durchgeführt:

• Absolute Konzentrationen (Verdünnungsmethode auf dichten oder flüssigen Nährmedien),
• Proportionen,
• Widerstandskoeffizient.

Gewöhnlich manifestiert sich die Resistenz in Form eines visuell beobachteten Wachstums der Kolonien von Mycobacterium tuberculosis, aber es gibt Verfahren, die in den frühen Stadien der Zellteilung von Mycobakterien ein Wachstum in Form von Farbreaktionen induzieren. Diese Methoden verkürzen die Testzeit von 3-4 auf 2 Wochen.

Wie in Russland vereinigt wurde von der WHO Ausschuss Chemotherapie Methode der absoluten Konzentrationen verlängert, empfohlen, die von einer methodischen Sicht ist, ist die einfachste, aber es erfordert eine hohe Präzision und Standardisierung von Laborverfahren. Der Medikamentenempfindlichkeitstest besteht aus einer Reihe von Reagenzgläsern mit einem Nährmedium, das mit Anti-TB-Medikamenten modifiziert wurde. Das Set besteht aus 2-3 Rohren mit verschiedenen Konzentrationen von jedem der verwendeten Arzneimittel, ein Kontrollröhrchen ohne Arzneimittel für die Umwelt und ein Rohr, enthaltend 1000 mcg / ml Natrium Sali tsilovokislogo oder 500 ug / ml paranitrobenzoynoy Säure nontubercular Wachstum von Mykobakterien zu detektieren.

Um einen Satz von Medien mit Präparaten herzustellen, wird ein modifiziertes Levenstein-Jensen-Medium (ohne Stärke) verwendet, das in Kolben gegossen wird. In jedem der Kolben wird ein spezifisches Volumen einer geeigneten Verdünnung der antituberkulösen Zubereitung hinzugefügt. Der Inhalt der Kolben wird gründlich gemischt, in Röhrchen gegossen und in einer geneigten Position für 40 Minuten bei einer Temperatur von 85 ° C gefaltet. Es wird empfohlen, das Medium in einem elektrischen Aufwickler mit automatischer Temperaturregelung zu wickeln. Mittwoch mit Anti-TB-Medikamenten

1. Serie kann im Kühlschrank bei 2-4 ° C für 1 Monat gelagert werden, mit Vorbereitungen der zweiten Reihe - nicht mehr als 2 Wochen. Die Lagerung von Medien mit Präparaten bei Raumtemperatur ist nicht akzeptabel. Bei der Herstellung von Lösungen von Anti-Tuberkulose-Arzneimitteln wird deren Aktivität berücksichtigt, indem die Konzentration berechnet wird, die auf das Molekulargewicht des unspezifischen Teils der Zubereitung, die Reinheit usw. Eingestellt ist. Zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit werden nur chemisch reine Substanzen verwendet.

Das Prinzip der Methode besteht darin, die Konzentration eines antituberkulösen Medikaments zu bestimmen, das das Wachstum eines signifikanten Teils der mykobakteriellen Population inhibiert. Wenn es richtig gemacht wird, hat diese Methode eine gute Zuverlässigkeit.

Vor dem Test muss sichergestellt werden, dass die isolierte Kultur von Mycobacterium tuberculosis keine fremde Mikroflora aufweist. Aus der Kultur von Mycobakterien in 0,9% Natriumchloridlösung wird eine homogene Suspension hergestellt, die 500 Millionen mikrobielle Körper pro ml enthält (optischer Trübungsstandard von 5 Einheiten). Die resultierende Aufschlämmung wird mit 0,9% iger Natriumchloridlösung (1: 10) verdünnt und 0,2 ml Aufschlämmung werden zu jedem Röhrchen des Kulturmediensatzes zugegeben. Die geimpften Röhrchen werden in einen Thermostaten bei 37ºC gestellt und 2-3 Tage in horizontaler Position gehalten, so daß die geneigte Oberfläche des Kulturmediums gleichmäßig mit der Suspension von Mycobacterium tuberculosis inokuliert wird. Die Röhrchen werden dann in eine vertikale Position überführt und für 3-4 Wochen inkubiert. Die Ergebnisse werden nach 3-4 Wochen aufgezeichnet.

Da der Zeitpunkt der Ausscheidungsausscheidung aus dem klinischen Material auf Nährmedien mindestens 1-1,5 Monate beträgt, können die Ergebnisse der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit nach dieser Methode frühestens 2-2,5 Monate nach der Aussaat des Materials erhalten werden. Dies ist einer der Hauptnachteile der Methode.

Interpretieren Sie die Ergebnisse der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien auf der Grundlage bestimmter Kriterien. Auf dichten Medien wird die Kultur als empfindlich gegenüber der Konzentration des Arzneimittels angesehen, das in dem Medium enthalten ist, wenn die Anzahl von Kolonien von Mykobakterien, die auf diesem Röhrchen mit dem Arzneimittel gewachsen sind, 20 nicht übersteigt, wobei in einem Kontrollröhrchen ohne Arzneimittel reichlich wächst. Nur in Gegenwart von mehr als 20 Kolonien gilt die Kultur als resistent gegen diese Konzentration. In der Praxis, wenn Wachstumsergebnisse in Reagenzgläsern nahe 20 KBE erhalten. Es ist notwendig, der klinischen Abteilung mitzuteilen, dass die Empfindlichkeit oder der Widerstand in diesem Fall grenzwertig ist, da sie manchmal die unscharfe Dynamik der klinischen Indikatoren erklären kann.

Für verschiedene Medikamente wird eine bestimmte Konzentration festgestellt, bei der die Reproduktion des kritischen Anteils der mykobakteriellen Population beobachtet wird. Diese Konzentrationen werden als "kritisch" bezeichnet. Als Stabilitätskriterium wird das Wachstum der Mykobakterienpopulation auf einem Nährmedium mit einer Zubereitung in einer kritischen Konzentration verwendet.

In der häuslichen TB-Praxis sind sie bei der Bestimmung der Arzneimittelresistenz nicht darauf beschränkt, nur kritische Konzentrationen zu bestimmen. Dies ist aufgrund der Tatsache. Mit Wissen, um die Wirkung von Medikamenten-Kombinationen von Potenzierung, kreuz und quer durch erwarteten Widerstand, dass das erweiterte Definition Niveau der Arzneimittelresistenz ermöglicht es der Arzt, genauer, um die Taktik Chemotherapie zu positionieren oder eine wirksamere Medikament Gruppe Anti-TB-Medikamente zur Anwendung.

Die absolute Konzentrationsmethode ist die einfachste, aber sie ist auch am empfindlichsten für die Fehler, die bei ihrer Ausführung auftreten. Zuverlässiger, vor allem bei der Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Second-Line-Drogen, und außerhalb von Russland üblich ist die Methode der Proportionen. Es berücksichtigt die Mängel der Methode der absoluten Konzentrationen, aber in der Ausführung ist es mühsamer.

Die Methode ist der absoluten Konzentrationsmethode sehr ähnlich. Die Vorbereitung der Reagenzgläser mit Medikamenten erfolgt auf die gleiche Weise. Wie in der absoluten Konzentrationsmethode. Die Keimdosis der Suspension von Mycobacterium tuberculosis ist jedoch um den Faktor 10 reduziert. Was die Häufigkeit der spontanen Resistenz bestimmter Stämme von Mycobacterium tuberculosis gegenüber solchen Arzneimitteln wie Etambutol, Protionamid, Capreomycin beseitigt. Als Kontrolle werden 2 oder 3 Röhrchen mit einer Saatdosis verwendet, die in den Reagenzgläsern gleich ist und nacheinander 10 und 100 mal verdünnt wird. Das Kriterium der Stabilität ist der Anteil des visuell beobachteten Wachstums von Mycobacterium tuberculosis. Für Drogen der ersten Reihe ist das Stabilitätskriterium das Übermaß an Wachstum von 1% der Ausgangspopulation für die Arzneimittel der zweiten Reihe - ein Anstieg von 1 oder mehr als 10% des Ausgangs, abhängig von der gewählten kritischen Konzentration.

Im Jahr 1997 hat eine Arbeitsgruppe der WHO und die Internationalen Union für die Identifizierung von guter Tuberkulose TB Arzneimittelresistenz Anpassungen dieser Kriterien, als resistent Mykobakterien bieten, die in den folgenden Konzentrationen an festem Ei Medien Lowenstein-Jensen wachsen:

• Dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• Isoniazid 0,2 μg / ml:
• Rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

Im Jahr 2001 wurden für die folgenden Zweitlinientypen kritische Konzentrationen vorgeschlagen (für einen kritischen Anteil von 1%):

• Capreomycin - 40 μg / ml;
• Protionamid - 40 μg / ml;
• Kanamycin - 30 μg / ml;
• Viomycin - 30 μg / ml;
• Cycloserin 40 ug / ml;
• Aminosalicylsäure - 0,5 μg / ml;
• Ofloxacin - 2 & mgr; g / ml.

Die Wachstumsergebnisse werden nach 4 Wochen als Voruntersuchung und nach 6 Wochen Kultivierung bewertet - als letzte.

Zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Pyrazinamid, das in der modernen Tuberkulose-Chemotherapie weit verbreitet ist, wird eine kritische Konzentration von 200 μg / ml empfohlen. Bisher gibt es jedoch keine allgemein akzeptierte Methode zur Bestimmung der Arzneimittelresistenz gegen dieses Arzneimittel auf festen Nährmedien, da seine antibakterielle Aktivität nur in saurem Medium (pH <6) manifestiert wird, das technisch schwierig aufrechtzuerhalten ist. Darüber hinaus wachsen viele klinische Kulturen von Mykobakterien Tuberkulose widerwillig auf Ei-Umgebungen mit einer sauren Umgebung.

Um die Qualität der Ergebnisse der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mykobakterien zu beurteilen, wird empfohlen, jede neue Charge des Levenstein-Jensen-Mediums durch eine parallele Bestimmung der Empfindlichkeit des Standard-Museumsstamms H37Rv zu überwachen. Darüber hinaus gibt es bestimmte mikrobiologische Kriterien, die eingehalten werden müssen, damit die Techniken ein gut reproduzierbares und korrekt interpretiertes Ergebnis liefern. Diese umfassen die Lebensfähigkeit der Kultur von Mycobacterium tuberculosis, die Regeln zum Erhalt einer homogenen Suspension und Suspension, die Regeln für die Selektion von Kulturen von Mycobacterium tuberculosis, die Repräsentativität der ausgewählten Bakterienmasse. Die Zuverlässigkeit der Bestimmung der Arzneimittelresistenz nimmt mit einer extrem knappen bakteriellen Freisetzung ab.

Kürzlich wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit unter Verwendung automatisierter Systeme als vielversprechend angesehen. Die perfektesten in diesem Bereich sind Entwicklungen basierend auf VASTES MGIT-960. In diesem Fall wird die Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobacterium tuberculosis auf der Basis einer modifizierten Proportionsmethode bestimmt. Bei der Bestimmung wird die Wachstumsrate von Mycobacterium tuberculosis in einem Kontrollröhrchen und in Teströhrchen mit Arzneimitteln verglichen. Um die Empfindlichkeit gegenüber Streptomycin, Isoniazid, Rifamp-Picin und Ethambutol zu bestimmen, werden Anreicherungs-Ergänzungen und Antibiotika, die in dem SIRE-Kit enthalten sind, verwendet. Um die Empfindlichkeit gegenüber Pyrazinamid zu bestimmen, verwenden Sie den PZA-Kit. Im Verlauf des Suspensionstest Mycobacterium tuberculosis inokuliert Reagenzglas mit Arzneimitteln, sowie die Kontrollröhrchen mit rekonstituierten Suspension 100mal für alle Arzneimittel mit Ausnahme Pyrazinamid, wobei die Suspension von 10-fache Verdünnung. Das Kriterium der Stabilität ist der Wachstumsindikator von Mycobakterien von 100 GU, wenn das Wachstum im Kontrollrohr 400 GU erreicht wird (siehe "Kulturverfahren zur Isolierung von Mycobakterien"). Die Auswertung und Interpretation der Ergebnisse erfolgt automatisch und erfolgt über die Eingabe oder das ausgewählte Programm.

Als kritische Konzentrationen werden Endkonzentrationen in einem Reagenzglas mit einem flüssigen Nährmedium verwendet. Gegenwärtig wurden kritische Konzentrationen sowohl für Arzneimittel der ersten als auch der zweiten Linie entwickelt. Es sollte angemerkt werden, dass die Empfindlichkeit von Mycobakterien Tuberkulose gegenüber Cycloserin und Aminosalicylsäure nur auf Eimediummedien bestimmt wird.

Ein detailliertes Protokoll der Arbeit an dem beschriebenen System ermöglicht es, die Arzneimittelanfälligkeit sowohl in einer isolierten Kultur (mit einem dichten Nährmedium) als auch unter Verwendung des primären Wachstums von Mycobacterium in einer MGIT-Röhre zu untersuchen. Die letztere Option reduziert die Zeit für die Kultur, so dass Sie die vollständigen Ergebnisse der Kultur von Mycobacterium tuberculosis (einschließlich Informationen über Arzneimittelempfindlichkeit) nach 3 Wochen ab dem Zeitpunkt der Sammlung des Materials zu erhalten, während die traditionelle Methode ist es möglich, nur den dritte Monat zu erhalten. Mit der Zeit können die erzielten Ergebnisse, wenn sich der Patient in einer intensiven Behandlungsphase befindet, die relativ hohen Forschungskosten kompensieren.

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Differenzierung von Mykobakterien

Unter Berücksichtigung, dass die verwendeten Nährmedien nicht streng selektiv sind. Die nachfolgende Differenzierung der isolierten Mykobakterien wird als obligatorisch anerkannt. Die Notwendigkeit zur Differenzierung von Mykobakterien ist aufgrund einer Reihe von Merkmalen der pathologischen die von der Gattung Prozesse: unterschiedliche Verlauf und das Ergebnis der Tuberkulose und mycobacteriosis, das Vorhandensein von natürlichen Arzneimittelresistenz zu einigen Anti-TB-Medikamente.

Es wird anerkannt, dass die primäre Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis-Komplex M. Nontubercular aus Mycobakterien durch die folgenden Merkmale durchgeführt wird: die Wachstumsrate auf festen Nährböden, die Pigmentierung, Koloniemorphologie, die Anwesenheit von Säurebeständigkeit und Temperatur optimalen Wachstum.

Leider gibt es keine einzelne Labormethode ist, zuverlässig zu unterscheiden M. Komplex Mykobakterien aus anderen säurefesten Bacilli Tuberkulose, doch die Kombination der Merkmale mit den Ergebnissen unter einer Reihe von biochemischen Tests gegeben ermöglicht die Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis-Komplex mit M. Wahrscheinlich oben beschrieben, zu 95%.

Zur Unterscheidung von Mycobacterium tuberculosis-Komplex M. (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii und andere) von den langsam wachsenden Mycobakterien nontubercular grundlegende biochemische Tests verwendet, die das Vorhandensein der folgenden Symptome erkennen:

• die Fähigkeit zur Herstellung von Nicotinsäure (Niacin-Test):
• Nitratreduktase-Aktivität;
• thermostabile Katalase;
• Wachstum auf Medium mit Natriumsalicylat (1 mg / ml).

Als zusätzliche Tests kann auch ein Wachstum auf einem Medium, das 500 μg / ml Paranitrobenzoesäure oder 5% Natriumchlorid enthält, verwendet werden.

Viele bakteriologische Laboratorien identifizieren diese Mikroorganismen nur auf der Ebene des Komplexes, was auf die begrenzten Möglichkeiten der Laboratorien und die methodischen Fähigkeiten der Spezialisten zurückzuführen ist.

In den meisten Fällen sind jedoch in der Praxis zum Differenzieren von M. Tuberculosis und M. Bovis ist ausreichend, um die folgenden Tests: Niacin, auf die Anwesenheit von Nitrat, das Vorhandensein Registrierungs- und pirazinamidazy Wachstum in Medium, das 2 ug / ml Hydrazid von Thiophen-2-carbonsäure. Es wird berücksichtigt, dass die Mykobakterien des M. Tuberculosis-Komplexes durch folgende Merkmale gekennzeichnet sind:

• langsames Wachstum (mehr als 3 Wochen);
• Wachstumstemperatur im Bereich von 35-37 ^o C;
• Fehlen von Pigmentierung (Elfenbein);
• markierte säurefeste Farbe;
• ein positiver Niacin-Test;
• ein positiver Nitratreduktase-Test;
• Abwesenheit von thermostabiler Katalase (68 ^° C).
• Die Abwesenheit von Wachstum auf einem Levenstein-Jensen-Medium, enthaltend:
  • 1000 μg / ml Natriumsalicylat,
  • 500 μg / ml Paranitrobenzoesäure,
  • 5% Natriumchlorid:
• Wachstum in Gegenwart von 1-5 ug / ml Thiophen-2-carbonsäure.

Die Relevanz der Differenzierung von isolierten Mykobakterien wird mit der Zunahme der Häufigkeit der Aufzeichnung von HIV / AIDS-Fällen, die mit Tuberkulose oder Mycobacteriose assoziiert sind, deutlich zunehmen. Gegenwärtig gibt es keine absolute Gewissheit über die Bereitschaft praktischer regionaler Laboratorien, dieses Arbeitsvolumen korrekt durchzuführen.

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Immunologische Diagnose von Tuberkulose

Es gibt eine Reihe von universellen Phänomenen, Drogen und immunologischen Tests, die ursprünglich genau bei Tuberkulose oder am Modell der Immunantwort gegen Mykobakterien gefunden wurden. Dazu gehören BCG und Tuberkulin, ein Phänomen wie das kutane GZT (Tuberkulintests - Reaktionen von Pirke und Mantoux), eine Reaktion auf die subkutane Injektion von Tuberkulin in ein sensibilisiertes Tier (Koch-Phänomen). Einer der ersten Antikörper bei Infektionskrankheiten wurde auch bei Tuberkulose nachgewiesen. Natürlich, je tiefer das Verständnis der Mechanismen der antituberkulösen Immunität und ihrer genetischen Kontrolle ist, desto breiter kann die Verwendung immunologischer Methoden und Arzneimittel sein, die die Immunität beeinflussen, um die praktischen Probleme der Phthisiologie zu lösen.

Das wichtigste und schwierigste Problem in der Praxis ist derzeit der Nachweis von Tuberkulose beim Massenscreening der Bevölkerung. Trotz der zahlreichen Berichte über "Erfolge" (auf begrenztem Material) gibt es keine geeignete immunologische Methode (reproduzierbar in "irgendwelchen Armen") und ein für diesen Zweck geeignetes Medikament.

Immunologische Methoden, insbesondere serologische Studien (Bestimmung von Antigenen, Antikörpern) und Tuberkulin-Provokationstests sind in der klinischen Praxis weit verbreitet.

Unter den differentialdiagnostischen immunologischen Studien gibt es zunächst serologische Methoden - die Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in verschiedenen Körperumgebungen.

Die Spezifität von Antikörpern gegen Mycobacteria tuberculosis hängt von den im Immunoassay verwendeten Antigenen ab. Es wird eine signifikante Menge an Antigenen vorgeschlagen, von denen das allererste Tuberkulin PPD ist:

• PAP und andere komplexe Präparate aus der Kulturflüssigkeit;
• Ultraschall-Desintegration;
• Triton-Extrakt und andere komplexe Präparate von Zellwänden;
• 5-Antigen (Daniel);
• 60-Antigen (Coccito);
• Lipoarabinomannan;
• Kordfaktor (Trehalose-6,6-di-mycolat);
• Phenol- und andere Glycolipide;
• Lipopolysaccharide;
• Fibronectin-bindendes Antigen;
• Proteine (meistens rekombinant); 81.65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA usw.

Als Ergebnis jahrelanger Forschung durch russische und ausländische Wissenschaftler wurden die Hauptmuster der Antikörperbildung und die Wirksamkeit der serologischen Tuberkulosediagnose aufgezeigt: Je komplexer das Antigen, desto höher die Sensitivität und die geringere Spezifität der Tests. Die Spezifität variiert von Land zu Land in Abhängigkeit von der Infektion der Bevölkerung mit M. Tuberculosis und Nicht-Tuberkulose-Mykobakterien, von der Impfung mit BCG usw. Bei Kindern ist der Aussagewert der Serodiagnostik geringer als bei Erwachsenen. Bei der primären Tuberkulose (häufiger Kinder) ist die Definition von IgM informativer. Mit sekundärem IgG. Bei HIV-infizierten Patienten ist die Aussagekraft der Serodiagnostik bei der Bestimmung von Antikörpern reduziert. Efficiency Bestimmung von Antikörpern sind abhängig von der Anzahl der „clinical aspects“: Prozess-Aktivität (das Vorhandensein oder der Abwesenheit von „Trennung“ Mycobakterien Anwesenheit Zerfall von Hohlräumen, der Grad der Infiltration), die Prävalenz des Prozesses, die Dauer der Strömung.

Die Empfindlichkeit der Methode des Enzymimmunoassays (ELISA) beträgt ungefähr 70%. Die unzureichende Wirksamkeit der Studie ist auf ihre geringe Spezifität zurückzuführen. Zuvor wurde die Möglichkeit einer serologischen Untersuchung in Hochrisikogruppen, insbesondere bei Personen mit Tuberkuloseveränderungen in der Lunge, in Betracht gezogen.

Um die Spezifität des ELISA zu erhöhen, werden die Suche nach spezifischeren Antigenen, einschließlich derjenigen, die durch Gentechnik erhalten wurden, fortgesetzt: ESAT-6, etc. (siehe oben). Die Verwendung von streng spezifischen Antigenen (38 kDa, ESAT) erhöht die Spezifität. Reduziert jedoch deutlich die Empfindlichkeit der Analyse. Zusammen mit IFA (Experimentallabor Testsystemen. Z. B. Pathozyme ELISA-Kit) stellt auch Kits mit seitlicher immunochromatographic Filtration (Mycodot), sowie anderen ähnlichen Tests (dot-Analyse auf der Membranen) mit einer visuellen Beurteilung des Testergebnisses. Während dieser Tests wird die Analyse für 10-30 Minuten durchgeführt; Sie benötigen keine spezielle Ausrüstung, sie erfordern eine visuelle Bewertung der Ergebnisse, die mit einer gewissen Subjektivität verbunden ist. Diese Methoden haben ungefähr die gleichen Sensitivitäts- und Spezifitätseigenschaften (70% bzw. 90-93%) wie der herkömmliche ELISA.

Die Verwendung von Methoden der Immunanalyse hat einen bestimmten Wert als eine zusätzliche, in den Komplex der verwendeten Methoden berücksichtigt, in der Differentialdiagnose der Tuberkulose, vor allem in der Diagnose ihrer extrapulmonalen Formen. Die wirksamste ELISA-Methode ist die Diagnose von Tuberkulose-Meningitis bei der Untersuchung von Zerebrospinalflüssigkeit. In diesem Fall beträgt die Empfindlichkeit der Analyse 80-85% und die Spezifität beträgt 97-98%. Es gibt Daten über die Wirksamkeit des Nachweises von Antikörpern gegen Mycobakterien Tuberkulose in Tränenflüssigkeit in der Diagnose der tuberkulösen Uveitis.

Induktion der Gamma-Interferon-Synthese in vitro

Gamma-Interferon (IFN-γ) ist ein spezifischer Immunabwehrfaktor, der durch die Aktivierung von Makrophagen-Enzymsystemen realisiert wird. Die Induktion der IFN-γ-Synthese durch sensibilisierte T-Lymphozyten verursacht ihre Wechselwirkung mit Antigenen von Mykobakterien.

Als Antigene verwendet als Tuberkulin PPD. Und die spezifischen Antigene, die durch gentechnologische erhalten, insbesondere Antigene, ESAT-6 (early sekretierten Antigene mit einem Molekulargewicht 6 kDa) und CFP-10 (Kulturfiltrat Protein 10 kDa). Gentechnische oder rekombinante Antigene sind in den Zellen des BCG-Impfstoffes und anderer Mycobakterien nicht vorhanden. Bei Verwendung von Tuberkulin sind die Ergebnisse des Induktionstests IFN-γ vergleichbar mit den Ergebnissen des Tuberkulin-Hauttests (direkte Korrelation). Bei Verwendung gentechnisch veränderter Antigene sind die Testergebnisse spezifischer und hängen nicht von früheren BCG-Impfungen ab. Bei der Untersuchung von geimpften Personen, die keinen Kontakt mit einer Tuberkulose-Infektion hatten, beträgt die Spezifität des Tests 99%. Die Empfindlichkeit des Tests bei Patienten mit Tuberkulose variiert von 81 bis 89%.

Tests und Diagnosewerkzeug wurden auf der Basis der kurzzeitigen Kultivierung von Zellen oder Vollblut mononukleären Zellen isoliert aus dem Blut mit Antigenen von Mycobacterium tuberculosis in vitro mit anschließender Bestimmung von IFN-γ-Konzentration oder durch Zählen die Anzahl der T-Lymphozyten entwickelt, die IFN-γ synthetisieren. Die Konzentration von in einem Teströhrchen synthetisiertem Interferon wird durch ELISA unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die IFN-γ binden, bestimmt. Dann wird durch Kalibrieren des Standard-IFN-γ seine Konzentration in dem Teströhrchen oder den Titriernäpfen der Platte bestimmt.

Bei der Durchführung des Elispot-Tests wurde die Anzahl der T-Limocyten synthetisiert, die IFN- & gamma; werden auf der Oberfläche einer mit Antikörpern gegen IFN-γ beschichteten Platte gezählt.

Entwickler von diagnosticum auf der Grundlage der Induktion von IFN-γ in vitro, die von der US-Agentur für Arzneimittel und Produkte zugelassen ist, argumentieren, dass es unmöglich ist, latente Tuberkulose-Infektion von aktiver Tuberkulose mit Hilfe des Tests zu unterscheiden. Daher ist der Test in Regionen mit einem hohen Infektionsgrad nicht direkt diagnostisch. In unserem Land kann es jedoch dazu verwendet werden, Tuberkulose-Infektionen bei Kindern von einer Allergie nach der Impfung zu unterscheiden und das Niveau der spezifischen Immunität im Behandlungsprozess zu bestimmen.

Gegenwärtig wird das häusliche Testsystem zur Bestimmung der Induktion von IFN-γ-Synthese durch spezifische Tuberkulose-Antigene in vitro untersucht.

Immunität und Verlauf der Tuberkulose, Immunokorrektur

Bei der Behandlung von Tuberkulose beim Menschen gibt es Veränderungen in der Antigenität und im Zustand des Immunsystems.

Daten über Veränderungen in Exsudaten und Geweben sind weitgehend widersprüchlich. Aus gutem Grund ist nur zu bemerken, dass bei tuberkulösen Granulomen in der Regel eine signifikante Anzahl von aktivierten T-Lymphozyten nachgewiesen wird.

Es ist sinnvoll, auf zwei weitere Bestimmungen einzugehen, die notwendig sind, um die Rolle immunologischer Mechanismen bei der Behandlung von Tuberkulose beim Menschen zu verstehen:

• AIDS-Patienten haben eine besonders hohe Inzidenz von multipler Medikamentenresistenz;
• Bei multipler Arzneimittelresistenz (und bei fehlender HIV-Infektion) sind Immunitätsstörungen (insbesondere die T-Zell-Bindung) besonders signifikant.

Wenn Tuberkulose weit verschiedene Methoden der Immunmodulation anwenden: Es ist in erster Linie Medikamente in erster Linie auf die T-Zell-Immunität und ein System von einkernigen Phagozyten wirken (Thymushormonen, Isophoron, likopid, polioksidony et al.). Sowie ganze (attenuierte) Mykobakterien und ihre Komponenten.

Molekularbiologische Diagnose von Tuberkulose

Für molekularbiologische Verfahren in der Diagnostik von Infektionskrankheiten umfassen, vor allem, Verfahren, die auf mit dem genomischen Material von bakteriellen und viralen Pathogenen Manipulieren spezifisches genetisches Material zu identifizieren - DNA-Segmente mit einer Nukleotidsequenz, die spezifisch für einen bestimmten Typen oder Erregerstämme zu analysieren spezifischen DNA-Sequenzen in Genen, die die Empfindlichkeit des Erregers für bestimmte medizinische Substanzen sowie für die funktionelle Analyse bestimmen Aktivität bestimmter Gene des Erregers. Molekularbiologische Techniken waren weit verbreitet in der wissenschaftlichen Forschung und der praktischen Anwendung in der Diagnose und Überwachung von verschiedenen bakteriellen und viralen Infektionen nach 1985, Carrie Myullisom (Gewinner des Nobelpreis. 1989) Eröffnung Polymerase-Kettenreaktion.

Prinzipien und Möglichkeiten der Polymerase-Kettenreaktions-Methode

Die PCR ermöglicht es, eine Nukleotidsequenz (DNA-Fragment des Pathogens) mehrere Millionen Mal in vitro zu amplifizieren (multiplizieren). Die Reaktion in Gegenwart von einzelnen DNA-Ketten bestimmt die extrem hohe Empfindlichkeit des Assays.

Die Nukleotidsequenz bestimmter Regionen in der DNA-Kette bestimmt die genetische Identität des Mikroorganismus, was die hohe Spezifität der PCR erklärt.

Der Wert dieser Technik zum Nachweis und zur Untersuchung der durch Mycobacterium tuberculosis biologische Eigenschaften eines Mikroorganismus verursachten Eigenschaften sehr langsames Wachstum aufweisen: Zeit von Mycobacterium tuberculosis-DNA verdoppeln, wenn Züchtung wird 12-24 Stunden.

Das Prinzip der PCR-Methode besteht in der Amplifikation - mehrfach, millionenfach. Multiplizieren der Abschnitte einer spezifischen DNA-Sequenz in einem Röhrenmikrovolumen während eines zyklischen Wiederauftretens der folgenden drei Reaktionsstufen, von denen jede in einem unterschiedlichen Temperaturregime verläuft:

• Stufe I - Denaturierung von doppelsträngiger DNA beim Erhitzen mit einer Divergenz ihrer Ketten;
• II-Stufe - komplementäre Bindung (Hybridisierung) von Primern (Priming-Oligonukleotide) mit terminalen Abschnitten von Ketten von streng spezifischen, zur Vervielfachung des DNA-Fragments gewählten Ketten;
• Stufe III - Vervollständigung der Kette des DNA-Fragments unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase.

Für die Amplifikation in vitro müssen Moleküle der Matrix-DNA vorhanden sein. Vier Arten von Desoxynukleosidtriphosphaten (Nukleotiden), die die entsprechenden Stickstoffbasen enthalten: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (D), Cytosin (C); künstlich synthetisierte Priming-Oligonukleotide (Primer) bestehend aus 18-20 Basenpaaren; DNA - Polymerase thermostabile Enzym ein Temperaturoptimum von 68-72 aufweist , ^{auf der} C und Magnesiumionen.

Die Spezifität der PCR hängt von der Wahl des DNA-Fragments ab. In Übereinstimmung damit werden Flankenkern-Oligonukleotide synthetisiert. Die Spezifität der Hybridisierung und Vervollständigung der DNA-Kette beruht auf dem Prinzip der Komplementarität der folgenden Paare von Stickstoffbasen: Adenin-Thymin, Guanin-Cytosin.

Um die genomische tuberkulöse Mycobakterien Komplex effizienteste Zielamplifikation in den meisten Testsystemen ausgewählt DNA-Fragment von IS6110 zu bestimmen, die in den meisten Stämmen von Mycobacterium tuberculosis-Genom eine signifikante Anzahl hat (10-20) von Wiederholungen, der bestimmt, zusammen mit einer Spezifität, die hohe Empfindlichkeit des Assays. Gleichzeitig werden Stämme von Mycobacterium tuberculosis mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen oder die Abwesenheit von IS6110-Fragment beschrieben.

Isolierung von DNA-Molekülen aus einer biologischen Probe

Zur Durchführung der PCR sollten die DNA-Moleküle des Pathogens aus dem biologischen Material in einem minimalen Volumen mit einer minimalen Menge an unspezifischer DNA und verschiedenen Inhibitoren der Enzym-DNA-Polymerase isoliert werden.

Die Probenvorbereitung sollte unter Bedingungen erfolgen, die eine Kreuzkontamination der Proben durch die isolierten DNA-Moleküle verhindern. Zu diesem Zweck ist eine Vorbehandlung des Raumes mit ultravioletten, Boden- und Arbeitsflächen von Tischen und Geräten mit chlorhaltigen Lösungen erforderlich. Es ist auch notwendig, saubere Handschuhe, Einweg-Reagenzgläser und Spitzen zu automatischen Pipetten zu verwenden.

Um die DNA von Mycobacterium tuberculosis in klinischen Proben (Zerebrospinalflüssigkeit, bronchiale wash) zu isolieren keine große Anzahl von Zellen, Zelltrümmer enthält, oder Salzen davon, die ausreicht , um die Probe zu Zentrifuge bei 3-4000. Rpm, fügen den Schlamm 20-30 ul von 2% Lösung TRITON X-100 und erwärmt auf 90 ^etwa 30 min C.

Zur Herstellung von Sputumproben muß effiziente Verflüssigung sein, die in der Regel für eine 4% ige Lösung von Natriumhydroxid und N-Acetyl-L-Cystein (NALC) in einer Menge von 50-80 mg pro Probe verwendet wird - je nach Probenviskosität. Die NALC-Lösung muss von Zeit zu Zeit vorbereitet werden oder NALC-Pulver kann direkt zur Probe hinzugegeben werden. Nach der Verflüssigung sollten die Proben für 15 Minuten bei 3,5 bis 4000 U / min (3000 g) in 50 ml-Fläschchen mit Schraubverschlüssen zentrifugiert werden, d.h. Unter den gleichen Bedingungen, die für die vorbereitete Schleimvorbereitung empfohlen werden.

Für die Extraktion von DNA aus dem Pellet meisten verwendeten Verfahren wird oft auf der Grundlage der Verwendung einer 5-6-molaren Lösung von Guanidinisothiocyanat Lysereagenz als die mikroporösen Partikel und Siliciumoxid ( „Diatomeenerde“) Sorbieren DNA-Molekül. Die nicht-spezifische Substanzen, einschließlich Inhibitoren möglich ist, dann in einer 2,5 molaren Lösung gewaschen von Guanidiniumisothiocyanat und Ethanollösung, wonach das DNA-Molekül wird in Wasser desorbiert, und diese Proben wurden verwendet, um PCR durchzuführen. Um die Technologie der DNA-Extraktion zu vereinfachen, wird "Diatomeenerde" häufig durch magnetische Mikropartikel ersetzt, die mit Siliziumoxid beschichtet sind. In diesem Fall wird ein spezieller magnetischer Ständer für Mikroröhrchen anstelle von Zentrifugation verwendet, um die Teilchen auszufällen.

In Russland wurde eine originäre Methode zur immunmagnetischen Trennung von Mycobakterien entwickelt, gefolgt von der Extraktion der DNA des Pathogens. Zur immunmagnetischen Separation von Mycobacterium tuberculosis werden mit Siliziumoxid umhüllte Ferropartikel mit einer Größe von 3-5 μm verwendet, an die chemisch verknüpfte polyklonale (Kaninchen) Antikörper gegen Tuberkulose-Mykobakterien angeschlossen sind. Sputumproben nach alkalischer Lyse werden mit einer sauren Tris-HCl-Lösung neutralisiert und mit einem immunomagnetischen Sorbens inkubiert. Dann werden die Immunoferropartikel mit einem magnetischen Stab mit einer austauschbaren Spitze gesammelt, auf ein Mikroröhrchen übertragen und ausgefällt. Füge 20-30 & mgr; l einer 2% igen Triton X-100-Lösung hinzu und erwärme 30 Minuten bei 90 ^° C. Der Überstand wird als DNA-Matrize für die PCR-Analyse verwendet.

Ein schwieriges Problem ist die Isolierung von Mycobacterium tuberculosis-DNA aus Biopsieproben. Für die Enzymbiopsie wird das Enzym Proteinase K bei einer Endkonzentration von 200-500 mg / l bei einer Temperatur von 56 ^° C über Nacht verwendet. Ferner wird eines der bekannten Verfahren verwendet. Überschüssige unspezifische DNA in der PCR-Analyse von Biopsien verursacht oft die Hemmung der Reaktion, die eine wiederholte Extraktion von DNA erfordert.

Methoden zur Erkennung von Ergebnissen

Nach Beendigung der Reaktion werden die amplifizierten DNA-Fragmente des Pathogens durch verschiedene Methoden identifiziert.

Das Gelelektrophoreseverfahren ist gut bekannt. Das resultierende DNA-Fragment wird durch eine positive Kontrolle identifiziert, die das gewünschte spezifische DNA-Fragment enthält, oder nach einer bekannten Größe (Anzahl der Nukleotidpaare) des Fragments, die unter Verwendung eines molekularen Standardmarkers bestimmt wird.

In Gegenwart eines spezifischen Farbstoffs ist Ethidiumbromid in doppelsträngiger DNA enthalten. Das synthetisierte DNA-Fragment wird als eine Bande nachgewiesen, die unter der Einwirkung des Ultravioletten leuchtet.

Die Größe des DNA-Fragments, bestimmt durch Elektrophorese aus der Entfernung vom Start, muss einem bekannten Molekulargewichtsmarker oder einer positiven Kontrolle entsprechen.

Andere Verfahren zur Bestimmung von PCR-Ergebnisse basiert auf der Hybridisierung eines einkettigen PCR-Produkte mit einem dazu komplementären Oligonukleotid - DNA-Sonde mit Biotin markiert, durch den Nachweis über enzymatische Reaktionen gefolgt, beispielsweise durch an Streptavidin-Biotin-Alkalische Phosphatase zu binden.

Basierend auf dieser Art des Nachweises wurden PCR-Analysatoren geschaffen, bei denen der Nachweis von PCR-Ergebnissen als Ergebnis des Ablesens der optischen Dichte in den Proben nach dem Auftreten der enzymatischen Reaktion automatisch durchgeführt wird.

Die Nachteile dieser Methoden sind die Möglichkeiten der Kontamination durch kurze DNA-Fragmente. Wenn Moleküle in neue Proben eindringen, werden sie zu einer Matrix für die PCR und führen zu falsch positiven Ergebnissen.

Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, werden strenge Regeln für die Trennung und Isolierung von Räumlichkeiten eingeführt: um DNA aus biologischen Proben zu extrahieren; Räumlichkeiten für den Nachweis von Ergebnissen (Elektrophorese) aus der Reinzone. Diese Räumlichkeiten sind eine Zone mit wahrscheinlicher Kontamination. Ein weiterer isolierter Bereich ist ein Reinraum zum Einbringen der zu testenden DNA-Proben in Röhrchen mit einer Reaktionsmischung für die PCR. Schließlich wird angenommen, dass das Hauptgerät - der DNA-Verstärker - in einem separaten, möglicherweise Büro-Raum untergebracht werden sollte.

Um eine Kontamination der Produkte der vorstehenden Reaktionen zu verhindern - einig Likon-Amp PCR System - Test statt dezoksinukleozidtimidina enthält dezoksinukleoziduridin der, wenn in vitro - Syntheseschaltung anstatt in der richtigen Position eingebaut, d.h. Die stickstoffhaltige Base von Thymin, die in nativer DNA vorhanden ist, wird durch Uracil ersetzt. Uracil - DNA - Glycosylase ist , in das Reaktionsgemisch an den Analyten hinzugefügt zerstört nur verunreinigende Fragmente Desoxyuridin, aber nicht DNA nativen analysiert. Lt; / RTI & gt; Nachfolgendes Erhitzen auf 94 ^° C inaktiviert dieses Enzym und stört die Amplifikation in der PCR nicht.

Es gibt ein Testsystem, das auf der isothermen Amplifikation von rRNA basiert, für die zuerst die reverse Transkription und Synthese von DNA-Molekülen durchgeführt wird. Welches wiederum eine Matrix für die anschließende Synthese von RNA-Molekülen ist. RNA-Amplikons werden unter Verwendung einer Acridin-gefärbten DNA-Sonde nachgewiesen, wenn sie in einer Reaktionsröhrchenlösung hybridisiert werden. Diese Methode hat neben der hohen Empfindlichkeit den Vorteil, dass sie in einer Röhre analysiert werden kann, was eine Kontamination verhindert. Nach Angaben der Autoren erreicht die Sensitivität dieser Methode bei Atemwegsproben 90% mit einer Spezifität von 99-100%.

Neue Erkennungsmethoden werden in Echtzeit-PCR implementiert. Diese Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich dadurch, dass die PCR und die Detektion ihrer Ergebnisse gleichzeitig in einem geschlossenen Röhrchen durchgeführt werden. Dies vereinfacht nicht nur technologisch die Analysetechnik, sondern verhindert auch die Kontamination von Laborräumen und Testproben mit Produkten früherer PCR.

Bei der Echtzeit-PCR ist die Detektion der Ergebnisse auf Fluoreszenz zurückzuführen, die aus der Hybridisierung einer fluorogenen DNA-Sonde mit einem spezifischen DNA-Fragment, das während der PCR amplifiziert wurde, resultiert. Struktur fluorogenen DNA-Sonden konstruiert, so dass der Fluoreszenzmarker als Ergebnis der enzymatischen Reaktion freigesetzt wird, oder von dem Löschermolekül Fluoreszenz nur unter spezifischer Hybridisierung mit dem gewünschten DNA-Moleküle distanzierte während der PCR amplifiziert werden. Mit der Zunahme der Anzahl von Molekülen, die mit der Sonde hybridisiert sind, ist der Anstieg der Fluoreszenz auf das nachweisbare Niveau proportional zur Anzahl der Moleküle des amplifizierten Produkts. Da bei jedem Zyklus Anzahl von PCR-Fragment-DNA-Moleküle wird durch die Hälfte multipliziert, die Zykluszahl, bei der Fluoreszenz bestimmt wird, und erhöht umgekehrt proportional zu der Anzahl des DNA-Moleküls in der ursprünglichen Probe. Wird die Reaktion als Kalibrator mehrere unterschiedliche bekannte Konzentrationen von Molekülen entsprechenden DNA-Fragment von Mycobacterium tuberculosis einzuführen, das das Computerprogramm unter Verwendung von berechnet, und die Menge an genomischer DNA in dem Testmaterial werden kann.

Jedes Standardmuster ist doppelt vorhanden. Das quantitative Kriterium ist die minimale Anzahl von PCR-Zyklen, die für den Beginn und das Wachstum der bestimmten Fluoreszenz erforderlich sind. Auf der Abszisse - die Anzahl der Zyklen; die Ordinate ist der Fluoreszenzwert. Die DNA-Konzentrationen sind umgekehrt proportional zur Anzahl der für das Auftreten von Fluoreszenz erforderlichen Zyklen. In der rechten Spalte (21-32) sind die Zykluszahlen für die entsprechenden Konzentrationen markiert. Unterschiede zwischen den 10-fachen Konzentrationen der DNA-Fragmente 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 Zyklen. Bei zwei Patienten betrugen die Konzentrationen der IS6110-Fragmente etwa 10 ³ / ml und 10 ⁴ / ml. Unter Berücksichtigung der Anzahl der Wiederholungen (6-20) der im Genom von Mycobacterium tuberculosis analysierten Fragmente beträgt die Anzahl der Mykobakterien in klinischen Proben etwa 100 bzw. 1000 Zellen.

Der Einsatz von PCR bei der Diagnose von Tuberkulose

Die PCR-Methode wird am häufigsten zur beschleunigten Diagnose von Tuberkulose - Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in klinischen Proben verwendet: Sputum. Bronchialspülung, Pleuraexsudat, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Osteolyse punktiert, weibliche Genitaltraktaspirate und verschiedene Biopsieproben. Bei der Untersuchung von etwa 500 Proben von Sputum und Bronchialspülungen von 340 Patienten mit bestätigter Diagnose von Lungentuberkulose in den Niederlanden wurde die vergleichende Sensitivität von PCR, Kultur und Abstrichmikroskopie untersucht. Die Sensitivität der Analyse betrug 92.6.88.9 bzw. 52.4%. Die Spezifität aller Methoden betrug etwa 99%.

Die Wirksamkeit des Nachweises von Mycobacterium tuberculosis durch Abstrichmikroskopie, Aussaat auf dem Levenstein-Jensen-Medium, VASTES-Testsystem und PCR-Analyse wurde verglichen. PCR zeigte eine Empfindlichkeit von 74,4%, Mikroskopie - 33,8%, Aussaat auf einem dichten Medium - 48,9% und VASTES - 55,8%. Die durchschnittliche Nachweiszeit für die Aussaat auf einem Levenstein-Jensen-Medium beträgt 24 Tage. VASTES - 13 Tage, PCR - 1 Tag.

Die Möglichkeiten der Verwendung von PCR als eine empfindliche und schnelle Methode zur Überwachung der Wirksamkeit der Tuberkulosebehandlung werden ebenfalls diskutiert.

Der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-DNA durch PCR mit wirksamer Chemotherapie über eine längere Zeit bestimmt - im Durchschnitt 1,7 Monate im Vergleich zu Abstriche unter Fluoreszenzmikroskopie definiert, und um 2,5 Monate bei der bakteriologischen Untersuchung verglichen.

Diagnose von extrapulmonalen Formen der Tuberkulose

Die Bedeutung der PCR als sensitive Methode ist besonders für extrapulmonale Formen bedeutend, da bei diesen Formen klinisch-radiologische Methoden und traditionelle bakteriologische Methoden zur Bestimmung von Tuberkulose-Mycobakterien in diagnostischen Materialien unwirksam sind.

Bei der Untersuchung der Urinproben wurden positive PCR-Ergebnisse in 16 von 17 Patienten mit aktiven Tb und negativen Harn 4 Patienten inaktiven renal tuberculosis und 39 Patienten mit nontubercular Harnsystem Krankheit.

Die Wirksamkeit der PCR-Analyse bei der Untersuchung von Knochenmarkaspiraten bei Patienten mit Fieber unbekannter Herkunft wurde bei Verdacht auf Tuberkulose nachgewiesen. Zur Diagnostik der tuberkulösen Lymphadenitis wurden 102 Punktionsaspirate und eine Biopsie von 67 Kindern mit Verdacht auf tuberkulöse Lymphadenitis bei Kindern untersucht. Positive Ergebnisse wurden erhalten: 71,6% Echtzeit-PCR. Fluoreszenzmikroskopie - 46,3%. Kulturforschung - 41,8%. Bei der Untersuchung von 50 Lymphknotenbiopsien bei Patienten mit "Kratzenkrankheit" waren alle Ergebnisse negativ. Somit wurde eine 100% ige Spezifität der PCR-Analyse gezeigt. In der gleichen Arbeit, mit Punktions-Biopsie von Lymphknoten, wurde die Möglichkeit des Nachweises von M. Avium gezeigt.

Die Diagnostik der Tuberkulose der Infiltration des weiblichen Genitalbereichs ist bekanntlich eines der schwierigsten Probleme der Diagnostik. In einer PCR-Studie von Endometriumbiopsien, Endometriumaspiraten und Flüssigkeitsproben aus dem Douglas-Raum erhielten 14 (56%) von 25 laparoskopisch untersuchten Patienten mit Verdacht auf Tuberkulose positive Ergebnisse. Unter Verwendung von Abstrichmikroskopie und Kultur wurden 1 bzw. 2 Ergebnisse erhalten. Diese Fälle waren ebenfalls PCR-positiv. Die meisten PCR-positiven Ergebnisse bezogen sich auf Fälle mit charakteristischen Anzeichen von Tuberkulose nach der histologischen Studie; eine kleinere Zahl - mit Verdacht auf Tuberkulose nach Laparoskopie-Daten. Nur ein positives Ergebnis der PCR-Analyse wurde in Abwesenheit von laparoskopischen Daten für Tuberkulose erhalten.

Bei der Diagnose von extrapulmonalen Formen der Tuberkulose stellen Kliniker häufig die Frage nach der Möglichkeit, einen Erreger zu erkennen, wenn sie Blutproben mit der PCR-Methode testen. Literarische Daten deuten darauf hin, dass der Nachweis von DNA aus dem Mycobacterium tuberculosis aus Blutproben mit weit reichenden Formen der HIV-Infektion möglich ist. Die DNA von Mycobacterium tuberculosis wurde nur bei generalisierter Tuberkulose verschiedener Organe bei Patienten mit transplantierter Niere und Immunsuppression nachgewiesen.

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Speziesidentifizierung von Mykobakterien

Das PCR-Verfahren kann zur schnellen Identifizierung von Mykobakterien von Tuberkulose-Komplex und einigen Arten von Mykobakterien nontubercular sehr effektiv nach ihrem anfänglichen Wachstum erhalten. In diesem Fall kann die Verwendung von PCR 7-10 Tage sparen, notwendig für die anschließende kulturelle Identifizierung eines positiven Ergebnisses. Der PCR-Test ist technisch sehr einfach, da zur Erzielung einer hohen Sensitivität keine aufwendige Probenvorbereitung des klinischen Materials erforderlich ist. In der Studie 80 positiv in diesem Testsystem (MB Vasto. Organon Gesellschaft) alle positiven Kulturen von PCR waren streng spezifisch und für 1 Tag gehalten. Zur Identifizierung von anderen Arten von Mykobakterien bei der Herstellung von DNA des Kultur Pathogens mit spezifischen DNA-Sonden hybridisiert, markiert mit Acridin und durch das Auftreten von Chemilumineszenz über Chemiluminometer oder Nitrozellulose-Streifen mit einer visuellen Beurteilung nach der Hybridisierung nachgewiesen Stämmen. Mit Hilfe einer solchen Menge wird eine begrenzte Anzahl von Arten identifiziert: der Mycobacterium tuberculosis-Komplex. M. Avium, M. Avium-Komplex, M. Kansasii und M. Gordonae.

A. Telenti et al. Auch entwickelte ein relativ einfachen und kostengünstige Verfahren zur Identifizierung von Arten von klinisch wichtigen Spezies von Mykobakterien durch PCR und anschließende Behandlung mit zwei Restriktionsenzymen (Enzyme mit Eigenschaften geschnitten, um ein DNA-Molekül an spezifischen Punkten). Das DNA-Fragment wird amplifiziert. Welches für ein Hitzeschockprotein (65 kDa) kodiert und dann das PCR-Fragment von 439 Nukleotidpaaren, das durch PCR hergestellt wurde, getrennt mit zwei Enzymen, Bste II und Nae III, behandelt wird. Dann analysierte Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegel zwei Produkte erhalten wird, deren Größe (Anzahl von Basenpaaren) Bestimmen eines Standard-Set von DNA-Fragmenten (molekularer DNA-Marker) in der Länge von 100 bis 1000 Basenpaaren verwendet. In jedem der spezifischen Typen (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) erfassen zwei oder drei DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe für jedes Restriktionsenzym. Die Kombination verschiedener erhaltener DNA-Größen erlaubt die Unterscheidung dieser Spezies untereinander.

Die Technologie biologischer DNA-Microarrays wird entwickelt. Dies wird helfen, mehr als 100 Arten von Mykobakterien in einer Studie zu identifizieren.

Die Identifizierung von Arten kann auch durch PCR-Amplifikation der 16S rRNA-variable Region, gefolgt von Sequenzierung von Amplikons durchgeführt werden, wenn sie mit der entsprechenden Primärstruktur verglichen, die die Identifizierung von mehr als 40 Arten von Mykobakterium erlaubt.

Mit Hilfe der PCR kann auch eine Speziesidentifikation innerhalb des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes durchgeführt werden, einschließlich der Differenzierung von M. Bovis und M. Bovis BCG. Um dies zu tun, wird die Anwesenheit oder Abwesenheit einiger Gene in den genomischen Regionen von RD1 analysiert. RD9 und RD10. RD1 fehlt in M. Bovis BCG, ist aber in virulenten Spezies vorhanden, einschließlich M. Bovis.

Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobacterium tuberculosis mittels PCR

Ziele der molekulargenetischen Methoden zur Arzneimittel Empfindlichkeit oder Resistenz von Mycobacterium tuberculosis reduzieren Mutationen in spezifischen Nukleotidsequenzen bekannter Gene zu identifizieren. Grundlegende Verfahren basieren entweder auf direkte prochityvanii (Sequenzierung) diese Sequenzen nach der Amplifikation oder Hybridisierung von Biotin-markierten DNA während der PCR-DNA-Sonden, amplifizierten Fragmente. Beide Alternativen beinhalten das Identifizieren der Nukleotidsubstitutionen in den Sequenzen, die unter Verwendung von DNA-Sonden zur Abwesenheit führen oder unvollständige Hybridisierung an eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von Enzym-Konjugat (Streptavidin-alkalische Phosphatase) - Methode LIPA-Rif-TB.

Verfahren zum Messen der Fluoreszenz in einer ortsfesten auf Schliffe DNA mit bekannten Mutationen komplementäre Sonden in dem PCR amplifizierten Genregionen verantwortlich für die Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, genannt mikrobiochipov Methode. Der Hauptalgorithmus für die Durchführung dieser Forschung ist wie folgt. DNA, die aus einer klinischen Probe oder der Kultur von Mycobakterien ist notwendig zur Durchführung der PCR-Amplifikation der relevanten Fragmente von rpoB Gen für Arzneimittelempfindlichkeit gegen Rifampicin oder katG und inhA Gene kodieren Proteine von Mycobacterium verantwortlich sind für die Empfindlichkeit gegenüber Isoniazid nach isolieren. Die PCR-Ergebnisse werden mittels Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet, wobei die entsprechenden DNA-Fragmente der gewünschten Länge bestätigt werden. Dann wird eine zweite PCR-Runde durchgeführt, um eine Fluoreszenzmarkierung in die DNA einzuführen. Die Ergebnisse der PCR werden erneut durch Gelelektrophorese bestätigt. Danach wurde die Hybridisierung durchgeführt wird (Inkubation über Nacht) und anschließend das resultierende Material auf dem Biochip Waschen, die kurz in einer kleinen Glasplatte DNA-Stränge eine große Anzahl von festen ist (Sonden), die Sequenzen der arzneimittelempfindlichen Typ Mycobacterium tuberculosis an den Stellen möglich, Mutationen, Nucleotid komplementär sind. Sowie für die mutanten Sequenzen, die für die Arzneimittelresistenz verantwortlich sind. Lokalisierung von DNA-Sonden auf der Platte - genau definiert, und die Höhe der Fluoreszenz bei Hybridisierung beobachtet das Ergebnis unter Verwendung eines speziellen Lesegerät zu ermitteln ist installiert. In diesem Zusammenhang werden die Ergebnisse der Analyse mittels eines speziellen Computerprogramms bestimmt.

In den letzten Jahren wurden alternative Methoden zur Bestimmung der Arzneimittelsensitivität von Mycobacteria tuberculosis auf Basis der Real-Time-PCR-Technologie entwickelt, die es ermöglichen, diese Studien in einem Closed-Tube-Test durchzuführen.

In Abb. 13-13 präsentiert das Ergebnis der Analyse von klinischen Kulturen von Mycobacterium tuberculosis bei der Bestimmung der Arzneimittelresistenz gegenüber Rifampicin durch Real-Time-PCR: 218 - eine Kontrollprobe (sensitiv gegenüber Rifampicin); 93 - positive Kontrolle für die Mutation von Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - Positivkontrolle für Mutation von Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - Versuchsproben. Ergebnis der Berechnung der kinetischen Kurven der Amplifikation auf 4 Kanälen: Kanal 1: 393 - positive Kontrolle für Mutation von Ser-Trp TCG-TGG; Kanal 2: 4482 - Positivkontrolle für Mutation von Ser-Leu-TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentelle Proben; Kanal 4: kinetische Kurven der Amplifikation aller Proben, die an dem Experiment teilnehmen. Positive Kontrolle der Amplifikationsreaktion. Schlussfolgerungen: Basierend auf den Ergebnissen der Analyse wurden die folgenden Mutationen festgestellt, die die Resistenz gegen Rifampicin bestimmen: in den Proben 162, 163, 172, 295-Ser-Leu TCG-TTG. Das gleiche Prinzip wurde verwendet, um die Arzneimittelresistenz gegen Isoniazid für die Gene katG und inhA zu bestimmen, die die häufigsten Mutationen bestimmen.

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Stammidentifizierung von Mycobacterium tuberculosis

Die am gründlichsten untersuchten Methode der Identifizierung von Stämmen von Mycobacterium tuberculosis ist eine Technik, Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus genannt (RFLP RFLP,. Oder in der englischen Fassung), und die auf fragmentirovanin (Beschränkung) von Mycobacterium tuberculosis-DNA-Enzyme Pvu II und die Fragmente erhielten anschließende Hybridisierung mit bestimmten spezifischen Sequenzen auf der DNA basierten sein wiederholtes Element IS6110. Intraspezifische Variabilität wird aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von Wiederholungen von IS6110 und ihrer Position auf DNA realisiert. Ebenso wie die Vielzahl von Distanzen zwischen bestimmten Angriffspunkten von Enzym-Restriktionsenzymen (Restriktionsstellen) und IS6110-Elementen. Diese Technologie ist sehr kompliziert und zeitaufwendig. Nach Behandlung mit DNA aus einer Kultur von Mycobacterium tuberculosis extrahierte, Gelelektrophorese mit einem Restriktionsenzym durchgeführt wird, und dann übertragene DNA-Fragmente unterschiedlicher Längen auf einer Nitrocellulosemembran, die Hybridisierung wurde mittels enzymatischer Reaktionen mit Fragmenten von IS6110-Elemente und detektiert durchgeführt. Das resultierende spezifische Muster von Banden charakterisiert die DNA eines spezifischen Stammes von Mycobacterium tuberculosis. Mit Hilfe der Computeranalyse wird die Identität oder Verwandtschaft der Stämme aufgedeckt. Trotz der Tatsache, dass das RFLP-Verfahren am diskriminierendsten ist, d.h. Die größte Anzahl der Unterschiede in den analysierten Stämmen identifiziert, ist es unwirksam für eine kleine Anzahl (weniger als 5) IS6110-Repeats in einigen Stämmen beobachtet. In Abb. 13-14 zeigt die Ergebnisse der RFLP-Typisierung von Stämmen.

Eine Alternative könnte die Methode der Spoligotypisierung - Analyse des Polymorphismus von Spacer-DNA-Sequenzen - sein, die zwischen direkten Wiederholungen der DR-Region liegt. Bei der Durchführung der Spoligotypisierung der Stämme wird die PCR mit Primern durchgeführt, die die DR-Region begrenzen, wonach Fragmente unterschiedlicher Länge gebildet werden, die mit den variablen Zwischenregionen der DNA hybridisieren. Die Analyse der Spacer-Sequenzen der DR-Region wird vorgestellt. Laut den Forschern, einfacher, produktiver und geeignet für das primäre Screening von Stämmen und vorläufige epidemiologische Analyse, sowie Forschung direkt klinisches Material.

Klar, effektiver und technisch verfügbares Verfahren ist ein VNTR (eine Abkürzung der englischen Worte) oder das Verfahren für die variable Anzahl von Tandemwiederholungen in der exakten DNA von Mycobacterium tuberculosis zu bestimmen. Diese Methode basiert nur auf der Verwendung von PCR und erfordert keine zusätzliche Manipulation. Da die Anzahl der Tandem-Repeats in verschiedenen Stämmen und an verschiedenen Loci unterschiedlich ist, werden die Fragmente unterschiedlicher Größe bestimmt und analysiert an dem resultierenden Elektrophorese-Diagramm der PCR-Produkte. Den Forschern zufolge erreicht die Verwendung von VNTR einen höheren Grad an Diskriminierung von Stämmen als mit der RFLP-Methode.

In den letzten Jahren wurde viel Aufmerksamkeit auf die Verbreitung von Mycobacterium tuberculosis-Stämmen der W-Beijing-Familie (manchmal als Beijing-Stamm bezeichnet) gerichtet, die weitgehend resistent gegen Arzneimittel sind.

Grundlegende Anforderungen an die Qualität der molekularbiologischen Forschung

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Grundlegende regulatorische Dokumente für die PCR

Bestellungen russisches Ministerium für Gesundheit: №45 von 02.07.2000 g .. Nummer 109 von 21.03.2003 g .. Nummer 64 von 21.02.2000, den Leitlinien: 1.3.1888-04 „Organisation der Arbeit in Studien PCR Material mit pathogenen biologischen infizierten Mittel der Gruppen III-IV der Pathogenität "; 1.3.1794-03 "Organisation der Arbeit bei der Untersuchung von PCR-Material, infiziert mit Mikroorganismen der Pathogenitätsgruppen I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 „Dekontaminierung des Materials, infizierte Bakterien I-IV-Gruppen Pathogenität, wenn die PCR unter Verwendung von“ 2001 Die Anlage 11 die einheitlichen Anweisungen für mikrobiologische Untersuchungsmethoden bei der Identifizierung, Diagnose und Behandlung von Tuberkulose.

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Das Personal

Klinische Labordiagnostik, bakteriologische Ärzte, Virologen, Biologen des klinisch-diagnostischen Labors, sowie Fachärzte mit weiterführender medizinischer Ausbildung, die in der etablierten Ordnung Spezialisierung und Weiterbildung absolviert haben, können molekularbiologische Untersuchungen durchführen.

Anordnung der Laborräume

Folgende Laborräume sind erforderlich:

• Der Probenbehandlungsbereich ist ein Labor, das für die Arbeit mit Infektionserregern der Pathogenitätsgruppen III-IV gemäß den methodischen Anweisungen 13.1888-04 angepasst ist.
• Zone für die Vorbereitung von Reaktionsgemischen PCR - Laborraum, der Schutz vor internen Labor Kontamination - "saubere" Zone.
• • Wenn Elektrophorese oder Hybridisierung verwendet wird, um PCR-Produkte zu analysieren. Ein Laborraum, in dem die vervielfältigten DNA-Fragmente aus dem Amplifikationsröhrchen extrahiert werden und entsprechend den Anforderungen für PCR-Laboratorien (Richtlinien 1.3.1794-03, Richtlinien 1.3.1888-04) in die Umwelt gelangen können, sollte vollständig sein von den in den vorstehenden Absätzen Die Bewegung vom Bereich der Elektrophorese zur Probenbehandlungszone und der "sauberen" Zone von Personen, Geräten, Materialien und Gegenständen sowie Lufttransport durch die Lüftungsanlage oder durch Zugluft sollte vermieden werden. Diese Zone ist für den fluorimetrischen Nachweis von PCR-Produkten nicht erforderlich.
• Der Raum zur Dokumentation und Bearbeitung der Ergebnisse ist mit Computern und notwendiger Büroausstattung ausgestattet. Dieser Raum kann Geräte enthalten, die den Nachweis von PCR-Produkten ermöglichen, ohne das Röhrchen zu öffnen. - Fluoreszenz-PCR-Detektoren und Thermocycler für Echtzeit-PCR.

Die hygienischen und epidemiologischen Anforderungen für die primäre Behandlung von Sputum entsprechen den mikrobiologischen Standardanforderungen für die Arbeit mit Mycobacteria tuberculosis.

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Fertigstellung von Laborgeräten für die PCR-Diagnostik

Das Labor umfasst Ausrüstung für die folgenden Räume.

• Raum für die Probenvorbereitung, enthält folgende Ausrüstung: Laminar der Schutzklasse II "SP-1.2": Festkörperthermostat mit Heizhaube für Reagenzgläser vom Typ "Eppendorf"; Mikrozentrifuge bei 13.000 U / min; eine Zentrifuge (Vortex); Kühlschrank mit einem Temperaturbereich von -20 ^bis C 10 bis ^etwa C; Pipetten mit variablem Volumen der "Rroline" -Serie; eine Pumpe mit einer OM-1-Auffangflasche; ein Stativ für Pipetten; Stativarbeitsplatz 200x0,5 ml; Stativarbeitsplatz 50x1,5 ml; Ständer für die Aufbewahrung von Reagenzgläsern 80x1,5 ml;
• Reaktionsansatz Präparationsraum: Schutzkammer PCR-Box ("Laminar-C. 110 cm); Zentrifuge - Vortex; Pipetten mit variablem Volumen der Proline-Serie; ein Stativ für Pipetten; Stativarbeitsplatz 200x0,2 ml; Ständer für die Aufbewahrung von Reagenzgläsern 80x1,5 ml; Kühlschrank mit einem Temperaturbereich von -20 ^bis C bis + 10 ^von C;
• Raum für Elektrophorese: Kamera für horizontale Elektrophorese; Stromversorgung; Transilluminator;
• DNA-Verstärker oder Nukleinsäureanalysator (PCR in Echtzeit) mit einem Computer und Software; kann in jedem freien Raum platziert werden. Wenn Echtzeit-PCR-Technologie verwendet wird. Platz für die Elektrophorese ist nicht erforderlich.

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Externe Qualitätskontrolle

Um sicher zu sein, objektiv zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, sollten Labors am System der externen Bewertung der Qualität der Laborforschung teilnehmen.

Teilnehmer am Qualitätskontrollsystem erhalten; 12 Fläschchen mit der gefriergetrockneten Bakterienzellsuspensionen, von denen zwei die E. Coli E. Coir enthält, 3 Vials mit Mycobacterium tuberculosis (avirulent Stamm) bei 10 ² / ml; 3 Ampullen mit Zellen eines ähnlichen Stammes in einer Konzentration von 10 ⁴ / ml; 2 Ampullen mit Nicht-Tuberkulose-Mykobakterien M. Avium-intracellulare und M. Kansasii in einer Konzentration von 10 ⁵ / ml.

Verteilte Tests zur externen Qualitätsbewertung werden in zwei unabhängigen Labors mit umfangreicher Erfahrung in diesem Bereich vorab getestet.

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