Embryonale Stammzellen

Die Entdeckung embryonaler Stammzellen geschah nicht zufällig, sondern auf dem vorbereiteten Boden der wissenschaftlichen Forschung im Bereich der Entwicklungsbiologie. Der Begriff „Stammzelle“ wurde 1908 auf dem Kongress der Hämatologischen Gesellschaft in Berlin von Alexander Maximow in Bezug auf hämatopoetische Zellen in die Medizin eingeführt. Lange vor der Isolierung und Produktion stabiler Linien pluripotenter embryonaler Stammzellen wurden Stamm-Terato-(Embryokarzinom-)Zellen in Studien früher Entwicklungsprozesse verwendet, mit deren Hilfe unbekannte Mechanismen der Embryogenese untersucht wurden, einschließlich der Expressionssequenz früher Gene und der Proteinprodukte ihrer Aktivität.

Aber ist die Totipotenz des menschlichen Genoms im Laufe der Evolution unwiederbringlich verloren gegangen? Nein, und die Embryogenese ist ein Beweis dafür. Wenn dem so ist, wann wird dann grundsätzlich der zweite Weg der evolutionären Entwicklung realisiert? Wahrscheinlich, wenn der Mensch in den Weltraum eintritt, wo die Umweltbedingungen über einen ausreichend langen Zeitraum relativ konstant bleiben. Der Verlust von Knochengewebe (Demineralisierung der Knochen in Schwerelosigkeit), das sehr langsam umgebaut und regeneriert wird, kann als erster Schritt im Anpassungsprozess des Menschen als Spezies an das Leben im Weltraum angesehen werden. Der Preis für den zweiten Weg der evolutionären Entwicklung wird jedoch ein anderer sein – der Preis für die Rückkehr der Totipotenz und absoluten Plastizität aller Zellen wird Sterilität sein. In dieser Welt der „evolutionären Chamäleons“ müssen wir uns also ohne Meiose, durch Knospung, fortpflanzen. Aber wir werden lange leben. Die Unsterblichkeit der Telomerase ist die Unsterblichkeit einer Amöbe. In einem vielzelligen Organismus sind Stammzellen das Substrat quantitativer und qualitativer Langlebigkeit.

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Quellen embryonaler Stammzellen

Heute dienen als Quellen embryonaler Stammzellen für die Laborforschung Maus-Teratokarzinom-Linien (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) und menschliche Teratokarzinom-Linien (NTERA-2, TERA-2, H-9-Klon) sowie Trauneon-ESC-Linien. Die Verfügbarkeit eines detaillierten Zellpasses mit Angaben zum Immunphänotyp, Ergebnissen der Chromosomenanalyse, mRNA-Expressionsprofilen, exponierten Rezeptoren und intrazellulären Signalproteinen gleicht jedoch die erheblichen Mängel der Teratokarzinom-ESC-Linien nicht aus – den schnellen Verlust der Totipotenz und die Unmöglichkeit, sie in klinischen Studien zu verwenden, während die gemischte Differenzierung in der Kultur es sehr schwierig macht, eine reine spezialisierte Linie aus einer heterogenen Zellpopulation zu isolieren. Daher sind die Quellen der für klinische Zwecke erzeugten ESC-Linien üblicherweise die innere Zellmasse der Blastozyste, einzelne Blastomeren von Embryonen im 8-Zellen-Stadium, Morulazellen späterer Stadien sowie Urkeimzellen.

Es ist zu beachten, dass Teratokarzinomzellen, obwohl sie die Eigenschaft der Pluripotenz besitzen, im Vergleich zu embryonalen Stammzellen ein deutlich geringeres pluripotentes Potenzial aufweisen. Ihre Integration mit embryonalen Zellen führt selten zur Bildung von Chimären, die zudem niemals Gameten mit dem Genotyp von Teratokarzinomzellen bilden. Es wird angenommen, dass dies auf das häufige Auftreten von Chromosomenanomalien während der Kultivierung von Teratokarzinomzellen zurückzuführen ist: Verlust des Y-Chromosoms, verschiedene Trisomien, Deletionen oder Translokationen.

Es gab wiederholt Versuche, eine menschliche embryonale Stammzelllinie (ESC) zu isolieren, doch dieses Ziel konnte bisher nicht erreicht werden, da normale menschliche Blastozysten schwer zugänglich sind. Zudem treten Chromosomenanomalien beim Menschen häufiger auf als in der Embryogenese von Tieren. Die überwiegende Mehrheit der frühen menschlichen Embryonen, die nach In-vitro-Fertilisation gewonnen werden, weisen ein chaotisches Chromosomenmosaik auf und sind oft mit numerischen und strukturellen Abweichungen behaftet. Selbst später, im Blastozystenstadium, bestehen nur 20–25 % der menschlichen Embryonen aus Zellen mit normalem Karyotyp. Es war praktisch unmöglich, solche Embryonen zur Erzeugung embryonaler Stammzellen (ESC) zu verwenden, da Zygoten üblicherweise bis zum Zwei- oder Vier-Blastomeren-Stadium kultiviert und dann in die Gebärmutter transplantiert wurden. Erst vor relativ kurzer Zeit wurde eine zuverlässige Technik entwickelt, um befruchtete menschliche Eizellen bis zum Blastozystenstadium zu kultivieren. Die Einführung dieser Technik in die Praxis der In-vitro-Fertilisation hat nicht nur die Häufigkeit erfolgreicher Implantationsergebnisse erhöht, sondern auch dazu geführt, dass normale Blastozysten leichter zugänglich sind.

Eine weitere Quelle pluripotenter Stammzellen sind Urkeimzellen, die anders als die fortgeschritteneren Vorläuferpopulationen des Keimepithels kein Beta-Integrin auf ihrer Oberfläche aufweisen, dafür aber eine hohe Aktivität der alkalischen Phosphatase exprimieren. Es ist anzumerken, dass Populationen von Stammzellen, die sich aus Urkeimzellen gebildet haben, seit den 1980er Jahren experimentell untersucht werden. Damals wurde eine Technik entwickelt, um Urkeimzellen aus dem Rudiment der Gonaden des Mausembryos zu isolieren. Die ersten erfolglosen Ergebnisse der Kultivierung Urkeimzellen in vitro legten die Sinnlosigkeit dieser Versuche nahe, da die Zellen zwar überlebten, sich aber nicht vermehrten und innerhalb des ersten Tages abstarben. Später wurde festgestellt, dass sich Urkeimzellen von Mäusen in vitro nur in Gegenwart löslicher und membrangebundener spezifischer Polypeptid-Wachstumsfaktoren im Kulturmedium vermehren. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass für das Überleben und die Proliferation primärer Keimzellen nicht nur die Anwesenheit von LIF, sondern auch von membrangebundenen und löslichen Steel-Faktoren (SIF) im Kulturmedium notwendig ist. Diese Peptide werden von somatischen Zellen homozygoter Embryonen mit der Steel-Mutation produziert, und eines davon ist ein Ligand des cKit-Proto-Onkogens.

Primäre Keimzellen von Säugetieren und Menschen haben einen extragonadalen Ursprung und sind die Quelle der klonalen Entwicklung der Keimzelllinie. Der Ursprung der primordialen Keimzelllinie sowie aller embryonalen Gewebe und des extraembryonalen Mesoderms ist der Epiblast (primäres Ektoderm) früher Embryonen, der eine mosaikartige Struktur aufweist. Durch mikrochirurgische Entfernung verschiedener Teile des frühen Embryos wurde im Epiblasten eine Lokalisierungszone des Klons festgelegter Vorläufer primordialer Keimzellen ermittelt. Unter Verwendung von Rhodamindextran, das als Zellmarker verwendet wurde, wurde festgestellt, dass die Vorläufer primordialer Keimzellen im proximalen Bereich des Epiblasten in der Nähe des extraembryonalen Ektoderms lokalisiert sind. Die primordiale Keimzelllinie geht auf einen 45-Zellen-Klon zurück, dessen Allokation ganz zu Beginn der Gastrulation erfolgt. Anschließend segregiert der Klon, und während der Gastrulation gelangen die primären Keimzellen in das extraembryonale Mesoderm und befinden sich an der Basis des Allantoisrudiments, hinter dem Primärstreifen. Von dort wandern die primären Keimzellen in den ventralen Teil des Endoderms des Dickdarms und bewegen sich dann aktiv entlang des Mesenteriums, wobei sie am Ende der Migration die Genitalleisten besiedeln. Während der Migration sowie in den ersten 2–3 Tagen der Lokalisierung im Gonadenrudiment vermehren sich die primären Keimzellen aktiv und durchlaufen acht Replikationszyklen. Wenn zu Beginn der Migration etwa 50 primäre Keimzellen vorhanden sind, beträgt die Zahl der primären Keimzellen in den Genitalleisten von Mausembryonen nach zwölf Tagen Entwicklung mehr als 25.000.

Die funktionelle Ähnlichkeit von embryonalen Stammzellen (ESCs) und Urkeimzellen zeigt sich in der vollständigen Integration der letzteren in die Blastozyste mit Ersatz der inneren Zellmasse und anschließender vollwertiger Entwicklung des Embryos, dessen Gewebe nur noch aus den Nachkommen der Urkeimzellen besteht. Auch in anderen Eigenschaften erwiesen sich die Urkeimzellen der Maus als identisch mit den ESCs. Sie zeigten die Fähigkeit zur Differenzierung in verschiedene Richtungen, zur Bildung embryoider Körper in vitro und zur Bildung von Teratomen in vivo bei subkutaner Verabreichung an immundefiziente Mäuse, die den spontanen testikulären Teratomen bei 129/ter-Mäusen ähneln.

Es wurde festgestellt, dass isolierte primäre Keimzellen von 8 Tage alten Mausembryonen bei Zugabe von LIF, membrangebundenem und löslichem SIF zum Medium 4 Tage lang in der Kultur überleben und sich vermehren, dann aber absterben. Zudem fällt der Zeitraum, in dem das Absterben der primären Keimzellen in der Kultur beobachtet wird, mit dem Entwicklungsstadium der Mausembryonen (12,5–13,5 Tage) zusammen, in dem weibliche primäre Keimzellen in den Keimdrüsenrudimenten in die Meiose eintreten und mitotische Teilungen in männlichen primären Keimzellen blockiert sind. Werden dem Medium jedoch nicht nur die Wachstumsfaktoren LIF und SIF, sondern auch FGF2 hinzugefügt, vermehren sich die primären Keimzellen weiter, und in den Subkulturen bilden sich Kolonien von Zellen, die sich auch nach Entfernung der Wachstumsfaktoren (SIF und FGF) aus dem Medium noch vermehren können. Solche Zellen können ohne Zugabe des löslichen Wachstumsfaktors LIF über lange Zeit auf einem Substrat aus embryonalen Fibroblasten kultiviert werden. Es wurde vorgeschlagen, diese aus primordialen Keimzellen gewonnenen stabilen Zelllinien als embryonale Keimzellen zu bezeichnen. Diese Bezeichnung ist jedoch nicht zutreffend, da es unmöglich ist, durch die Kultivierung von EG-Zellen embryonale Keimzellen zu erhalten, die in der Lage sind, nachfolgende Stadien der Oogenese oder Spermatogenese durchzuführen. Dies liegt daran, dass EG-Zelllinien, obwohl sie aus primordialen Keimzellen stammen, in der Kultur die Eigenschaften embryonaler pluripotenter Stammzellen annehmen und dadurch die Fähigkeit zur Keimzellentwicklung verlieren. Mit anderen Worten: Primordiale Keimzellen verlieren bei der Kultivierung die Eigenschaften von Gametenvorläufern und wandeln sich in ESC-ähnliche pluripotente Zellen um.

Es wurde festgestellt, dass bei der Einführung von EG-Zellen in immundefiziente Mäuse keine Teratome entstehen. Es wird angenommen, dass der Verlust der Fähigkeit menschlicher EG-Zellen, Teratome zu bilden, darauf zurückzuführen ist, dass diese Linien nicht direkt aus kultivierten primären Keimzellen, sondern aus Zellen gewonnen wurden, die aus embryoiden Körpern isoliert wurden. Daher ist es möglich, dass es sich um Nachkommen pluripotenter, aber bereits determinierter Zellen handelt.

Es ist zu beachten, dass es grundlegende Unterschiede zwischen EG-Zellen und Urkeimzellen gibt. Letztere ermöglichen nicht die Gewinnung chimärer Mausembryonen, was auf die mangelnde Fähigkeit der Urkeimzellen hindeutet, sich in die innere Zellmasse oder das Trophektoderm zu integrieren. Die Eigenschaften der Urkeimzellpopulation ähneln eher den determinierten Linien somatischer Zellen späterer Embryonen, deren Einführung in die Blastozyste ebenfalls nicht zur Bildung chimärer Embryonen führt.

Durch Modifikation der Kultivierungstechnik embryoider Körper, die durch Aggregation von EG-Zellen gewonnen wurden, gelang es, durch Selektion auf selektiven Medien eine weitere Population pluripotenter Zellen, sogenannter „Embryoid Body Derived Cells“ (EBD-Zellen), zu gewinnen. Die Fähigkeit der EBD-Zellen, sich in Kultur über lange Zeit zu vermehren, ermöglichte die Herstellung stabiler Zelllinien determinierter Zellen. Es wurden Klone von Zellen erhalten, die ein breites Spektrum an mRNA- und Proteinmarkern spezialisierter Zellen exprimierten. Dieser Ansatz bewies letztlich, dass menschliche primäre Keimzellen pluripotent sind und sich in vitro in verschiedene Zelltypen differenzieren: Neuronen, Neuroglia, Gefäßendothel, hämatopoetische Zellen, Muskel- und Endodermzellen.

Alternative Quellen embryonaler Stammzellen

Eine alternative Quelle für humane embryonale Stammzellen (ESC) können Hybridzellen sein. Die Implantation eines heterogenen Konstrukts, das durch Fusion von somatischen Zellen des menschlichen Fötus mit einer Kuh-Eizelle (nach Entfernung des Vorkerns) mittels Elektroporation gewonnen wurde, in die Gebärmutter scheinträchtiger Kühe ermöglicht die Gewinnung einer inneren Zellmasse aus einem künstlichen Embryo im präimplantativen Entwicklungsstadium. Zu diesem Zweck wird im ersten Stadium eine Blastozyste aus einer Kuh-Eizelle mit transplantiertem menschlichen Zellkern gewonnen.

Im zweiten Schritt wird aus der Blastozyste ein Embryoblast isoliert, aus dem mittels der Thomson-Methode embryonale Stammzellen (ESCs) isoliert werden. Bemerkenswerterweise wurden die besten Ergebnisse bei der Isolierung von ESC-Linien mit dieser Methode mit Kernen von Follikelzellen oder primären Keimzellen erzielt, die im menschlichen Körper im Ruhezustand verbleiben. Dies liegt daran, dass die Kerne menschlicher Zellen, die in eine Kuh-Eizelle transplantiert werden, unverkürzte Telomere und eine hohe Telomeaseaktivität aufweisen müssen, um eine vorzeitige Alterung der aus einer Hybrid-Eizelle gewonnenen ESC-Klone zu vermeiden (Repin, 2001). Bekanntlich sind Oct3, Oct4, Tcf und Groucho die wichtigsten intrazellulären Markerproteine von ESCs, die zu den sogenannten Chromatin-Silencer-Proteinen gehören. Silencer sorgen für eine besonders kompakte Verpackung von Heterochromatin, die die Bildung von Euchromatin-Schleifen verhindert. Die durch diese Proteine vermittelte Chromatinverpackung korreliert mit der Totipotenz des ESC-Genoms. Bisher wurde festgestellt, dass reife bovine und menschliche Eizellen der einzige spezialisierte Zelltyp sind, der hohe Konzentrationen von Silencer-Proteinen im Zytoplasma enthält. Auf dieser Grundlage wurde eine Methode zur Gewinnung hybrider embryonaler Stammzellen durch Übertragung somatischer Zellkerne in entkernte bovine Eizellen entwickelt. Vorläufige In-vitro-Studien zeigten, dass das Zytoplasma boviner Eizellen nach 12-24 Stunden Kultivierung die Totipotenz des menschlichen somatischen Zellkerngenoms wiederherstellt.

Von besonderem Interesse sind die Daten zu den Besonderheiten der Präimplantationsentwicklung menschlicher Embryonen, die auf eine spätere Ersetzung totipotenter Zellen durch eine Population pluripotenter Zellen als bei Mäusen hinweisen. Eine Studie zu zellulären Transformationen zeigte, dass neben ES-Zellen auch Trophoblastenzellen aus den Zellen der inneren Zellmasse menschlicher Blastozysten entstehen, was auf ihre Gesamtpotenz hinweist.

Es ist bekannt, dass im Blastozystenstadium zwei unterschiedlich ausgeprägte Zellpopulationen entstehen. Eine davon bildet die äußere Schicht der Blastozyste – das Trophoblasten-Ektoderm, dessen Abkömmlinge die Trophoblastenzellen und andere embryonale Bestandteile der Plazenta sind. Die zweite Zellpopulation ist zu einer dichten Masse gruppiert, die die innere Oberfläche des Trophoblasten berührt. Die Abkömmlinge der Zellpopulation der inneren Zellmasse sind sämtliche Gewebe und Rudimente der Organe des Embryos. Im Stadium der späten Blastozyste bildet sich aus der inneren Zellmasse das extraembryonale Endoderm und der Epiblast (primäres Ektoderm). Dabei behalten die Epiblastenzellen ihre Pluripotenz, während die Differenzierungsfähigkeit der Zellen des extraembryonalen Endoderms eingeschränkt ist.

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Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen

Bis vor kurzem glaubte man, es sei unmöglich, aus Trophoblasten ESCs zu gewinnen. Eine aus einer Blastozyste isolierte Linie diploider Trophoektoderm-Stammzellen vermehrt sich jedoch und wandelt sich in einem Medium, das FGF2 und Heparin anstelle von LIF enthält, in Stammzellen um. Wird FGF2 aus dem Medium entfernt, hören die Trophoektodermzellen auf, sich zu vermehren, die Chromosomen-Endoreduplikation beginnt in ihnen und die zellulären Elemente des Trophoektoderms wandeln sich allmählich in riesige Trophoblastzellen um. Wahrscheinlich stimuliert LIF die Proliferation von Trophoektodermzellen nicht, da FGF2 einen anderen Trans-Signalmechanismus auslöst, da FGF2 durch Bindung an den Plasmarezeptor (FGFR2) die MAP-Kinasen ERK1 und ERK2 im Zytoplasma aktiviert. Wenn folglich ein Signalweg (LIF – gpl30 – JAK-Kinase – STAT3) in Blastozystenzellen aktiviert wird, werden die Zellen der inneren Zellmasse in pluripotente embryonale Stammzellen umgewandelt, und wenn der zweite Mechanismus der transmembranären Signaltransduktion (FGF2 – FGFR2 – MAP-Kinase ERK1/ERK2) aktiviert wird, werden in der Blastozyste Trophektoderm-Stammzellen gebildet. Die Wahl des Signalwegs wiederum hängt von der Aktivität des Gens oct4 ab. Dieses Gen, das zur POU-Domäne gehört, befindet sich im t-Locus von Autosom 17 und wird während der Oogenese, während der Teilungsphase sowie in den Zellen der inneren Zellmasse der Blastozyste und in den primären Keimzellen exprimiert. Die funktionelle Rolle des Gens oct4 besteht darin, einen Transkriptionsfaktor zu kodieren, der für die Entstehung pluripotenter Zellen, ihre Differenzierung und Dedifferenzierung notwendig ist.

Die Expression des oct4-Gens in embryonalen Stammzellen (ESCs) variiert je nach Interaktion dieses Transkriptionsfaktors mit Kofaktoren. Die gezielte Regulation der oct4-Expression in Blastozysten zeigte, dass bei reduzierter Aktivität die Hälfte der Zellen Trophektoderm bildet, während bei erhöhter induzierter oct4-Expression überwiegend ESCs entstehen.

Im Experiment können ESCs während der Kultivierung totipotenter Blastomeren im Furchungsstadium sowie im Gastrulationsstadium und späteren Stadien der Embryonalentwicklung nicht in eine Linie übertragen werden. Maus-ESCs werden normalerweise am 3,5.–4,5. Tag der Schwangerschaft isoliert, was dem sechsten (einschichtige Blastozyste) und siebten Stadium (zweischichtige Blastozyste – früher Eizylinder) der normalen Embryogenese entspricht. Offensichtlich enthalten Mausembryonen nur in der Präimplantationsperiode Zellpopulationen, die sich in ESCs umwandeln können. Folglich ist die Isolierung von ESC-Linien nur in bestimmten Stadien der Embryogenese möglich. Die während der Furchung entstehende Zygote und Blastomeren sind totipotent im Hinblick auf die Möglichkeit der Entwicklung eines lebensfähigen Embryos mit Embryonalmembranen und Plazenta. Der Verlust der Gesamtpotenz der Keimzellen beginnt im späten Morulastadium, wenn die weitere Entwicklung der Blastomeren von ihrer Lage abhängt. Frühe Morulablastomeren behalten ihre Totipotenz, da experimentelle Manipulationen mit Veränderungen ihrer Lokalisation, wie etwa eine Umkehrung ihrer Lage, die Entwicklung eines vollwertigen Embryos nicht verhindern.

Es wurde festgestellt, dass die Effizienz der Isolierung embryonaler Stammzellen in eine Linie vom Zustand der Blastozysten zum Zeitpunkt ihrer Explantation beeinflusst wird. Die Verwendung von Blastozysten nach der Modellierung einer siebentägigen Diapause im Reproduktionstrakt von Mäusen, die am 3,5. Tag der Schwangerschaft ovariektomiert und mit Progesteron behandelt wurden, ermöglicht eine erfolgreichere Isolierung embryonaler Stammzelllinien. Es wird angenommen, dass unter solchen Bedingungen die Anzahl der Blastomeren, die die innere Zellmasse bilden, zunimmt. Es ist auch möglich, dass der Zellzyklus verlängert wird und die meisten Blastomeren in die G0-Phase eintreten.

Darüber hinaus hängt die Entstehung stabiler pluripotenter embryonaler Stammzellen (ESCs) vom Genotyp der Embryonen ab: Aus Blastozysten der Mauslinie 129 lassen sich ESCs relativ einfach isolieren, aus CS7BL/6-Mäusen ist ihre Gewinnung deutlich schwieriger, und aus Blastozysten von CBA/Ca-Mäusen ist die Isolierung einer ESC-Linie praktisch unmöglich. Offenbar weisen frühe Embryonen genetische Merkmale auf, die die Entwicklung einer pluripotenten ESC-Linie beeinflussen. Dennoch wurden durch die Kultivierung isolierter Epiblasten sowie durch selektive Selektion differenzierender Zellen ESC-Linien aus frühen Embryonen von CBA/Ca-Mäusen isoliert.

Eine bewährte Standardtechnik zur Gewinnung von ESC-Linien aus Blastozysten wird in Laborhandbüchern zur Technik von Experimenten mit frühen Embryonen beschrieben. Experimentelle ESC-Linien können auch durch Kultivierung isolierter Epiblasten (primäres Ektoderm) von 4,5 Tage alten Mausembryonen mithilfe einer recht komplexen mikrochirurgischen Technik und modifizierten Kultivierungsbedingungen gewonnen werden. Der Arbeitsaufwand dieses Verfahrens ist gerechtfertigt, da die Häufigkeit der ESC-Linienbildung in diesem Fall deutlich höher war als bei Arbeiten mit der inneren Zellmasse der Blastozyste.

Um ESC-Linien zu isolieren, wird jeder Klon in eine Mikrotiterplatte übertragen, ein Aggregat von 40–60 Zellen gezüchtet und anschließend wieder dispergiert. Durch mehrmalige Wiederholung dieses Verfahrens erhalten wir eine immortalisierte ESC-Linie mit der maximalen Proliferationsrate normokaryotypischer, an Kunststoff gebundener Zellen, die nach 50–100 Passagen ihre Totipotenz und hohe Telomeraseaktivität behalten. Bei der Erhaltung von ESC-Linien besteht die größte Gefahr in der Kontamination des Mediums oder Serums mit bakteriellen Endotoxinen – selbst geringste Endotoxinkonzentrationen im Kulturmedium führen zum Massensterben unreifer Keimzellen. Bei sorgfältiger Überwachung des linearen Wachstums und rechtzeitiger Dispersion sind ESCs in Kultur zu einer symmetrischen Teilung fähig, bei der beide Tochterzellen pluripotent bleiben und eine unbegrenzte Zahl von Zellzyklen durchlaufen können, wobei sie einen diploiden Karyotyp und die Gesamtpotenz behalten.

Die Selektion einer reinen Population menschlicher embryonaler Stammzellen (ESCs) kann nach Transfektion ihres Genoms mit rekombinanten DNA-Molekülen erfolgen, die das Gen für die Synthese des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) enthalten. Die GFP-Expression nimmt zu, wenn ESCs unter proliferationsfördernden Bedingungen gezüchtet werden, während mit Beginn der Differenzierung der Expressionsgrad dieses Gens abnimmt, was die Selektion reiner, stabiler, pluripotenter Zelllinien auf einem selektiven Medium ermöglicht. Bei der Kultivierung von mittels GFP-Selektion isolierten ESCs erhöht sich die Häufigkeit der Koloniebildung um ein Vielfaches, da die starke antiproliferative Wirkung differenzierter Zellen unter den Bedingungen der Selektionskulturen eliminiert wird.

Die Translation menschlicher embryonaler Stammzellen in eine Linie erfolgt durch ihre Isolierung aus Präimplantationsembryonen (im Stadium von 80–120 Zellen), die nach der In-vitro-Fertilisation übrig bleiben. Zu diesem Zweck werden künstlich gewonnene „überschüssige“ Embryonen mechanisch im Delbecco-Eagle-Medium dispergiert. Nach Markierung der Zellen mit selektiven monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzmarkierung werden die Embryoblasten isoliert. Der Embryoblast wird mithilfe einer Dispase-Kollagenase-Mischung in einzelne Zellen dispergiert. Die dissoziierten Zellen werden in einem Spezialmedium (80 % Delbecco-Medium + 20 % fötales Kälberserum in Gegenwart von 500 µg/ml IL-6, LIF und SCF) über einer Feeder-Monoschicht aus embryonalen Fibroblasten der ersten drei Passagen gezüchtet. In diesem Fall werden Überleben und Proliferation der Stamm- und Progenitorzellen durch die Wirkung von IL-6, LIF und SCF aufrechterhalten. In einem solchen Medium wachsen ESCs als Suspensionsklone ungebundener Zellballen, die durch wiederholtes, sanftes Pipettieren dissoziiert werden müssen. Neue Klone erscheinen am 5.-7. Tag in der suspendierten Kultur. Die maximale Wachstumsrate von ESCs wird durch wiederholte Dissoziation von Klonen im Stadium von 10-15 Zellen erreicht. Dann wird jeder Klon in eine Mikrotiterplatte übertragen und zu einem Aggregat von 40-50 Zellen gezüchtet. Der Vorgang wird in Passagen viele Male wiederholt, wodurch das Kulturvolumen auf eine Dichte von 5-10 Millionen Zellen pro 6-cm-Schale erhöht wird. Durch diese Passagen isolierte Thomson 10 unsterbliche Klone menschlicher ESCs, die nach 100 Passagen eine hohe Telomeraseaktivität, die Fähigkeit zur starken Proliferation, minimale phänotypische Eigenschaften und Gesamtpotenz mit der Fähigkeit zur Differenzierung in 350 spezialisierte Zelllinien aus dem Ekto-, Meso- und Endoderm behielten. Die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen begann (nach Mediumwechsel, Serumzugabe und Eliminierung von LIF) mit der Zelladhäsion an das Substrat, was auf die Entwicklung des Zytoskeletts und die Expression von Adhäsionsrezeptoren hindeutet. Wichtig ist, dass menschliche embryonale Stammzellen trotz unbegrenzter Proliferation einen normalen Karyotyp behielten.

Die zweite Methode zur Isolierung menschlicher embryonaler Stammzellen basiert auf der Verwendung primärer Keimzellen. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass E-Zell-Linien aus den Genitalfalten 12,5 Tage alter Mausembryonen gewonnen werden können. Allerdings war in diesen Fällen die Häufigkeit der Bildung von Vorläuferzelllinien deutlich geringer als in Experimenten mit älteren Embryonen. Gleichzeitig sind primäre Keimzellen aus den Gonaden von Mausembryonen im Alter von 13,5 Tagen überhaupt nicht in der Lage, sich in Linien zu transformieren.

Die ersten stabilen Linien pluripotenter menschlicher EG-Zellen wurden aus primären Gonozyten gewonnen, die aus den Gonaden 5-9 Wochen alter Embryonen isoliert wurden. Die isolierten Zellen wurden auf einem Substrat aus inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten in DMEM-Medium mit fötalem Serum, ergänzt mit Mercaptoethanol, Forskolin und rekombinanten menschlichen Wachstumsfaktoren (FGF und LIF), kultiviert. Nach 7-12 Tagen erschienen in der Kultur multizelluläre Kolonien, die hinsichtlich morphologischer Merkmale und molekularer Marker menschlichen EG-Zellen entsprachen. Nach der Aggregation bildeten diese Zellen embryoide Körper, bei deren weiterer Entwicklung spezialisierte Zellen erschienen, die für Derivate aller drei Keimblätter charakteristisch sind. Im Verlauf von 10-20 Passagen behielten die EG-Zelllinien einen normalen Karyotyp und verloren ihre Pluripotenz nicht.

Es wurde auch gezeigt, dass die kombinierte Wirkung von LIF, membrangebundenen und löslichen Steel-Faktoren sowie TGF-β das Entwicklungsprogramm primordialer Keimzellen verändert. Anstatt die mitotische Teilung einzustellen und mit der Differenzierung in Richtung Oogenese oder Spermatogenese zu beginnen, proliferieren primordiale Keimzellen weiter. Nach mehreren weiteren mitotischen Zyklen ähneln sie Epiblasten und wandeln sich, ohne die Eigenschaften von Keimzellvorläufern zu besitzen, in pluripotente embryonale Stammzellen (EG) um.

So wurden 1998 erstmals immortalisierte Linien primordialer Keimzellen aus dem Genitalrudiment menschlichen fetalen Autopsiegewebes isoliert. Bei der menschlichen Embryogenese erscheinen primordiale Keimzellen in der 3. Entwicklungswoche im Dottersack und wandern in der 4.-5. Woche in die Genitalhöckerzone, wo sie ruhende Populationen primärer Gonozyten bilden. In inaktivem Zustand bleiben primordiale Keimzellen bis zur Geburt im Embryo erhalten. Linien primordialer Keimzellen werden aus dem fetalen Genitalhöcker 5-9 Wochen alter Embryonen isoliert, deren extrahiertes Gewebe ex tempore mit einer Mischung aus Kollagenasen Typ IV-V, Hyaluronidase und DNase behandelt wird, um die quantitative und qualitative Zellausbeute zu erhöhen. Primordiale Keimzellen im Gewebe des fetalen Genitalhöckers sind von stromalen (mesenchymalen) Sertoli-Zellen umgeben. Die funktionelle Aufgabe der Sertoli-Zellen ist die Produktion antiapoptotischer Faktoren (Fas-Ligand), Mitogene und Immunsuppressiva, die die Keimzellen vor körpereigenen Immunangriffen schützen. Darüber hinaus spielt das stromale Mikroumfeld des Genitalhöckers eine wichtige Rolle bei der Reifung der Gameten. Die isolierten primären Keimzellen werden in Kultur über eine Feeder-Stromaschicht aus fetalen Fibroblasten der ersten drei Passagen ausgesät. Die wirksamste Kombination von Mitogenen ist ein Komplex aus LIF, FGF und Forskolin (einem Stimulator der cAMP-Bildung). Die Proliferation primärer Keimzellen in vitro erfordert die Zugabe von fetalem Serum, in dessen Gegenwart die Vermehrung primärer Gonozyten in Kultur mit der Bildung von Klonen sphärischer, nicht an das Substrat gebundener Zellen einhergeht.

An den National Institutes of Health, USA, kam man auf der Grundlage einer Zusammenfassung vorhandener Daten zu Methoden zur Isolierung menschlicher ESC-Linien aus Blastozysten zu dem vorläufigen Schluss, dass die erfolgreiche Isolierung von ESCs am wahrscheinlichsten ist, wenn Blastozysten mit einer gut ausgebildeten inneren Zellmasse kultiviert werden (Stammzellen: wissenschaftlicher Fortschritt und künftige Forschungsrichtungen. Nat. Inst, of Health USA). Aus dieser Sicht sind menschliche Blastozysten am 5. Entwicklungstag die optimale ESC-Quelle zur Herstellung von Linien. Von diesen sollte bei der Isolierung der inneren Zellmasse das Trophektoderm sorgfältig entfernt werden. Die isolierte innere Zellmasse, die in diesem Stadium aus 30–35 Zellen besteht, sollte auf einem Substrat aus embryonalen Mausfibroblasten kultiviert werden, was eine entscheidende Voraussetzung für die Bildung von ESC-Kolonien in der Kultur ist.

Analyse phänotypischer Merkmale embryonaler Stammzellen

Von besonderem Interesse ist die vergleichende Analyse der phänotypischen Merkmale embryonaler Stammzellen zwischen verschiedenen Arten. Es zeigte sich, dass menschliche ESC-Kolonien dichte Ansammlungen abgeflachter, epithelartiger Zellen sind, während die embryoiden Körper von Mäusen aus einem losen Konglomerat gerundeter Zellen bestehen. In menschlichen ESCs ist der Kern-Plasma-Verhältnisindex niedriger als in Maus-ESCs. Embryonale Stammzellen von Affen bilden flachere Zellkolonien mit unebenen Rändern. Einzelne Zellen sind in frühen Klonen von Primaten-ESCs leicht erkennbar. Proliferierende ESCs aller untersuchten Tierarten exprimieren keine MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle. Gleichzeitig reagieren menschliche ESCs positiv auf TERA 1-60- und GCTM-2-Antikörper, was auf das Vorhandensein von Keratin-/Chondroitinsulfat-Proteoglykanen auf ihrer Oberfläche hinweist, die charakteristisch für Embryo-(Terato)-Karzinom-Stammzellen sind. Die Expression des oct4-Gens in embryonalen Stammzellen (ESCs) aller Tierarten deutet darauf hin, dass trotz phänotypischer Unterschiede offenbar derselbe Satz von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz verantwortlich sind, in menschlichen und Maus-ESCs aktiviert ist (Peru, 2001). Darüber hinaus weisen aus Ratten-, Schweine-, Kaninchen-, Primaten- und Rinderembryonen isolierte ESC-Linien ähnliche morphologische Merkmale, einen ähnlichen Satz molekularer Identifikationsmarker und einen nahezu identischen molekularen Mechanismus zur Implementierung von Embryogeneseprogrammen auf, was einen neuen Blick auf die Problematik der Xenotransplantation ermöglicht.

Im Gegensatz zur normalen Embryogenese in vivo wird die Proliferation von ESCs in vitro nicht von der Bildung von Keimblättern begleitet und erfolgt vor dem Hintergrund der Blockierung homöotischer Hoxgene, d. h. ohne Organogenese. Da die Segmentierungsgene nicht funktionieren, ist es unmöglich, solche Phasen der Embryogenese wie die Anlage von Somiten, die Embryosegmentierung, die Bildung des Dottersacks, der Allantois und anderer provisorischer Organe und Gewebe in einer ESC-Kultur zu reproduzieren. Kultivierte ESCs scheinen zu Beginn des Bildungsprozesses von 350 Restriktionslinien spezialisierter Zellen eingefroren zu sein. Somit stellen ein Klon von Tochter-Progenitorzellen und ein zentral lokalisierter ESC nur ein Modell eines Embryos dar, während dessen Entwicklung gleichzeitig in unterschiedlichen Geweberegionen unterschiedliche Linien spezialisierter Zellen gebildet werden, die jedoch aus gemeinsamen Vorläufern stammen. Trotz der minimalen Rezeptorkonzentration auf der Oberfläche von embryonalen Stammzellen (ESCs) behalten sie die Fähigkeit, primitive morphogenetische Prozesse durchzuführen und die volumetrischen Strukturen eines frühen Embryos zu imitieren: Eine Suspension von ESCs in Kultur aggregiert und bildet Strukturen, die Blastozysten oder sogar späteren Embryonen (Eizellen) ähneln. Solche Suspensionsaggregate werden als einfache bzw. komplexe Embryoidkörper bezeichnet.

Bei der gemischten Differenzierung werden frühe Gene des Ektoderms (oct3, fgf-5, nodal), Endoderms (gata-4), Mesoderms (brachyury), kardiogenen Mesoderms (pkh-2.5), Neuralrohrs (msx3) und der Hämatopoese (elkf) gleichzeitig in verschiedenen Zellen eines embryoiden Körpers exprimiert. Durch die Verwendung verschiedener Kombinationen von Wachstumsfaktoren und Zytokinen zur gezielten Beeinflussung der Bildung von Keimblattzellen in vitro gelang es in einer Reihe von Fällen, embryoide Körper zu erhalten, in denen Ektoderm- oder Mesodermgene bevorzugt exprimiert wurden, was den Weg zur Modellierung der Gastrulation und der frühen Phasen der Organogenese ebnet.

Das klonale Wachstum von embryonalen Stammzellen (ESCs) ist ein Hinweis auf eine asymmetrische Zellteilung, bei der nur eine ESC im Zentrum des Klons unbegrenztes Proliferationspotenzial besitzt, während die zweite Tochterzelle eine Generation von Progenitorzellen hervorbringt, die sich bereits in der Differenzierung befinden. Daher ist die Klonproliferationsrate an der Peripherie des Embryoidkörpers höher als im Zentrum. Die Randzellen des wachsenden Klons unterliegen einer spontanen, ungeordneten Differenzierung, migrieren oder sterben durch apoptotische Mechanismen ab. Diese Ereignisse bestimmen das Schicksal des Klons: Übersteigt die Proliferationsrate die Migrations- und apoptotische Zelltodrate, wächst der Klon weiter; bei gleicher Apoptoserate und Zellneubildungsrate stabilisiert er sich, und bei umgekehrtem Verhältnis tritt Regression ein. Progenitorzellen teilen sich symmetrisch, d. h. beide Tochterzellen differenzieren sich anschließend zu reifen spezialisierten Zelllinien. Das Verhältnis von ESCs zu Progenitorzellen variiert, die Anzahl der ESCs beträgt jedoch immer nur einen Bruchteil eines Prozents der Progenitorzellpopulation. Daher kann nur durch sorgfältiges Pipettieren und rechtzeitige Disaggregation der Klone die Anzahl der ESCs in der Kultur erhöht werden. Die Disaggregation der Klone im Stadium von 10–12 Zellen erwies sich als am effektivsten, um eine maximale Ausbeute an ESCs zu erzielen. Richtung und Grad der Differenzierung der Zellen im Embryoidkörper hängen von ihrer Lage ab. Die äußeren Zellen des Embryoidkörpers exprimieren das Gen oct4 nicht und differenzieren sich in Zellen des primären Endoderms, aus denen anschließend epithelähnliche Zellen des parietalen und viszeralen extraembryonalen Endoderms gebildet werden. Die inneren Zellen des Embryoidkörpers exprimieren das Gen oct4 und behalten ihre Pluripotenz für 48 Stunden Kultivierung. Allerdings wird die Kultur dann morphologisch in eine Epithelmonoschicht umstrukturiert, und die Expression von Genen, die die Entwicklung des primären Ektoderms steuern, beginnt. Als nächstes beginnt der Prozess der völlig ungeordneten Zytodifferenzierung mit dem Auftreten verschiedener Zelltypen, die von allen drei Keimblättern abgeleitet sind. Im Prozess der spontanen Differenzierung der Zellen des Embryoidkörpers entstehen zunächst Aggregate mit Endodermmarkern in Form von Fragmenten (Zysten) des Dottersacks. Anschließend erscheinen in diesen Strukturen Angioblasten und Endothelzellen der wachsenden Kapillaren. In den letzten Stadien der spontanen Differenzierung entwickeln sich aus den inneren Zellen des Embryoidkörpers verschiedene terminal differenzierte Zellen, darunter Neuronen, Gliazellen, Kardiomyozyten, Makrophagen und Erythrozyten. Bis zu einem gewissen Grad (unter Berücksichtigung der räumlichen Inversion der Bildung der Keimgewebeschichten) ist es mithilfe von Embryoidkörpern möglich, morphogenetische Prozesse in vitro zu untersuchen und die molekularen Mechanismen der Anfangsphasen der embryonalen Zytodifferenzierung zu analysieren.sowie die Rolle spezifischer Gene bei der Umsetzung dieser Prozesse festzustellen.

Innerhalb des Klons gibt es also Zellen, in denen unterschiedliche genetische Entwicklungsprogramme entdeckt wurden – embryoide Zellkerne, frühe Vorläuferzellen und sich differenzierende Vorläuferzellenpopulationen. Die Kultivierung von embryoiden Zellkernen mithilfe von Hanging-Drop- oder Massenkulturmethoden ohne Feederschicht und ohne Zugabe von LIF zum Medium führt zwangsläufig zur Bildung embryoider Körper. Die Morphologie der Zellen der äußeren und inneren Schichten embryoider Körper ist unterschiedlich. Die äußere Schicht besteht aus großen, verzweigten Zellen. Ihre der Umgebung zugewandte Oberfläche ist mit zahlreichen Mikrovilli bedeckt. Die äußere Zellschicht ist von der inneren Schicht durch eine Basalmembran getrennt, die der Reichert-Membran ähnelt, während die Zellen der inneren Schicht embryoider Körper aus hochprismatischem Epithel bestehen. Morphologisch ähnelt die innere Schicht, obwohl sie viele sich teilende Zellen enthält, eher undifferenzierten Kolonien embryoider Zellkernen.

Eigenschaften menschlicher embryonaler Stammzellen

Das Fehlen parenchymatös-mesenchymaler Signalinteraktionen vor dem Hintergrund der Blockierung des Homöose-Gens führt zu einem gestörten Wachstum von ES-Zellen in der Kultur, da dies die Bildung und Entwicklung der Infrastruktur provisorischer Organe stört. Das unorganisierte Wachstum und die ungeordnete spontane Differenzierung von ES-Zellen in der Kultur sind auf das Fehlen einer mesenchymalen Markierung des Stroma-Gerüsts zukünftiger Organe zurückzuführen: In vitro ist es durchaus möglich, Millionen von Hepatozyten zu bilden, aber es ist unmöglich, einen einzigen Leberläppchen zu erhalten, der strukturelle und funktionelle Elemente wie Sinus, Disse-Räume und Kupffer-Zellen enthält.

Man geht davon aus, dass die Pluripotenz von ESCs ausschließlich während der Embryogenese mit der Bildung von Geweben und Organen des Embryos realisiert wird, während die Plazenta und die Nabelschnur Derivate des Trophoblasten sind. In der Trophoektodermalmembran eingeschlossene ESCs erzeugen sequenziell Klone provisorischer Zellen, die das Entwicklungsprogramm durch die kombinatorische mRNA der volumetrischen topographischen Matrix von Nokhteyov umsetzen, welche die räumliche Anordnung, Form und Größe, die Anzahl der Zellen provisorischer und definitiver Organe sowie den Zusammenbau des Parenchyms zu strukturellen und funktionellen Einheiten vorgibt. Gleichzeitig bleiben ESCs der einzige Zelltyp, bei dem der molekulare Mechanismus zur Realisierung ihrer Potenzen vollständig vom genetischen Entwicklungsprogramm abgekoppelt ist, und die ESCs selbst sind aufgrund der Blockierung sowohl der Rezeptorwahrnehmung als auch der Transsignalsysteme nicht in der Lage, mit anderen Zellen zu interagieren. Eine adäquate Aktivierung von embryonalen Stammzellen führt jedoch zu einer schrittweisen Entwicklung des Embryogeneseprogramms, die mit der Geburt eines voll ausgebildeten Organismus aus Milliarden von Zellen endet, der bereit für das extrauterine Leben ist. Auf diesem kurzzeitigen, aber unvorstellbar langfristigen Weg im zellulären Raum treten unweigerlich Fehler sowohl in den molekularen Mechanismen auf, die die lebenswichtige Aktivität der Zellen sicherstellen, als auch in den Programmen, die ihre Proliferation, Differenzierung und Spezialisierung steuern. Daher werden in der modernen Pharmakogenomik Erkrankungen der Molekularstruktur und Erkrankungen der Zellprogrammierung getrennt betrachtet. Die Wirkung der meisten neuen Medikamente zielt zudem auf die Korrektur der Programme der Differenzierung, Proliferation und Organogenese sowie auf die Regeneration von Organen und Geweben. Im erwachsenen Organismus ermöglichen es embryonale Stammzellen, das Verhalten von Stamm-/Progenitorzellen zu steuern, die in Gehirn, Leber, Milz, Knochenmark und andere menschliche Organe transplantiert werden, um das geschädigte Parenchym der Empfängerorgane durch Differenzierung und Spezialisierung von Spenderzellen auf der konservierten mesenchymalen Matrix wiederherzustellen. Im Wesentlichen beginnt die Umsetzung des Totipotenzprogramms auf der Ebene des Genoms von Eizelle, Zygote und Blastomere; diese Zellen wurden jedoch noch nicht in den für die experimentelle und praktische Medizin erforderlichen Mengen geklont und passagiert. Daher bleiben embryonale Stammzellen eine einzigartige Quelle genetischer Informationen, die Codes für eine dreidimensionale Karte des Embryos und Codes für die lineare Restriktion spezialisierter Zelllinien während der Gastrulation enthalten.

Das nahezu unbegrenzte Regenerationspotenzial von ESCs beruht auf der Tatsache, dass ihr Genom im Gegensatz zum genetischen Apparat differenzierter somatischer Zellen pluripotenziell bleibt. Eine der Erscheinungsformen des Ruhezustands der in ESCs eingebetteten genetischen Information ist der sogenannte minimale Phänotyp – auf der Oberfläche von ESCs wird eine begrenzte Anzahl von Rezeptoren exprimiert, und dementsprechend werden nur sehr wenige Trans-Signalprogramme für die Interaktion des Zellkernapparats mit ihrer Mikroumgebung eingesetzt. Vor dem Hintergrund des Ruhezustands von Genen, die für die Einschränkung spezialisierter Zelllinien und die Zelldifferenzierung verantwortlich sind, werden nur etwa 30 von 500 Genen aktiviert, deren Produkte die Verbindung der Zelle mit der umgebenden Mikroumgebung sicherstellen. Mithilfe der Methode der seriellen Analyse der Genexpression wurde gezeigt, dass bei gemeinsamer Arbeit der wichtigsten Funktionseinheiten des Genoms, die die Energetik und den Stoffwechsel in somatischen Zellen und embryonalen Stammzellen regulieren, letztere einen sehr niedrigen mRNA-Spiegel von Rezeptoren, G-Proteinen, sekundären Botenstoffen, Transkriptasen, Expressions- und Repressionskofaktoren aufweisen, d. h. das gesamte System der transmembranären Übertragung des regulatorischen Signals an die Zelle. Dies ist auf das Fehlen oder die sehr geringe Expression von Transsignalgenen zurückzuführen. Während der induzierten Differenzierung im Genom der embryonalen Stammzellen stellen 18 funktionierende Gene synchron ihre Arbeit ein, während 61 Transsignalgene aktiviert werden, die die Synthese von Zelladhäsionsrezeptoren, Komponenten der extrazellulären Matrix, Restriktionstranskriptasen und Botenstoffen des Signalübertragungssystems von den Rezeptoren der Zellplasmamembran zum Kernapparat steuern. Gleichzeitig wird die Expression von Genen, die für die Synthese von Silencer-Proteinen verantwortlich sind, sowie von Co-Inhibitoren der Genexpression, die die Totipotenz des Genoms der embryonalen Stammzellen gewährleisten, blockiert.

Es wurden Genmarker für Zellen aller drei Keimblätter gefunden. Die Identifizierung der ektodermalen Zellschicht erfolgt durch die Expression der Nodal-, Oct3- und FGF-5-Gene, der Mesodermzellen durch die Brachyury- und Zeta-Globin-Gene und des Endoderms durch die Expression des Gata-4-Gens. Bei normaler Embryogenese während der Gastrulationsphase ist eine aktive Migration unreifer Populationen von Stamm- und Vorläuferzellen zu beobachten, die lokal die Entwicklungszonen der Gesichtsknochen des Schädels, einiger Teile des Gehirns, des peripheren Nervensystems, des Reizleitungssystems des Herzens und des Thymus markieren, deren Gewebe aus Klonen von Migrantenzellen gebildet werden. Die Markierung von Zellen durch frühe Gene der Keimblätter erleichtert die topografische Analyse der Migrationsprozesse von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Embryo. Es wurde insbesondere festgestellt, dass in Aggregaten von P19-Embryokarzinomzellen die Expression des ersten Mesodermgens Brachyury während der Phase der verminderten Expression der Gene des Gewebeplasminogenaktivators, des α-Fetoproteins, des Keratins 8 und des Keratins 19 beginnt, die Marker der ersten migrierenden Mesodermpopulationen sind. Folglich beginnt die Bildung von Geweben mesodermalen Ursprungs erst nach Abschluss des Prozesses der Punktmigration und Ausbreitung mesodermaler Vorläuferzellen.

Trotz äußerst eingeschränkter phänotypischer Merkmale und des Fehlens der meisten Trans-Signaleinheiten exprimieren embryonale Stammzellen (ESCs) dennoch einige Rezeptormoleküle, die zu ihrer Identifizierung verwendet werden können. Bemerkenswert ist, dass sich Markerantigene für ESCs bei Menschen und Primaten als häufig erwiesen haben. Am häufigsten werden markierte Antikörper gegen die membrangebundenen Antigene SSEA-3 und SSEA-4 (einzigartige Lipidantigene, die einen Komplex aus dem Glykolipid GL7 und Sialinsäure darstellen) sowie die hochpolymeren Glykoproteine TRA-1-81 und TRA-1-60 zur Markierung von ESCs verwendet. Darüber hinaus exprimieren ESCs das spezifische embryonale Antigen SSEA-1 und endogene alkalische Phosphatase sowie den spezifischen Transkriptionsfaktor Oct4. Letzterer ist für die Aufrechterhaltung der Mechanismen der ESC-Proliferation notwendig – der spezifische Transkriptionsfaktor Oct4 aktiviert die Expression des Gens für Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 und stabilisiert die Expression der Gene, die für die unbegrenzte DNA-Replikation in unreifen Zellen verantwortlich sind. Die wichtigsten intrazellulären Markerproteine sind Oct3, Oct4, Tcf und Groucho, die mit den Chromatin-Silencer-Proteinen verwandt sind.

Fast unmittelbar nach den langjährigen erfolgreichen Versuchen, embryonale Stammzellen außerhalb des Körpers zu kultivieren und die ersten Kulturen von aus Mausblastozysten isolierten Stammzellen sowie Kulturen primärer Keimzellen zu gewinnen, begann eine Phase der Erforschung des pluripotenten Potenzials von embryonalen Stammzellen, als diese in Embryonen in frühen Entwicklungsstadien eingebracht wurden. Es zeigte sich, dass embryonale Stammzellen im Morula- und Blastozystenstadium chimäre Embryonen bilden können, in denen die Nachkommen der Spender-ESCs in allen somatischen Geweben und sogar in den Gameten nachweisbar sind. So wurde in der Entwicklungsbiologie mithilfe von embryonalen Stammzellen eine „Brücke“ zwischen experimentellen Studien in vivo und in vitro geschlagen, was die Möglichkeiten zur Untersuchung der Prozesse der Bildung primärer Gewebe und Organe, ihrer Differenzierung und der embryonalen Organogenese deutlich erweiterte.

Es ist eindeutig erwiesen, dass embryonale Stammzellen (ESCs) während der Embryogenese in vivo in die Zellmasse des frühen Embryos integriert werden und ihre Derivate in allen Organen und Geweben vorkommen. ESCs besiedeln eine Keimzelllinie im chimären Embryo, deren Nachkommen vollwertige Eizellen und Spermien bilden. Embryonale Stammzellen sind klonogen – eine einzelne ESC kann eine genetisch identische Zellkolonie mit molekularen Markern bilden, darunter die Expression des oct4-Gens und der alkalischen Phosphatase, eine hohe Telomeraseaktivität und die Expression bestimmter embryonaler Antigene.

Um die Mechanismen der Embryogenese mithilfe von embryonalen Stammzellen (ESCs) zu untersuchen, wurde eine Methode zur Morula-Chimärisierung entwickelt. Dabei wird ein biologisches Konstrukt geschaffen, das außen eine Schicht tetraploider Empfängerblastomeren aufweist und in das Spender-ESCs eingeführt werden. Aus den Nachkommen der tetraploiden Empfängerblastomeren bildet sich so der Trophoblast, der die Einnistung und Plazentation sicherstellt. Die Spender-ESCs fungieren als innere Zellmasse, aus der der Körper eines lebensfähigen Embryos und eine Linie primärer Vorläuferkeimzellen gebildet werden. Der Forschungswert der ESCs liegt nicht nur darin, dass bei In-vitro-Manipulationen ihres Genoms die Pluripotenz erhalten bleibt, sondern auch darin, dass die Fähigkeit der ESCs, an der Bildung primärer Keimzellen eines chimären Embryos mitzuwirken, erhalten bleibt. Es wurde gezeigt, dass die Nachkommen nur einer genetisch veränderten embryonalen Stammzelle (ESC) alle primären Rudimente und sich entwickelnden Gewebe eines chimären Embryos besiedeln, der durch Aggregation oder Kokultivierung dieser Zelle mit einem 8-Zellen-Embryo gewonnen wurde. Bei der Transplantation von mit dem Gen für grün fluoreszierendes Protein transfizierten ESCs in die Morula von Mäusen wurden fluoreszierende Nachkommen dieser Zelle in allen untersuchten Geweben des sich entwickelnden Embryos gefunden (Shimada, 1999). Die Transplantation von ESCs in die Morula ermöglicht die Schaffung lebensfähiger Mäuse, deren Organismus ausschließlich aus den Nachkommen der Spender-ESC besteht, was verschiedene Möglichkeiten des therapeutischen Klonens eröffnet. Dieser methodische Ansatz wird heute erfolgreich zur Untersuchung entwicklungsbiologischer Probleme eingesetzt, insbesondere zur Analyse der Mechanismen der genetischen Inaktivierung des X-Chromosoms oder der epigenetischen Instabilität von ESCs. Die Transplantation von ESCs in einen frühen Embryo wird auch in der Agrarbiotechnologie sowie in Gentherapie-Experimenten eingesetzt.

Die Transplantation genetisch modifizierter embryonaler Stammzellen (ESCs) wird genutzt, um Zielzellen mutierter Gene zu testen. In vitro kultivierte ESCs werden in der Biotechnologie zur Erzeugung von Knockout-Mäusen eingesetzt. Dazu wird das zu untersuchende Gen durch homologe Rekombination (Knockout) aus den ESCs entfernt und Zellen ohne dieses Gen auf selektivem Medium isoliert. Knockout-ESCs werden anschließend in die Blastozyste eingebracht oder mit Morula-Blastomeren aggregiert. Die so gewonnenen chimären frühen Embryonen werden in Empfängerweibchen transplantiert, und aus den neugeborenen Mäusen werden Individuen mit für ein bestimmtes Gen nullizygoten Gameten ausgewählt. Mit dieser Technologie wurden zahlreiche Knockout-Mauslinien erzeugt, die in der experimentellen Biologie und Medizin breite Anwendung finden. Solche biologischen Modelle dienen der Untersuchung der Bedeutung bestimmter Gene für die embryonale Entwicklung sowie ihrer Rolle bei den Mechanismen menschlicher Krankheiten und pathologischer Zustände. Darüber hinaus werden Knockout-Tierlinien in der präklinischen Erprobung neuer Gentherapiemethoden eingesetzt. Durch Transfektion des normalen Allels eines mutierten Gens in das Genom von embryonalen Stammzellen (ESCs) kann beispielsweise eine Mutation, die das hämatopoetische System betrifft, wirksam korrigiert werden. Durch die Einführung fremder Gene in ESCs können rasch Linien homozygoter transgener Labortiere erzeugt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die Technik der gezielten rekombinanten Gendeletion bisher nur in Bezug auf Maus-ESCs zuverlässig entwickelt wurde. Mithilfe von doppelten Knockout-ESCs von Mäusen wurde die funktionelle Rolle der Genclusterregion auf Chromosom 7 (eine Kopie der Genomregion auf dem menschlichen Chromosom 19) und der proximalen Region von Chromosom 11 (eine Kopie des menschlichen Chromosoms 5g) geklärt – die Deletion dieser Gene in Maus-ESCs ermöglichte die Bewertung der Funktion ihrer Analoga beim Menschen.

Die Möglichkeiten zur Untersuchung der Funktion menschlicher Embryogenesegene haben sich erweitert. Durch Transfektion in das Genom embryonaler Stammzellen von Labortieren konnte insbesondere die Rolle des Kryptogens bei der Bildung und Entwicklung des kardiogenen Mesoderms und des Pax-6-Gens bei der Embryogenese des Auges geklärt werden. Die ersten Karten der Genexpression in unreifen, proliferierenden embryonalen Stammzellen von Teratokarzinomen und Blastozysten von Mäusen werden derzeit erstellt und eine suppressive Repression transsignalisierender Gene in embryonalen Stammzellen wurde bestätigt. Eine Kombination aus 60–80 mutierten embryonalen Stammzellen und 20–30 Zellen normaler präimplantativer Mausembryonen führt zur Entwicklung chimärer Embryonen, in denen die Organanlagen aus Spender- und Empfängerzellen bestehen, wodurch die Rolle unbekannter Gene bei der Gastrulation und Organogenese geklärt werden kann. Die funktionelle Karte der Gene sich entwickelnder Mausembryonen wurde durch Informationen über die Rolle des sf-1-Gens bei der Bildung der Nebenniere und der Gonaden, des wt-1-Gens bei der Bildung der Niere, von Genen der myoD-Familie bei der Bildung der Skelettmuskulatur und von Genen der gata-1-4-Familie bei der Restriktionsreifung der Erythropoese- und Lymphopoese-Rudimente ergänzt.

Durch gezieltes Abschalten mütterlicher und väterlicher Allele von Genen in embryonalen Stammzellen mittels Vektorrekombinasen konnten die Funktionen verschiedener Gene in der Frühphase der Embryogenese geklärt werden, und die Technologie des gezielten Transfers unbekannter menschlicher Gene in embryonale Stammzellen von Mäusen trägt zur Entdeckung neuer mutierter Gene bei, die für die Entstehung schwerer Erbkrankheiten verantwortlich sind. Mithilfe der Knockout-Methode wurde die obligatorische Bedeutung einiger Gene für die Bildung embryonaler Gewebe ermittelt: gata-4 – für das Myokard, gata-1 – für die erythroide Linie des hämatopoetischen Gewebes, myoD – für die Skelettmuskulatur, Brachyury – für das Mesoderm, Restriktionstranskriptasen hnf3 und hnf4 – für Leberstammzellen, rag-2 – für die Bildung von T- und B-Lymphozytenklonen (Repin, 2001). Die doppelte Deletion von Genen in embryonalen Stammzellen (ESCs) hat den Zugang zur Untersuchung der funktionellen Rolle von Keimblattgenen, der Segmentierung und der Homöose eröffnet, und die Transplantation von ESCs ermöglichte die Gewinnung lebensfähiger Hybridembryonen verschiedener Arten. Mithilfe einer verbesserten Technik zur Transplantation einer einzelnen Spender-ESC in einen 8-Zellen-Embryo konnte die Chimärisierung zahlreicher Organe des Empfängerembryos auf zellulärer Ebene nachgewiesen werden. Es ist anzumerken, dass nach der Einführung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen in die Blastozyste Zellsprossen menschlichen Gewebes in den Organen von Empfängermäusen gefunden wurden. Es wurde festgestellt, dass pluripotente ESCs während der Organbildung im Blut von Mausembryonen zirkulieren. Es ist möglich, dass ihre biologische Funktion in der embryonalen Organisation des künftigen Immunsystems liegt. Mithilfe von ESCs konnten unter Laborbedingungen geeignete Modelle genetischer Pathologien beim Menschen reproduziert werden: Der doppelte Knockout des Dystrophin-Gens modelliert die Duchenne-Muskeldystrophie bei Mäusen und die Abschaltung des atm-Gens (Kontrolle der Chromatin-Signalkinase-Synthese) – Ataxie Teleangiektasie. Bei dieser tödlichen Erbkrankheit bei Kindern entwickelt sich aufgrund von Defekten bei der DNA-Reparatur eine Degeneration der Purkinje-Zellen im Kleinhirn, die mit einer Involution des Thymus infolge des Todes proliferierender Zellen einhergeht. Das klinische Bild, die Pathophysiologie und die Pathomorphologie der Ataxie Teleangiektasie, die durch die Einführung pathologischer genetischer Informationen in ESCs reproduziert wurde, entsprechen bei Chimärenmäusen denen beim Menschen. Neben der Ataxie-Teleanektasie wurden mithilfe von ES-Zellen und Knockout-Mäusen experimentelle Modelle einiger erblicher homozygoter menschlicher Erkrankungen entwickelt, die mit einer Pathologie des Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsels, des Aminosäurekatabolismus sowie der Kupfer- und Bilirubinausscheidung verbunden sind, wodurch die Möglichkeiten der experimentellen Medizin im Stadium der präklinischen Erprobung neuer Methoden zur Behandlung der entsprechenden menschlichen Erkrankungen erheblich erweitert wurden.

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Einsatz von Stammzell-Zytohybriden

Durch die Fusion von embryonalen Stammzellen mit somatischen Zellen gewonnene Hybridzellen sind ein geeignetes und vielversprechendes Modell zur Untersuchung der Pluripotenz von Stammzellen und zur Neuprogrammierung der Chromosomen differenzierter Zellen. Durch die Fusion von embryonalen Stammzellen mit differenzierten Zellen eines erwachsenen Tieres gewonnene Zytohybride ermöglichen die Untersuchung der Beziehungen zwischen Genomen unterschiedlichen „Alters“: Eine einzigartige Situation entsteht, wenn homologe Chromosomen aus Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien und mit unterschiedlichem Reifegrad im selben Zellkern lokalisiert sind und dort problemlos trans-agierende regulatorische Signale austauschen können. Es ist schwer vorherzusagen, wie die während der individuellen Entwicklung gebildeten cisregulatorischen epigenetischen Systeme homologer Chromosomen auf den Einfluss trans-agierender Signale embryonaler Genome reagieren. Darüber hinaus kommt es in Hybridzellen zu einer Segregation der elterlichen Chromosomen, was es uns ermöglicht, die Interaktion der Genome auf der Ebene einzelner Chromosomen zu untersuchen, d. h. möglicherweise die Beteiligung bestimmter Chromosomen an der Aufrechterhaltung der Pluripotenz oder umgekehrt am Ausgang zur Differenzierung zu ermitteln.

Durch Fusion pluripotenter Teratokarzinomzellen und differenzierter somatischer Zellen gewonnene Zytohybride dienten als erstes experimentelles Modell zur Untersuchung der Interaktion von Genomen mit unterschiedlichen „Entwicklungsgeschichten“. In einigen Fällen behielten solche Hybridzellen ihre pluripotenten Eigenschaften auf einem relativ hohen Niveau. Insbesondere induzierten Teratokarzinom-somatische Hybridzellen in vivo die Entwicklung echter Teratome, die Derivate aller drei Keimblätter enthielten, und in vitro bildeten sie in Suspensionskulturen embryoide Körper. Sogar in interspezifischen Zytohybriden dieser Art wurde das Vorhandensein embryonaler Antigene in Fällen festgestellt, in denen die somatischen Partner bei der Fusion mit Teratokarzinomzellen Lymphozyten oder Thymozyten waren. Es ist bemerkenswert, dass die durch Fusion von Teratokarzinomzellen mit Fibroblasten entstandenen Zytohybriden im Phänotyp Fibroblasten entsprachen.

Die wichtigste gesicherte Erkenntnis ist, dass in Teratokarzinom-somatischen Hybridzellen Anzeichen einer Reprogrammierung des differenzierten Zellgenoms auftraten, die durch die Reaktivierung entweder einzelner Gene oder des inaktiven X-Chromosoms des somatischen Partners gekennzeichnet war. So deuten die Ergebnisse von Studien an Zytohybriden vom Teratokarzinom-somatischen Zelltyp darauf hin, dass die Pluripotenz in Hybridzellen häufig erhalten bleibt und Anzeichen einer Reprogrammierung des somatischen Partnergenoms vorliegen.

In Experimenten zur Gewinnung intraspezifischer embryonaler Hybridzellen durch Fusion von Maus-ESCs mit adulten Splenozyten wurden die Eigenschaften solcher Zytohybride untersucht, die Segregation der elterlichen Chromosomen analysiert und die Pluripotenz des Hybridgenoms beurteilt. Intraspezifische Hybridzellen, die durch Fusion von Teratokarzinomzellen mit somatischen Zellen gewonnen wurden, zeichnen sich üblicherweise durch eine geringe Chromosomensegregation mit einem tetraploiden oder nahezu tetraploiden Karyotyp aus. Eine ähnliche Chromosomenzusammensetzung wurde in Zytohybriden bei der Fusion von primären Keimzellen mit Lymphozyten beobachtet. Gleichzeitig zeigten interspezifische Hybridzellen, die durch Fusion von Maus-Teratokarzinomzellen mit Nerz-Lymphozyten gewonnen wurden, eine intensive Segregation der Chromosomen des somatischen Partners.

Eine qualitativ neue Etappe in der Erforschung der Segregation elterlicher Chromosomen in intraspezifischen Hybriden begann nach der Entwicklung einer Methode zur Analyse von Mikrosatelliten mittels der Polymerase-Kettenreaktion, dank der für jedes Mauschromosom mehrere hundert Marker gefunden wurden, die eine zuverlässige Unterscheidung beliebiger Paare homologer Chromosomen in Hybridzellen ermöglichten.

Durch Fusion von ESCs (HM-1-Zellen mit Mangel an Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase-Aktivität, 2n = 40, XY, isoliert aus Blastozysten von 129/01a-Mäusen) mit Splenozyten der kongenen DD/c-Mäuse war es möglich, einen Satz Hybridklone zu erhalten, die ESCs morphologisch ähnelten. Alle Klone wurden auf einem selektiven Medium isoliert, in dem nur Zellen mit aktiver Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase wachsen können. Die elektrophoretische Analyse zeigte, dass alle Klone eine für DD/c-Mäuse charakteristische allelische Variante der Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase aufwiesen. Die zytogenetische Analyse zeigte, dass drei der vier Hybridklone einen nahezu diploiden Chromosomensatz hatten. Ein nahezu tetraploider Klon enthielt zwei Populationen von Hybridzellen, von denen eine tetraploid und die zweite, kleinere, diploid war.

Eine Mikrosatellitenanalyse, die die Unterscheidung beliebiger Paare homologer Chromosomen der Mäuse 129/01a und DD/c ermöglicht, zeigte in Hybridklonen mit nahezu diploidem Chromosomensatz, dass in zwei Klonen eine klare bevorzugte Eliminierung der Autosomen des somatischen Partners stattfand. Die meisten Autosomen in den Klonen HESS2 und HESS3 wiesen Marker der Linie 129/01a auf, also des pluripotenten Partners. Die Ausnahme bildeten die Chromosomen 1 und I: in den Klonen HESS2 und HESS3 waren neben Markern der HM-1-Zellen auch Marker des somatischen Partners in geringen Mengen vorhanden. Solche Ergebnisse können auf eine unvollständige Segregation der Chromosomen 1 und I des somatischen Partners hinweisen und stehen im Einklang mit zytogenetischen Daten, denen zufolge bei 30 – 40 % der Zellen der Klone HESS2 und HESS3 eine Trisomie für diese Chromosomen beobachtet wird. Klon HESS4 unterschied sich signifikant in seiner Chromosomenzusammensetzung: Viele Autosomen dieses Klons stammten aus dem ESC-Genom (Chromosomen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 und 17), die Chromosomen 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 und 19 hingegen waren Homologe beider Eltern. Das quantitative Verhältnis der Mikrosatelliten, die diese homologen Chromosomen markierten, betrug etwa 1:1. Dies ließ die Autoren annehmen, dass ein Homolog aus dem ESC-Genom und das andere aus differenzierten Zellen stammte. In einigen Subklonen des Klons HESS4 waren nur Markierungen der Chromosomen 18 und 19 des somatischen Partners vorhanden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass in den Zellen des HESS4-Klons zusätzlich zur Segregation der Chromosomen des somatischen Partners die Eliminierung eines oder beider Homologe der oben aufgeführten Chromosomen des pluripotenten Genoms stattfand, d. h. es kam zu einer bilateralen Segregation der Chromosomen beider Elternteile – ein sehr ungewöhnliches Phänomen, da die Segregation der Chromosomen nur eines Elternteils charakteristisch für Zytohybride ist.

Außerdem enthielten nach der 20. Passage alle Klone der Hybridzellen nur Marker des X-Chromosoms des somatischen Partners, d. h., das X-Chromosom der ESC war in den Klonen durch das X-Chromosom des somatischen Partners ersetzt worden. Diese wichtige Tatsache wird durch In-situ-Hybridisierungsdaten unter Verwendung einer FITC-markierten Sonde, die spezifisch für das Maus-X-Chromosom ist, bestätigt: nur auf einem Chromosom wurde ein positives Signal festgestellt. Es ist zu beachten, dass in früheren Kultivierungsstadien (vor der 15. Passage) zytogenetischen Daten zufolge viele Zellen zwei X-Chromosomen enthielten. Daher ermöglicht die Verwendung selektiver Medien die Manipulation der Chromosomenzusammensetzung der Hybridzellen und die selektive Selektion von Klonen, die einzelne Chromosomen des somatischen Partners vor dem Hintergrund des ESC-Genoms tragen.

Da ein einzigartiges Merkmal des zytohybriden Genoms die Lokalisierung der elterlichen Genome in einem Zellkern ist, stellt sich natürlich die Frage nach der Erhaltung der pluripotenten Eigenschaften des embryonalen Genoms in ESC-somatischen Zellhybriden unter Bedingungen seines engen Kontakts mit dem Genom einer differenzierten Zelle. Morphologisch ähnelten die Zytohybride aus ESCs und somatischen Zellen der elterlichen ESC-Linie. Die Auswertung der Pluripotenz zeigte, dass alle Klone mit nahezu diploidem Chromosomensatz in Suspensionskulturen embryoide Körper bilden konnten, in denen Derivate von drei Keimblättern vorhanden waren.

Die meisten Hybridzellen enthielten das ECMA-7-Antigen, einen charakteristischen Marker für frühe Mausembryonen, und wiesen zudem eine hohe alkalische Phosphatase-Aktivität auf. Die überzeugendsten Daten zur hohen Pluripotenz der Hybridzellen wurden in Experimenten zur Gewinnung einer Reihe von Injektionschimären mit Hybridzellen des HESS2-Klons gewonnen. Die Analyse biochemischer Marker zeigte, dass die Nachkommen der Spenderhybridzellen in den meisten Geweben der Chimären vorhanden waren. Daher behalten Hybridzellen, die durch die Fusion von embryonalen Stammzellen und somatisch differenzierten Zellen gewonnen werden, eine hohe Pluripotenz, einschließlich der Fähigkeit zur Chimärenbildung nach Injektion in die Blastozystenhöhle.

Die Klone HESS2 und HESS4 unterschieden sich signifikant in der Zusammensetzung der elterlichen Chromosomen, wiesen aber ähnliche pluripotente Eigenschaften auf. Man könnte annehmen, dass sich Pluripotenz im Hybridgenom als dominantes Merkmal manifestiert, aber es ist möglich, dass nicht alle Chromosomen des embryonalen Genoms am Prozess der Aufrechterhaltung der Pluripotenz beteiligt sind. Trifft diese Annahme zu, ist zu erwarten, dass die Eliminierung einiger Chromosomen des pluripotenten Partners aus dem Genom der Hybridzellen nicht mit einer Veränderung ihres pluripotenten Status einhergeht. In diesem Fall würde die Analyse der Segregation elterlicher Chromosomen in embryonalen Hybridzellen es ermöglichen, der Identifizierung der Chromosomen, die für die Kontrolle der Pluripotenz embryonaler Zellen verantwortlich sind, näher zu kommen.

O. Serov et al. (2001) fanden unter 50 Nachkommen, die durch Kreuzung von Chimären mit normalen Mäusen mit dem Mausgenotyp 129/01a und dem X-Chromosom von DD-Mäusen gewonnen wurden, keine Nachkommen. Die Autoren glauben, dass dies auf eine Abnahme der Pluripotenz in Hybridzellen unter dem Einfluss des somatischen Genoms zurückzuführen ist. Eine alternative Erklärung könnte der negative Effekt der Trisomie auf einige Autosomen und ein Ungleichgewicht der Geschlechtschromosomen (XXY wurden in Zellen bis zur 15. Passage beobachtet) in Hybridzellen während der Meiose sein. Es ist bekannt, dass XXY-Zellen nicht in der Lage sind, eine Meiose zu durchlaufen und Gameten zu bilden. Trisomie kann auch eine Abnahme der proliferativen Aktivität von Hybridzellen verursachen, wodurch der Selektionsvorteil bei der Entwicklung von Chimären den Zellen des Empfängerembryos gehören könnte. Daraus folgt, dass es für eine angemessene Beurteilung des pluripotenten Potenzials von Hybridzellen notwendig ist, Hybridklone mit einem normalen diploiden Chromosomensatz zu erhalten.

In den Experimenten von O. Serov und Co-Autoren (2001) wurde erstmals die Möglichkeit der Reprogrammierung des X-Chromosoms einer somatischen Zelle im Genom von Hybridzellen nachgewiesen. Diese Schlussfolgerung der Autoren ergibt sich aus der Analyse der Expression des hprt-Gens (eines X-Chromosommarkers) in Chimären: Das Vorhandensein der allelischen Variante des hprt von DD/c-Mäusen wurde in allen analysierten chimären Geweben nachgewiesen. Es ist angebracht zu betonen, dass die Zytohybride nach der Einführung der Hybridzellen in die Blastozystenhöhle in einen nicht-selektiven Zustand verfallen und der Erhalt des X-Chromosoms im Genom der Hybridzellen bedeutet, dass es zu dessen obligatorischem Bestandteil geworden ist und das Genom es nicht vom Y-Chromosom des pluripotenten Partners unterscheidet.

Die Autoren fassen die Ergebnisse der Analyse der Interaktion somatischer und pluripotenter Genome in hybriden embryonalen Zellen zusammen und kommen zu dem Schluss, dass sich Pluripotenz in einigen Zytohybriden als dominantes Merkmal manifestiert. Das Hybridgenom ist in der Lage, einzelne Chromosomen differenzierter Zellen neu zu programmieren, was jedoch die Möglichkeit eines umgekehrten Effekts des somatischen Genoms auf die Pluripotenz des embryonalen Genoms nicht ausschließt. Bei der Kultivierung von Hybridzellen tritt die Induktion der Differenzierung deutlich häufiger auf als in der ursprünglichen Elternlinie der ESCs HM-1. Ein ähnlicher Effekt wird während der Bildung primärer Kolonien beobachtet: Viele primäre Kolonien embryonaler Hybridzellen differenzieren sich in frühen Stadien der Bildung, mit großen Klonverlusten während ihrer Selektion und Reproduktion.

Somit behalten Zytohybride, die durch die Fusion von embryonalen Stammzellen mit somatischen Zellen entstehen, trotz engen Kontakts mit dem Genom differenzierter Zellen die Pluripotenz als einzigartige Eigenschaft des embryonalen Genoms. Darüber hinaus ist in solchen Hybridzellen eine Reprogrammierung einzelner Chromosomen differenzierter Zellen möglich. Es bleibt unklar, inwieweit die pluripotenten Eigenschaften des embryonalen Genoms in Hybridzellen erhalten bleiben, insbesondere ihre Fähigkeit, an der Bildung der Keimbahn in Chimären teilzunehmen. Dies erfordert die Gewinnung embryonaler Hybridzellen mit einem normalen Karyotyp. In jedem Fall können pluripotente embryonale Hybridzellen zu einem echten genetischen Modell für die Identifizierung von Chromosomen werden, die an der Aufrechterhaltung oder Kontrolle der Pluripotenz beteiligt sind, da die bilaterale Segregation der elterlichen Chromosomen potenziell eine solche Möglichkeit bietet.

Nicht weniger interessant ist die Untersuchung des Phänomens, das O. Serov et al. (2001) als „chromosomales Gedächtnis“ definieren. Im Hybridgenom liegen homologe Chromosomen in zwei alternativen Konfigurationen vor: Homologe des somatischen Partners haben bereits eine Differenzierung durchlaufen, während dieser Prozess bei Homologen des pluripotenten Partners gerade erst beginnt. Der Erhalt hoher pluripotenter Eigenschaften durch Hybridzellen weist folglich darauf hin, dass die „pluripotente“ Konfiguration von ESC-Homologen im Hybridgenom trotz des Einflusses von Transaktionsfaktoren des somatischen Partners ausreichend stabil ist. Die oben beschriebenen Anzeichen einer Reprogrammierung homologer Chromosomen des differenzierten Genoms während der Entwicklung von Chimären schließen die Möglichkeit nicht aus, dass diese in den ersten Stadien der Bildung und Kultivierung von Zytohybriden in vitro ihren während der Differenzierung in vivo erworbenen Status beibehalten. Kürzlich erhaltene Daten zeigen, dass embryonale Hybridzellen bei der Übertragung in eine nicht-selektive Umgebung eine intensive Eliminierung der Chromosomen nur des somatischen Partners aufweisen, d. h. das Genom der Hybridzellen unterscheidet nach 10-15 Passagen in vitro problemlos zwischen Homologen. Daher stellen embryonale Hybridzellen ein vielversprechendes experimentelles Modell dar, um nicht nur eine so grundlegende Eigenschaft des embryonalen Genoms wie die Pluripotenz zu untersuchen, sondern auch deren Alternative – die embryonale Differenzierung.

Therapeutische Wirksamkeit der embryonalen Stammzelltransplantation

Bevor wir die therapeutische Wirksamkeit der Transplantation von embryonalen Stammzellen und deren Derivaten analysieren, fassen wir das obige Material zusammen. Die Fähigkeiten von embryonalen Stammzellen zur vollständigen Umsetzung der Embryogenese in vitro sind unzureichend, da Entwicklungsdefekte in diesem Fall auf das Fehlen mesenchymaler Stammzellen zurückzuführen sind, die im Körper autonom und unabhängig von embryonalen Stammzellen entstehen. Das genetische Potenzial von embryonalen Stammzellen ist geringer als das der Zygote, daher werden embryonale Stammzellen nicht direkt zum Klonen von Embryonen verwendet. Das einzigartige biologische Potenzial von embryonalen Stammzellen als einzige Zellen, in denen Entwicklungsprogramme vollständig und konsistent ablaufen, wird in Studien zur Genfunktion genutzt. Mithilfe von embryonalen Stammzellen werden die ersten Signalkombinationen entschlüsselt, die die Expression früher und später Gene aktivieren, die für die Entwicklung der drei Keimblätter kodieren. Der Erhalt der Pluripotenz des Genoms von embryonalen Stammzellen in vitro macht sie zu einem einzigartigen Instrument für die reparative Regeneration, das in der Lage ist, Zellverluste bei Organ- und Gewebeschäden automatisch auszugleichen. In einem idealen hypothetischen Szenario kann davon ausgegangen werden, dass „... bei der Transplantation von Spender-ESCs kompakt gepackte Programme in den Körper des Empfängers übertragen werden, die unter günstigen Bedingungen beim Aufbau von neuem Gewebe realisiert werden“7, das in der Lage ist, „... sowohl auf morphologischer als auch auf funktioneller Ebene effektiv in den Körper des Empfängers integriert zu werden.“

Nach der Entwicklung von Methoden zur Monodifferenzierung von ES-Zellen begann die In-vivo-Studie zur funktionellen Aktivität von in vitro aus einem spezialisierten Klon gewonnenen Zellen. Ein proliferierender ES-Zellenklon erzeugt Populationen migrierender Vorläuferzellen, die sich aktiv in Bereiche geschädigten Empfängergewebes integrieren können. Dies wird in der regenerativen und plastischen Medizin genutzt. Es wurde nachgewiesen, dass die Transplantation von DOPA-Neuronen in die Substantia nigra die klinischen Manifestationen bei experimentellem Hemiparkinsonismus reduziert. Regionale Transplantationen von Spender-Neuralstammzellen reduzieren den Grad motorischer Störungen, die durch Traumata oder Prellungen des Rückenmarks und des Gehirns verursacht werden. Auch bei demyelinisierenden Erkrankungen liegen erste positive Ergebnisse der Stammzelltransplantation vor. Das regenerative und plastische Potenzial von ES-Zellen eröffnet offenbar unbegrenzte Möglichkeiten für den Einsatz der Zelltransplantation in der praktischen Medizin. Bei der Transplantation in ektopische Zonen wandeln sich ES-Zellen jedoch unweigerlich in Tumore um. Teratome entstehen, wenn ES-Zellen subkutan in immundefiziente Mäuse injiziert werden. Bei der Transplantation von ESC-Suspensionen unter die Hodenkapsel syngener Mäuse bilden sich ebenfalls Teratome, die aus verschiedenen Geweben bestehen, deren Zellen aus allen drei Keimblättern stammen. In solchen Teratomen sind Prozesse reduzierter Organogenese äußerst selten.

Zahlreiche Studien berichten über die positiven Ergebnisse der Transplantation früher embryonaler Stammzellen (ESC) in Tiere mit experimenteller Pathologie. Die zelluläre Neurotransplantation mit ESC-Derivaten wird in Experimenten und ersten klinischen Studien weiterentwickelt, um Funktionsstörungen bei Hirn- und Rückenmarksverletzungen zu korrigieren sowie Syringomyelie und Multiple Sklerose zu behandeln (Repin, 2001). Mit der Entwicklung der In-vitro-Neurogenese aus ESCs werden anstelle von embryonalem Hirngewebe Methoden zur Transplantation von Neurosphärenderivaten entwickelt, die aus embryonalen Nervengewebekulturen gewonnen werden. Solche Transplantatsuspensionen sind deutlich homogener und enthalten definierte Vorläufer von Neuronen und Neuroglia.

Bei regelmäßiger Zugabe von Retinsäure in einer Dosis von 10 μg/ml zum Kulturmedium über 6 Wochen werden in der menschlichen Embryo-(Terato)-Karzinomlinie NTERA-2 mehr als 80 % postmitotischer Neuronen gebildet. Vollständige Homogenität der neuronalen Population wird durch Flusssortierung reifer, mit immunphänotypischen Markern markierter Neuronen erreicht, wodurch die Reste von Teratokarzinomen und unreifen Zellen entfernt werden können. Nach der Transplantation in verschiedene Regionen des Gehirns von Versuchstieren überleben solche Neuronen nicht nur, sondern integrieren sich auch in regionale neuronale Netzwerke. Bei Tieren mit experimentellen Modellen lokaler ZNS-Defekte reduziert die Neurotransplantation die klinischen Manifestationen menschlicher Pathologien wie die Folgen von traumatischen Hirnverletzungen, Schlaganfällen, demyelinisierenden Erkrankungen, erblichen Defekten in der Entwicklung des Kleinhirns sowie Erkrankungen der Lipid- und Polysaccharidablagerung.

Um Regenerationsprozesse bei degenerativen Erkrankungen des Zentralnervensystems zu optimieren, werden Technologien zur Gewinnung myelinproduzierender Oligodendrozyten aus embryonalen Stammzellen (ESCs) entwickelt. Die erste Phase umfasst traditionell die Proliferation von ESCs mit der Reproduktion der für die Transplantation benötigten Zellzahl. In der zweiten Phase erfolgt die gezielte Differenzierung der Zellen in eine Population myelinproduzierender Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die durch selektive Markerantigene kontrolliert wird.

Es eröffnen sich gewisse Perspektiven für die Nutzung von ESC-Derivaten zur Entwicklung von Methoden zur Korrektur von Immundefekten, die durch genetische Defekte in der Thymusreifung verursacht werden. In Studien an Knockout-Mäusen (rag 1) mit einem induzierten Gendefekt – einer Störung des Rekombinationsmechanismus der V(D)J-Loci von TCR-Genen, die zum Verlust der T-Lymphozytenfunktion führt – stellt die Transplantation früher ESC-Derivate in den Thymus von Tieren die Reifung normaler Populationen von Immunklonen wieder her, die für die zelluläre Immunität verantwortlich sind. Klinische Studien zur Transplantation in vitro präformierter ESCs zur Behandlung tödlicher erblicher Anämien bei Kindern laufen.

Einwände gegen die rasche Einführung der Stammzelltransplantation in die Klinik beruhen auf der begrenzten Anzahl stabiler Linien menschlicher embryonaler Stammzellen und der Notwendigkeit ihrer Standardisierung. Um die Reinheit standardisierter embryonaler Stammzellenlinien sowie adulter menschlicher Stammzellen zu erhöhen, wird eine Linienselektionsmethode basierend auf der molekulargenetischen Analyse kurzer Tandem-DNA-Wiederholungen vorgeschlagen. Darüber hinaus müssen embryonale Stammzellenlinien auf kleine Chromosomenumlagerungen und genetische Mutationen getestet werden, deren Auftreten unter Zellkulturbedingungen sehr wahrscheinlich ist. Es wird die These vertreten, dass die Eigenschaften aller Arten embryonaler Stammzellen und regionaler pluripotenter Stammzellen obligatorisch getestet werden müssen, da ihre Vermehrung in vitro zur Entstehung neuer Eigenschaften führen kann, die embryonalen Stammzellen oder definitiven Geweben nicht eigen sind. Insbesondere wird angenommen, dass die Langzeitkultivierung in Medien mit Zytokinen embryonale Stammzellenlinien Tumorzellen näher bringt, da sie ähnliche Veränderungen in den Bahnen der Zellzyklusregulation durchlaufen und die Fähigkeit zu unbegrenzten Zellteilungen erwerben. Einige Autoren halten die Transplantation früher embryonaler Stammzellderivate in den Menschen aufgrund des Tumorentwicklungspotenzials für leichtsinnig. Ihrer Meinung nach ist die Verwendung von determinierten Nachkommen embryonaler Stammzellen, d. h. von Linien differenzierter Zellvorläuferzellen, deutlich sicherer. Allerdings gibt es derzeit noch keine zuverlässige Methode zur Gewinnung stabiler menschlicher Zelllinien, die sich in die gewünschte Richtung differenzieren.

Somit erscheinen in der Literatur immer mehr Daten über den positiven therapeutischen Effekt der Transplantation von Derivaten menschlicher embryonaler Stammzellen. Viele dieser Studien werden jedoch überprüft und kritisiert. Einige Forscher glauben, dass die Ergebnisse früher klinischer Studien vorläufiger Natur sind und lediglich darauf hinweisen, dass Stammzellen den klinischen Verlauf einer bestimmten Krankheit günstig beeinflussen können. Daher ist es notwendig, Daten über die Langzeitergebnisse der Zelltransplantation zu erhalten. Als Argument werden die Entwicklungsstadien der klinischen Neurotransplantationsmedizin angeführt. Tatsächlich dominierten zunächst Veröffentlichungen über die hohe Effizienz der Transplantation embryonaler Gehirnfragmente bei der Parkinson-Krankheit in der Literatur, doch dann erschienen Berichte, die die therapeutische Effizienz von in das Gehirn von Patienten transplantiertem embryonalem oder fetalem Nervengewebe leugneten.

Die ersten klinischen Studien wurden durchgeführt, um die Sicherheit der Transplantation von Neuroblasten aus NTERA-2-Teratokarzinom-ESCs zu bewerten. Unreife Zellen dieser Zellen wurden in Kulturen bis zur Ansammlung von 100 Millionen Zellen proliferiert. Einige der so gewonnenen Zellen wurden zur Charakterisierung des Phänotyps und zur Bestimmung zellulärer Verunreinigungen sowie zur Prüfung auf mögliche Kontamination mit Viren und Bakterien verwendet. LIF und die Feeder-Schicht fetaler Stromazellen wurden aus dem Kulturmedium entfernt, und es wurden Bedingungen für die gezielte Differenzierung von ESCs in Neuroblasten mithilfe einer Kombination von Zytokinen und Wachstumsfaktoren geschaffen. Anschließend wurden die Neuroblasten auf einem Durchflusszellsortierer aus unreifen Teratokarzinomzellen isoliert. Nach sekundärer Reinigung und phänotypischer Charakterisierung der transplantierten Zellen wurde eine Suspension von Neuroblasten (10-12 Millionen) in den Basalkern des Gehirns der Patienten injiziert (im siebten Monat nach dem hämorrhagischen Schlaganfall) unter stereotaktischer und computertomographischer Kontrolle mit einer speziellen Mikrokanüle und Spritze. Ein einjähriges Screening der Folgen der Neuronentransplantation in den Schlaganfallbereich nach der Transplantation ergab keine Nebenwirkungen oder unerwünschten Wirkungen. Bei der Hälfte der Patienten verbesserte sich die motorische Funktion im Zeitraum von 6 bis 12 Monaten nach der Transplantation. Positive klinische Veränderungen gingen mit einer erhöhten Blutversorgung des Schlaganfallbereichs nach der Zelltransplantation einher: Die durchschnittliche Erhöhung der Absorption von fluoreszenzmarkierter 2-Desoxyglucose erreichte laut Positronen-Emissions-Tomographie 18 %, bei einigen Patienten sogar 35 %.

Die US-amerikanischen National Institutes of Health führten jedoch eine unabhängige Studie zur klinischen Wirksamkeit von Neurotransplantationen bei Patienten mit Parkinson durch. Patienten der ersten Gruppe wurden Abschnitte embryonalen Nervengewebes transplantiert, das Dopamin produziert, während die zweite Patientengruppe einer Scheinoperation unterzogen wurde. Die Ergebnisse deuten auf eine Null-Klinische Wirksamkeit einer solchen Neurotransplantation hin, obwohl die Dopamin produzierenden embryonalen Neuronen im Gehirn der Empfänger überlebten. Darüber hinaus entwickelten 15 % der Patienten zwei Jahre nach der Transplantation des embryonalen Nervengewebes anhaltende Dyskinesien, die bei Patienten der Placebogruppe nicht auftraten (Stammzellen: wissenschaftlicher Fortschritt und zukünftige Forschungsrichtungen. Nat. Inst. of Health, USA). Die weitere Entwicklung der Krankheit bei diesen Patienten wird derzeit beobachtet.

Einige Autoren führen die widersprüchlichen Literaturdaten zur Beurteilung der klinischen Wirksamkeit von Neurotransplantationen auf unterschiedliche Ansätze bei der Auswahl der Patientengruppen, eine unzureichende Auswahl von Methoden zur objektiven Beurteilung ihres Zustands und vor allem auf unterschiedliche Entwicklungsphasen des embryonalen Nervengewebes und unterschiedliche Hirnareale, aus denen dieses Gewebe gewonnen wurde, unterschiedliche Transplantatgrößen und methodische Besonderheiten des chirurgischen Eingriffs zurück.

Es ist zu beachten, dass Versuche der direkten Transplantation pluripotenter embryonaler Stammzellen in das Striatum des Gehirns von Ratten mit experimentellem Hemiparkinsonismus mit einer Proliferation von embryonalen Stammzellen und deren Differenzierung in dopaminerge Neuronen einhergingen. Es ist anzunehmen, dass neu gebildete Neuronen effektiv in neuronale Netzwerke integriert wurden, da nach der Transplantation von embryonalen Stammzellen eine Korrektur von Verhaltensanomalien und motorischer Asymmetrie im Apomorphintest beobachtet wurde. Gleichzeitig starben einige Tiere aufgrund der Transformation transplantierter embryonaler Stammzellen in Hirntumoren.

Experten der National und Medical Academies der USA sowie Spezialisten des National Institute of Health der USA sind der Ansicht, dass das klinische Potenzial von ESCs größte Aufmerksamkeit verdient, bestehen jedoch auf der Notwendigkeit einer detaillierten Untersuchung ihrer Eigenschaften, der Wahrscheinlichkeit von Komplikationen und der Langzeitfolgen in Experimenten an geeigneten biologischen Modellen menschlicher Krankheiten (Stammzellen und die zukünftige regenerative Medizin, National Academy Press; Stammzellen und die zukünftigen Forschungsrichtungen. Nat. Inst. of Health USA).

Aus dieser Sicht ist es wichtig, dass eine vergleichende histologische Analyse von experimentellen Teratomen, die durch Transplantation einer Suspension embryonaler Stammzellen in die Hoden gewonnen wurden, mit Teratomen, die durch Transplantation eines frühen Embryos entstanden sind, der ebenfalls embryonale Stammzellen enthält, gezeigt hat, dass embryonale Stammzellen ihr tumorbildendes Potenzial unabhängig von ihrer Herkunft oder ihrer Interaktion mit bestimmten umgebenden Zellen auf die gleiche Weise entfalten. Es wurde nachgewiesen, dass solche Teratome klonalen Ursprungs sind, da aus einer einzigen embryonalen Stammzelle Tumoren entstehen können, die aus Derivaten aller drei Keimblätter bestehen (Rega, 2001). Bemerkenswert ist, dass bei der Transplantation geklonter embryonaler Stammzellen mit normalem Karyotyp in immundefiziente Mäuse ebenfalls Teratome bildeten, die aus verschiedenen Arten differenzierter somatischer Zellen bestanden. Diese experimentellen Daten sind ein tadelloser Beweis für den klonalen Ursprung von Teratomen. Aus entwicklungsbiologischer Sicht deuten sie darauf hin, dass nicht mehrere determinierte Progenitorzellen, sondern eine einzige pluripotente Stammzelle als Quelle differenzierter Derivate aller drei Keimblätter fungiert, aus denen ein Teratom besteht. Auf dem Weg zur praktischen Zelltransplantation sind die Ergebnisse dieser Studien jedoch wenn nicht ein prohibitives, so doch ein Warnsignal für eine potenzielle Gefahr, da die Inokulation von ES-Zellen oder primordialen Keimzellen in verschiedene Gewebe erwachsener immundefizienter Mäuse unvermeidlich zur Entwicklung von Tumoren aus transplantierten Stammzellen führt. Die neoplastische Degeneration ektopisch transplantierter ES-Zellen geht mit der Entstehung von Satellitenpopulationen differenzierter Zellen einher – aufgrund der teilweisen Differenzierung von ES-Zellen und Progenitorklonen in spezialisierte Linien. Interessanterweise bilden sich bei der Transplantation von ES-Zellen in Skelettmuskeln am häufigsten Neuronen neben Teratokarzinomzellen. Die Einführung von embryonalen Stammzellen (ESCs) in eine sich teilende Eizelle oder Blastozyste geht jedoch mit einer vollständigen Integration der Zellen in den Embryo einher, ohne dass sich neoplastische Elemente bilden. In diesem Fall integrieren sich die ESCs in nahezu alle Organe und Gewebe des Embryos, einschließlich der Genitalanlage. Solche allophenen Tiere wurden erstmals durch die Einführung von Teratokarzinom-129-Zellen in frühe Embryonen im 8-100-Zellen-Stadium gewonnen. Bei allophenen Mäusen integrieren sich Populationen heterogener Zellen, die aus gespendeten ESCs stammen, in die Gewebe des Knochenmarks, des Darms, der Haut, der Leber und der Genitalien, wodurch im Experiment sogar Zellchimären zwischen verschiedenen Arten erzeugt werden können. Je kürzer die Entwicklungsphase des frühen Embryos, desto höher ist der Prozentsatz der Zellchimärisierung. Der höchste Chimärisierungsgrad wurde im hämatopoetischen System, der Haut, dem Nervensystem, der Leber und dem Dünndarm des allophenen Embryos beobachtet. Im erwachsenen Organismus sind Gewebe, die durch histohämatische Barrieren vor dem Immunsystem des Empfängers geschützt sind, anfällig für Chimärisierung:Die Transplantation primärer Keimzellen in das Hodenparenchym geht mit der Eingliederung von Spenderstammzellen in die Keimschicht des Empfängers einher. Bei der Transplantation von embryonalen Stammzellen in eine Blastozyste kommt es jedoch nicht zur Bildung chimärer Rudimente der Geschlechtsorgane unter Bildung primärer Spenderkeimzellen. Die Pluripotenz von embryonalen Stammzellen kann unter besonderen Bedingungen auch zum Klonen genutzt werden: Die Transplantation von Maus-eukaryotischen Stammzellen in einen 8- bis 16-zelligen Mausembryo, in dem die Zellmitosen durch Cytocalsin blockiert sind, fördert die normale Embryogenese mit der Entwicklung eines Embryos aus Spender-eukaryotischen Stammzellen.

Eine Alternative zur allogenen Transplantation embryonaler Stammzellen ist daher das therapeutische Klonen. Dabei werden somatische Zellkerne in eine entkernte Eizelle transplantiert, um eine Blastozyste zu erzeugen. Aus deren innerer Zellmasse werden anschließend Linien embryonaler Stammzellen isoliert, die mit dem Spender des somatischen Zellkerns genetisch identisch sind. Technisch ist dieses Konzept durchaus umsetzbar, da die Möglichkeit, aus Blastozysten, die nach der Transplantation somatischer Zellkerne in entkernte Eizellen gewonnen wurden, Linien embryonaler Stammzellen zu erzeugen, in Tierversuchen wiederholt nachgewiesen wurde (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Insbesondere wurden bei Mäusen, die homozygot für die rag2-Genmutation sind, durch Kultivierung subepidermaler Gewebezellen gewonnene Fibroblasten als Spender der Kerne verwendet, die in entkernte Eizellen transplantiert wurden. Nach der Aktivierung der Eizelle wurde die „Zygote“ bis zur Blastozystenbildung kultiviert. Aus deren innerer Zellmasse wurden embryonale Stammzellen isoliert und in eine für das mutierte Gen (rag2~/~) nullizygote Zelllinie übertragen. Die Mutation eines allelischen Gens wurde in solchen embryonalen Stammzellen mithilfe der Methode der homologen Rekombination korrigiert. In der ersten Versuchsreihe wurden embryoide Körper aus embryonalen Stammzellen mit einem rekombinanten wiederhergestellten Gen gewonnen, ihre Zellen mit einem rekombinanten Retrovirus (HoxB4i/GFP) transfiziert und nach der Reproduktion in die Vene von rag2~/~-Mäusen injiziert. In der zweiten Reihe wurden tetraploide Blastomeren mit genetisch veränderten embryonalen Stammzellen aggregiert und in weibliche Empfängerzellen transplantiert. Die entstandenen immunkompetenten Mäuse dienten als Knochenmarkspender für die Transplantation in rag2~/~-Mutantenmäuse. In beiden Serien war das Ergebnis positiv: Nach 3-4 Wochen wurden in allen Mäusen reife normale myeloide und lymphatische Zellen gefunden, die in der Lage waren, Immunglobuline zu produzieren. Somit kann die Transplantation somatischer Zellkerne in Eizellen nicht nur zur Gewinnung von ESC-Linien, sondern auch für die Zytogentherapie – die Korrektur erblicher Anomalien – genutzt werden, wobei ESC als Vektor für den Transport korrigierender genetischer Informationen verwendet werden. Diese Art der Zelltransplantation hat jedoch neben bioethischen Problemen auch ihre Grenzen. Es ist unklar, wie sicher die Transplantation therapeutisch geklonter Zellen mit einem Genotyp, der mit dem Genotyp eines bestimmten Patienten identisch ist, sein wird, da solche Zellen Mutationen einführen können, die eine Prädisposition für andere Krankheiten schaffen. Normale menschliche Eizellen bleiben ein schwer zugängliches Objekt, während sich selbst bei der Transplantation somatischer Zellkerne in entkernte tierische Eizellen nur 15-25 % der konstruierten „Zygoten“ bis zum Blastozystenstadium entwickeln. Es ist noch nicht geklärt, wie viele Blastozysten zur Gewinnung einer Linie pluripotenter geklonter embryonaler Stammzellen erforderlich sind. Bemerkenswert ist auch der hohe finanzielle Aufwand, der mit der Komplexität der therapeutischen Klonmethode verbunden ist.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass bei embryonalen Stammzellen (ESCs) die Pluripotenz des Genoms mit hypomethylierter DNA mit einer hohen Telomeraseaktivität und einer kurzen C^-Phase des Zellzyklus einhergeht, was ihre intensive und potenziell unbegrenzte Vermehrung gewährleistet, während der die ESCs einen diploiden Chromosomensatz und einen „juvenilen“ Satz phänotypischer Merkmale behalten. Das klonale Wachstum von ESCs in Kultur stört ihre Differenzierung in spezialisierte Zelllinien des Organismus nicht, wenn die Proliferation gestoppt und geeignete regulatorische Signale hinzugefügt werden. Die Restriktionsdifferenzierung von ESCs in somatische Zelllinien in vitro erfolgt ohne Beteiligung des Mesenchyms, unter Umgehung der Nochteys, außerhalb der Organogenese und ohne Embryobildung. Die ektopische Einführung von ESCs in vivo führt unvermeidlich zur Bildung von Teratokarzinomen. Die Transplantation von ESCs in eine Blastozyste oder einen frühen Embryo geht mit ihrer Integration in das embryonale Gewebe und einer stabilen Chimärisierung seiner Organe einher.

Regenerative und plastische Technologien auf Basis der Zelltransplantation bilden die Schnittstelle der Interessen von Vertretern der Zellbiologie, Entwicklungsbiologie, experimentellen Genetik, Immunologie, Neurologie, Kardiologie, Hämatologie und vieler weiterer Zweige der experimentellen und praktischen Medizin. Die wichtigsten Ergebnisse experimenteller Studien belegen die Möglichkeit der Reprogrammierung von Stammzellen durch gezielte Veränderung ihrer Eigenschaften, was Perspektiven für die Steuerung der Zytodifferenzierungsprozesse mittels Wachstumsfaktoren eröffnet – zur Myokardregeneration, zur Wiederherstellung von ZNS-Läsionen und zur Normalisierung der Funktion des Inselapparats der Bauchspeicheldrüse. Für die flächendeckende Einführung der Transplantation von ESC-Derivaten in die praktische Medizin ist es jedoch notwendig, die Eigenschaften menschlicher Stammzellen genauer zu untersuchen und die Experimente mit ESCs an experimentellen Krankheitsmodellen fortzusetzen.

Bioethische Fragen und das Problem der Abstoßung eines allogenen Zelltransplantats könnten durch die entdeckte Plastizität des Genoms regionaler Stammzellen eines erwachsenen Organismus gelöst werden. Die ursprünglichen Informationen, dass bei der Transplantation isolierter und sorgfältig charakterisierter hämatopoetischer autologer Zellen in die Leber neue Hepatozyten entstehen, die sich in die Leberläppchen integrieren, werden derzeit jedoch revidiert und kritisiert. Dennoch wurden Daten veröffentlicht, dass die Transplantation neuraler Stammzellen in den Thymus die Bildung neuer T- und B-Lymphozytensprossen des Spenders verursacht und die Transplantation neuraler Stammzellen des Gehirns in das Knochenmark zur Bildung hämatopoetischer Sprossen mit langfristiger Myelo- und Erythropoese des Spenders führt. Folglich können pluripotente Stammzellen, die das Genom zu dem Potenzial von ESCs umprogrammieren können, in den Organen eines erwachsenen Organismus persistieren.

Die Quelle der Gewinnung von ESC für medizinische Zwecke bleibt der menschliche Embryo, der die Unvermeidlichkeit einer neuen Schnittstelle moralischer, ethischer, rechtlicher und religiöser Fragen am Ursprungsort menschlichen Lebens vorgibt. Die Entdeckung von ESC hat der Wiederaufnahme harter Diskussionen über die Grenze zwischen lebenden Zellen und Materie, zwischen Sein und Persönlichkeit einen starken Impuls gegeben. Gleichzeitig gibt es trotz wiederholter Versuche, diese zu schaffen und zu übernehmen, keine universellen Normen, Regeln und Gesetze für die Verwendung von ESC in der Medizin. Jeder Staat löst dieses Problem im Rahmen seiner Gesetzgebung unabhängig. Ärzte weltweit versuchen ihrerseits weiterhin, die regenerative plastische Medizin über den Rahmen solcher Diskussionen hinauszuführen, vor allem durch die Verwendung adulter Stammzellreserven anstelle embryonaler Stammzellen.

Ein wenig Geschichte der Isolierung embryonaler Stammzellen

Terato(embryo)karzinomzellen wurden aus spontan auftretenden Hodenteratomen von 129/ter-Sv-Mäusen, spontanen Ovarialteratomen von Lt/Sv-Mäusen sowie aus Teratomen aus ektopisch transplantierten embryonalen Zellen oder Geweben isoliert. Unter den so gewonnenen stabilen Maus-Terato(embryo)karzinomzelllinien waren einige pluripotent, andere differenzierten sich nur in einen spezifischen Zelltyp, und einige waren zur Zytodifferenzierung völlig unfähig.

Zu einem Zeitpunkt lag der Schwerpunkt auf Studien, deren Ergebnisse auf die Möglichkeit hindeuteten, Terato-(Embryo-)Karzinomzellen nach ihrer Einführung in das Gewebe eines sich entwickelnden Embryos wieder in einen normalen Phänotyp zu versetzen, sowie auf Arbeiten zur In-vitro-Erzeugung genetisch veränderter Terato-(Embryo-)Karzinomzellen, mit deren Hilfe mutierte Mäuse für die biologische Modellierung menschlicher Erbkrankheiten gewonnen wurden.

Zur Isolierung von Terato-(Embryo-)Karzinomzelllinien wurde eine konditionierte Suspensionskultivierung verwendet. In der Kultur wachsen Terato-(Embryo-)Karzinomzellen, wie embryonale Stammzellen, zu embryoiden Körpern heran und erfordern für den Zelltransfer eine zwingende Dissoziation, wobei die Pluripotenz auf einer Feederschicht aus embryonalen Fibroblasten oder während der Suspensionskultivierung in einem konditionierten Medium erhalten bleibt. Zellen pluripotenter Terato-(Embryo-)Karzinomlinien sind groß, kugelförmig, zeichnen sich durch eine hohe alkalische Phosphataseaktivität aus, bilden Aggregate und sind zur multidirektionalen Differenzierung fähig. Beim Einbringen in eine Blastozyste aggregieren sie mit der Morula, was zur Bildung chimärer Embryonen führt, in deren Zusammensetzung verschiedener Organe und Gewebe Derivate von Terato-(Embryo-)Karzinomzellen vorkommen. Die überwiegende Mehrheit solcher chimären Embryonen stirbt jedoch in der Gebärmutter, und in den Organen überlebender neugeborener Chimären werden Fremdzellen selten und in geringer Dichte nachgewiesen. Gleichzeitig nimmt die Inzidenz von Tumoren (Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, andere Arten von bösartigen Tumoren und Pankreasadenom) stark zu, und während der intrauterinen Entwicklung chimärer Embryonen tritt häufig eine Tumordegeneration auf.

Die meisten Terato-(Embryo)-Karzinomzellen im Mikroumfeld normaler Embryonalzellen erwerben fast auf natürliche Weise maligne neoplastische Eigenschaften. Man geht davon aus, dass die irreversible Malignität auf die Aktivierung von Proto-Onkogenen im Prozess struktureller Umlagerungen zurückzuführen ist. Eine Ausnahme bilden Zellen der Embryokarzinomlinie SST3, die aus testikulären Teratomen von Mäusen (Linie 129/Sv-ter) gewonnen wurden und eine hohe Fähigkeit zur Integration in die Gewebe und Organe des Embryos ohne anschließende Tumorbildung in chimären Mäusen aufweisen. Derivate von Terato-(Embryo)-Karzinomzelllinien in chimären Mäusen sind praktisch nicht an der Bildung primärer Gonozyten beteiligt. Dies liegt offenbar an der hohen Häufigkeit von Chromosomenaberrationen, die für die meisten Terato-(Embryo)-Karzinomlinien charakteristisch sind, in deren Zellen sowohl Aneuploidie als auch Chromosomenanomalien beobachtet werden.

Unter Laborbedingungen wurden mehrere stabile Linien menschlicher Terato-(Embryo)-Karzinomzellen gewonnen, die sich durch Pluripotenz, hohe proliferative Aktivität und die Fähigkeit zur Differenzierung während des Wachstums in Kulturen auszeichnen. Insbesondere wurde die Linie menschlicher Terato-(Embryo)-Karzinomzellen NTERA-2 verwendet, um die Mechanismen der neuronalen Zytodifferenzierung zu untersuchen. Nach der Transplantation von Zellen dieser Linie in die subventrikuläre Region des Vorderhirns neugeborener Ratten konnten ihre Migration und Neurogenese beobachtet werden. Es wurden sogar Versuche unternommen, Schlaganfallpatienten Neuronen zu transplantieren, die durch Kultivierung von Zellen der Terato-(Embryo)-Karzinomlinie NTERA-2 gewonnen wurden, was den Autoren zufolge zu einer Verbesserung des klinischen Krankheitsverlaufs führte. Gleichzeitig wurden bei Schlaganfallpatienten keine Fälle von Malignität der transplantierten Zellen der Terato-(Embryo)-Karzinomlinie NTERA-2 festgestellt.

Die ersten Linien undifferenzierter pluripotenter embryonaler Stammzellen von Mäusen wurden Anfang der 1980er Jahre von Evans und Martin gewonnen, die sie aus der inneren Zellmasse der Blastozyste – dem Embryoblasten – isolierten. Die isolierten ESC-Linien behielten ihre Pluripotenz und die Fähigkeit, sich unter dem Einfluss von Faktoren in einem speziellen Kulturmedium über lange Zeit in verschiedene Zelltypen zu differenzieren.

Der Begriff „embryonale pluripotente Stammzelle“ selbst geht auf Leroy Stevens zurück, der bei Untersuchungen zum Einfluss von Tabakteer auf die Häufigkeit der Tumorentwicklung auf das spontane Auftreten von Hodenteratokarzinomen bei linearen (129/v) Mäusen der Kontrollgruppe aufmerksam machte. Die Zellen der Hodenteratokarzinome wiesen eine hohe Proliferationsrate auf und differenzierten sich in Gegenwart von Flüssigkeit aus der Bauchhöhle spontan unter Bildung von Neuronen, Keratinozyten, Chondrozyten, Kardiomyozyten sowie Haar- und Knochenfragmenten, jedoch ohne Anzeichen einer geordneten Zytoarchitektur des entsprechenden Gewebes. In Kultur wuchsen die Teratokarzinomzellen als pluripotente Klone, die nicht an das Substrat gebunden waren, und bildeten embryoide Körper. Danach stellten sie die Teilung ein und durchliefen eine spontane, ungeordnete Differenzierung in Neuronen, Gliazellen, Muskelzellen und Kardiomyozyten. Stevens fand heraus, dass das Mausteratokarzinom 129/v weniger als 1 % Zellen enthält, die sich in verschiedene spezialisierte somatische Linien differenzieren können, und dass die Differenzierung selbst von den Faktoren abhängt, die sie beeinflussen (Zusammensetzung der Peritonealflüssigkeit, Produkte reifer Zellen oder der Kultur hinzugefügte Gewebe). Leroy Stevensons Hypothese über das Vorhandensein embryonaler Vorläuferzellen der Keimbahn unter den Teratokarzinomzellen wurde bestätigt: Eine Suspension von Embryoblastenzellen aus Präimplantationsembryonen im Gewebe erwachsener Mäuse bildete Teratokarzinome, und daraus isolierte reine Zelllinien differenzierten sich nach intraperitonealer Verabreichung an Empfängertiere in Neuronen, Kardiomyozyten und andere somatische Zellen aus allen drei Keimblättern. In In-vivo-Experimenten führte die Transplantation von embryonalen Stammzellen (ESCs) (aus dem Embryoblasten, nicht aber aus dem Trophoblasten) in Mausembryonen einer anderen Linie im Blastomerenstadium 8–32 zur Geburt chimärer Tiere (ohne Tumorentwicklung), in deren Organen sich Sprossen von Spendergewebe fanden. Chimäre wurde sogar in der Keimzelllinie beobachtet.

Aus dem Genitalrudiment eines Mausembryos isolierte primäre Progenitor-Keimzellen entsprachen in Morphologie, immunologischem Phänotyp und funktionellen Eigenschaften den von Stevenson aus Teratokarzinomen und Embryoblasten gewonnenen embryonalen Stammzellen. Bei Chimären, die nach Einbringen von embryonalen Stammzellen in eine Blastozyste entstanden, war die allophene Morphogenese der Organe durch einen mosaikartigen Wechsel von strukturellen und funktionellen Einheiten von Spender und Empfänger der Leber, Lunge und Niere gekennzeichnet. In einigen Fällen wurde die Bildung von Darmkrypten oder Leberläppchen beobachtet, die sowohl aus Empfänger- als auch aus Spenderzellen bestanden. Die Morphogenese verlief jedoch immer entsprechend dem genetischen Programm der Spezies, zu der der Empfänger gehörte, und die Chimäre beschränkte sich ausschließlich auf die Zellebene.

Damals wurde festgestellt, dass die Proliferation embryonaler Stammzellen ohne Zytodifferenzierung auf einer Nährschicht mesenchymaler Zellen (fetaler Fibroblasten) bei obligatorischer Anwesenheit von LIF in selektiven Nährmedien erfolgt, die gezielt nur das Überleben von Stamm- und Progenitorzellen sicherstellen, während die überwiegende Mehrheit spezialisierter Zellelemente abstirbt. Unter Verwendung solcher Methoden isolierte James Thomson 1998 fünf immortalisierte Linien embryonaler Stammzellen aus der inneren Zellmasse einer menschlichen Blastozyste. Im selben Jahr entwickelte John Gerhart eine Methode zur Isolierung unsterblicher Linien embryonaler Stammzellen aus dem Tuberculum genitalis vier bis fünf Wochen alter menschlicher Embryonen. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften begann man bereits zwei Jahre später, embryonale Stammzellen und Stammzellen definitiven Gewebes in der regenerativen Medizin und Gentherapie einzusetzen.