Mesenchymale Stammzellen

Unter den regionalen Stammzellen nehmen mesenchymale Stammzellen (MSCs) eine besondere Stellung ein, deren Derivate die Stromamatrix aller Organe und Gewebe des menschlichen Körpers bilden. Die Priorität der MSC-Forschung liegt bei Vertretern der russischen Biowissenschaften.

Mitte des letzten Jahrhunderts wurde im Labor von A. Friedenstein erstmals eine homogene Kultur multipotenter stromaler Stammzellen des Knochenmarks isoliert. An das Substrat gebundene mesenchymale Stammzellen behielten über lange Zeit eine hohe Proliferationsintensität bei und bildeten in Kulturen mit geringer Keimdichte nach der Fixierung auf dem Substrat Klone fibroblastenähnlicher Zellen ohne phagozytische Aktivität. Das Aufhören der MSC-Proliferation endete mit ihrer spontanen Differenzierung in vitro in Knochen-, Fett-, Knorpel-, Muskel- oder Bindegewebezellen. Weitere Studien ermöglichten die Feststellung des osteogenen Potenzials fibroblastenähnlicher Zellen des Knochenmarkstromas verschiedener Säugetierarten sowie ihrer koloniebildenden Aktivität. In-vivo-Experimente haben gezeigt, dass sowohl die hetero- als auch die orthotope Transplantation koloniebildender fibroblastenähnlicher Zellen zur Bildung von Knochen-, Knorpel-, Binde- und Fettgewebe führt. Da sich stromale Stammzellen des Knochenmarks durch eine hohe Fähigkeit zur Selbsterneuerung und vielschichtigen Differenzierung innerhalb einer einzigen Zelllinie auszeichnen, werden sie als multipotente mesenchymale Vorläuferzellen bezeichnet.

Es ist anzumerken, dass im Laufe von 45 Jahren Grundlagenforschung zu mesenchymalen Stammzellen reale Voraussetzungen für die Verwendung ihrer Derivate in der klinischen Praxis geschaffen wurden.

Heute besteht kein Zweifel daran, dass alle Gewebe des menschlichen Körpers durch Proliferation, Migration, Differenzierung und Reifung aus Stammzellen verschiedener Zelllinien gebildet werden. Bis vor kurzem glaubte man jedoch, dass Stammzellen im adulten Organismus gewebespezifisch seien, d. h. nur in den Geweben, in denen sie lokalisiert sind, spezialisierte Zelllinien produzieren könnten. Diese Annahme wurde durch die Tatsache widerlegt, dass sich hämatopoetische Stammzellen nicht nur in zelluläre Elemente des peripheren Blutes, sondern auch in ovale Leberzellen verwandeln. Darüber hinaus erwiesen sich neuronale Stammzellen als in der Lage, sowohl Neuronen und Gliazellen als auch frühe, festgelegte Linien hämatopoetischer Vorläuferzellen hervorzubringen. Mesenchymale Stammzellen, die üblicherweise zelluläre Elemente von Knochen, Knorpel und Fettgewebe produzieren, können sich wiederum in neuronale Stammzellen verwandeln. Es wird angenommen, dass im Verlauf von Wachstum, physiologischer und reparativer Geweberegeneration ungebundene Vorläuferzellen aus gewebeunspezifischen Stammreserven entstehen. Beispielsweise kann die Reparatur von Muskelgewebe durch die Migration mesenchymaler Stammzellen vom Knochenmark in die Skelettmuskulatur erfolgen.

Obwohl diese Austauschbarkeit von Stammzellen nicht von allen Forschern anerkannt wird, ist die Möglichkeit der klinischen Nutzung mesenchymaler Stammzellen als Quelle für Zelltransplantationen und als zellulärer Vektor genetischer Informationen unbestritten, ebenso wie die Multipotenz stromaler Knochenmarkstammzellen, die sich relativ einfach isolieren und in vitro vermehren lassen. Gleichzeitig erscheinen in der wissenschaftlichen Literatur immer wieder Berichte über die potenzielle Pluripotenz stromaler Knochenmarkstammzellen. Als Beleg werden Forschungsprotokolle angeführt, in denen MSCs unter dem Einfluss spezifischer Transdifferenzierungsinduktoren in Nervenzellen, Kardiomyozyten und Hepatozyten transformiert werden. Einige Wissenschaftler hegen jedoch ernsthafte Zweifel an der Möglichkeit einer wiederholten Aktivierung und Expression von Genen aus der frühen Embryogenese. Gleichzeitig ist allgemein bekannt, dass viele ethische, moralische, religiöse und rechtliche Probleme der regenerativen plastischen Medizin automatisch gelöst werden, wenn die Voraussetzungen für die Erweiterung der Multipotenz mesenchymaler Stammzellen zur Pluripotenz von ESZ geschaffen werden. Da in diesem Fall die autologen Stromazellen des Patienten als Quelle des regenerativen Stammpotenzials dienen, ist auch das Problem der Immunabstoßung des Zelltransplantats gelöst. Die nahe Zukunft wird zeigen, wie realistisch diese Aussichten sind.

[ 1 ], [ 2 ]

Einsatz mesenchymaler Stammzellen in der Medizin

In der Klinik wird der Einsatz mesenchymaler Stammzellderivate vor allem mit der Wiederherstellung von Gewebedefekten in Verbindung gebracht, die bei ausgedehnten und tiefen thermischen Hautläsionen auftreten. In der präklinischen Phase wurde die Machbarkeit des Einsatzes allogener fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen zur Behandlung tiefer Verbrennungen experimentell untersucht. Es zeigte sich, dass fibroblastenähnliche mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark in Kultur eine Monoschicht bilden, die eine Transplantation zur Optimierung der Regenerationsprozesse tiefer Verbrennungswunden ermöglicht. Die Autoren weisen darauf hin, dass embryonale Fibroblasten ähnliche Eigenschaften aufweisen, ihre klinische Anwendung jedoch durch bestehende ethische und rechtliche Probleme eingeschränkt ist. Eine tiefe thermische Verbrennung mit Schädigung aller Hautschichten wurde an Wistar-Ratten modelliert. Die Verbrennungsfläche betrug 18–20 % der gesamten Hautoberfläche. Die erste Versuchsgruppe umfasste Ratten mit einer tiefen thermischen Verbrennung und Transplantation allogener fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen. Die zweite Gruppe bestand aus Tieren mit einer tiefen thermischen Verbrennung und Transplantation allogener embryonaler Fibroblasten. Die dritte Gruppe bestand aus Kontrollratten mit einer tiefen thermischen Verbrennung, die keiner Zelltherapie unterzogen wurden. Eine Suspension aus fibroblastenähnlichen mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten wurde mit einer Pipette in einer Menge von 2 x 10 ^{4 auf die Oberfläche der Brandwunde aufgetragen.}Zellen am 2. Tag nach der Verbrennungsmodellierung und Exzision der entstandenen nekrotischen Kruste. Nach der Zelltransplantation wurde die Verbrennungsoberfläche mit einer mit isotonischer Natriumchloridlösung mit Gentamicin angefeuchteten Mullserviette abgedeckt. Knochenmarkszellen wurden entnommen, um MSCs zu erhalten, mit deren Induktion in eine Linie fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen aus Femurknochen erwachsener Wistar-Ratten. Embryonale Fibroblasten wurden aus den Lungen 14–17 Tage alter Embryonen gewonnen. Embryonale Fibroblasten und Knochenmarkszellen zur Gewinnung von MSCs wurden vorab in Petrischalen bei einer Temperatur von 37 °C in einem CO2-Inkubator in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Embryonale Fibroblasten wurden 4–6 Tage kultiviert, während die Bildung einer Monoschicht aus MSCs 14 bis 17 Tage dauerte. Anschließend wurden MSCs als Ausgangsmaterial für fibroblastenähnliche mesenchymale Stammzellen kryokonserviert, die durch Auftauen und Kultivieren von MSCs für 4 Tage gewonnen wurden. Die Zahl der gebildeten fibroblastenähnlichen mesenchymalen Stammzellen war mehr als dreimal höher als die Zahl der während des gleichen Kultivierungszeitraums gebildeten embryonalen Fibroblasten. Um die transplantierten Zellen in Brandwunden im Kultivierungsstadium zu identifizieren, wurde ihr Genom mit einem viralen Shuttle-Vektor markiert, der auf rekombinantem Adenovirus Typ V basiert, das das 1ac-2-Gen trägt, das für E. coli-ß-Galaktosidase kodiert. Lebende Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation wurden immunhistochemisch in Kryoschnitten unter Zugabe von X-Gal-Substrat nachgewiesen, das eine charakteristische blaugrüne Färbung ergibt. Als Ergebnis der dynamischen visuellen, planimetrischen und histologischen Beurteilung des Zustands der Brandwunde wurde festgestellt, dass bereits am 3. Tag nach der Zelltransplantation signifikante Unterschiede im Verlauf des Wundprozesses in den ausgewählten Gruppen auftreten. Dieser Unterschied wurde am 7. Tag nach der Zelltransplantation besonders deutlich. Bei den Tieren der ersten Gruppe, denen fibroblastenähnliche mesenchymale Stammzellen transplantiert wurden, nahm die Wunde eine gleichmäßig intensive rosa Farbe an, Granulationsgewebe wuchs über die gesamte Fläche bis auf die Höhe der Epidermis und die Größe der Verbrennungsoberfläche verringerte sich erheblich. Der auf der Wundoberfläche gebildete Kollagenfilm wurde etwas dünner, bedeckte jedoch weiterhin die gesamte Verbrennungsfläche. Bei den Tieren der zweiten Gruppe, denen embryonale Fibroblasten transplantiert wurden, stieg das Granulationsgewebe bis auf die Höhe der Epidermis der Wundränder, jedoch nur stellenweise, während die Plasmorrhoe aus der Wunde intensiver war als in der 1. Gruppe und der ursprünglich gebildete Kollagenfilm praktisch verschwand. Bei den Tieren, die keine Zelltherapie erhalten hatten, war die Verbrennungswunde am 7. Tag blasses, narbiges, nekrotisches Gewebe, das mit Fibrin bedeckt war. Plasmorea wurde auf der gesamten Brandfläche festgestellt. Histologisch zeigten die Tiere der 1. und 2. Gruppe eine Abnahme der zellulären Infiltration und Entwicklung des Gefäßnetzes.und diese Anzeichen des beginnenden Regenerationsprozesses waren bei den Ratten der 1. Gruppe stärker ausgeprägt. In der Kontrollgruppe wurden Anzeichen einer Zellinfiltration der Wunde beobachtet, das histologische Muster neu gebildeter Gefäße fehlte. Am 15.-30. Beobachtungstag war die Fläche der Verbrennungsoberfläche bei den Tieren der 1. Gruppe deutlich kleiner als bei den Ratten der anderen Gruppen, und die granulierende Oberfläche war stärker entwickelt. Bei den Tieren der 2. Gruppe hatte sich die Fläche der Verbrennungsoberfläche im Vergleich zur Größe der Brandwunden bei den Ratten der Kontrollgruppe ebenfalls verringert, was auf eine marginale Epithelisierung zurückzuführen war. In der Kontrollgruppe blieb die Verbrennungsoberfläche stellenweise blass mit vereinzelten Granulationen, es erschienen Gefäßsternchen, es gab Inseln aus fibrinösen Plaques, eine mäßige Plasmorrhoe hielt über die gesamte Verbrennungsoberfläche an und an einigen Stellen blieb eine schwer abzulösende Kruste zurück. Generell nahm bei Tieren der 3. Gruppe auch die Wundgröße ab, die Wundränder blieben jedoch unterminiert.

So wurde bei einer vergleichenden Studie zur Wundheilungsrate mit fibroblastenähnlichen mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten sowie ohne Zelltherapie eine Beschleunigung der Heilungsrate der Verbrennungsoberfläche infolge der Transplantation von fibroblastenähnlichen mesenchymalen Stammzellen und embryonalen Fibroblasten festgestellt. Bei der Verwendung allogener fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen war die Wundheilungsrate jedoch höher als bei der Transplantation embryonaler Fibroblasten. Dies äußerte sich in einer Beschleunigung des Phasenwechsels im Regenerationsprozess – die Bedingungen der Zellinfiltration wurden verkürzt, die Wachstumsrate des Gefäßnetzwerks sowie die Bildung von Granulationsgewebe nahmen zu.

Die Ergebnisse der dynamischen Planimetrie zeigen, dass die Rate der spontanen Heilung der Brandwunde (ohne den Einsatz einer Zelltherapie) am niedrigsten war. Am 15. und 30. Tag nach der Transplantation allogener fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen war die Wundheilungsrate höher als bei der Transplantation embryonaler Fibroblasten. Histochemische Methoden zum Nachweis von Beta-Galaktosidase zeigten, dass nach der Transplantation fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen und embryonaler Fibroblasten die transplantierten Zellen während des gesamten Beobachtungszeitraums an der Oberfläche und in der Tiefe der regenerierenden Wunden lebensfähig blieben. Die Autoren glauben, dass die höhere Rate der Regeneration der Brandwunde bei Verwendung fibroblastenähnlicher mesenchymaler Stammzellen auf die Freisetzung biologisch aktiver wachstumsstimulierender Faktoren durch diese Zellen während des Reifungsprozesses zurückzuführen ist.

Die Transplantation von auto- oder allogenen Keratinozyten und allogenen Fibroblasten zur Behandlung von Brandwunden wird auch in der klinischen Praxis eingesetzt. Es ist zu beachten, dass die chirurgische Behandlung von Kindern mit ausgedehnten, tiefen Verbrennungen aufgrund des hohen Traumas und der zahlreichen chirurgischen Eingriffe, des erheblichen Blutverlusts und der unterschiedlichen Reaktionen auf die verwendeten Infusionsmedien eine komplexe Aufgabe darstellt. Die Hauptschwierigkeiten bei der Durchführung plastisch-chirurgischer Eingriffe an der Haut bei ausgedehnten, tiefen Verbrennungen, die mehr als 40 % der Körperoberfläche betreffen, liegen im Schweregrad des Zustands der Betroffenen und dem Mangel an Spenderhaut. Die Verwendung von Netztransplantaten mit hohem Perforationskoeffizienten löst das Problem nicht, da die nach der Perforation gebildeten Zellen sehr langsam epithelisieren und die Hautlappen selbst oft lysieren oder austrocknen. Abdeckungen von Brandwunden wie Xenoskin, Leichenallografts und synthetische Folienabdeckungen sind nicht immer wirksam genug. Daher werden neue Methoden zur Abdeckung von Brandoberflächen mit Schichten aus kultivierten Keratinozyten und Fibroblasten entwickelt. Insbesondere wurde ein Verfahren zum Bedecken von Verbrennungsoberflächen mit Hilfe kultivierter Allofibroblasten vorgeschlagen, die, wenn sie transplantiert werden, eine ausgeprägte stimulierende Wirkung auf die Proliferation von Epidermozyten haben, die bei Borderline-Verbrennungen in der Wunde konserviert sind, sowie von Keratinozyten in den Septen von Netztransplantaten. Die Arbeit von L. Budkevich und Co-Autoren (2000) präsentiert die Ergebnisse der Verwendung dieser Methode zur Behandlung von Verbrennungen bei Kindern. Die Studie umfasste 31 Kinder mit thermischem Trauma im Alter von 1 bis 14 Jahren. Bei drei Kindern betrug die Gesamtfläche der Verbrennungswunden der Grade IIIA-B – IV 40 %, bei 25 – 50–70 % und bei weiteren drei – 71–85 % der Körperoberfläche. Eine frühe chirurgische Nekrektomie wurde mit der Transplantation kultivierter Allofibroblasten und einer Autodermoplastik kombiniert. Der erste Behandlungsschritt beinhaltete die Exzision nekrotischen Gewebes, im zweiten die Transplantation kultivierter Allofibroblasten auf Trägerfolien und im dritten Schritt (48 Stunden nach der Transplantation der kultivierten Allofibroblasten) die Entfernung der Matrix und eine Autodermoplastik mit Hautlappen mit einem Perforationsverhältnis von 1:4. Drei Patienten, die mit schweren Verbrennungen in die Klinik eingeliefert wurden, bekamen kultivierte Allofibroblasten auf granulierende Wunden transplantiert. Die Transplantation kultivierter Allofibroblasten wurde bei 18 Kindern einmal, bei 11 Kindern zweimal und bei zwei Patienten dreimal durchgeführt. Die mit Zellkulturen bedeckte Wundoberfläche variierte zwischen 30 und 3500 cm². Die Wirksamkeit der kultivierten Allofibroblasten wurde anhand des Gesamtprozentsatzes der anwachsenden Hauttransplantate, der Heilungszeiten der Verbrennungen und der Anzahl der Todesfälle durch schwere Hitzetraumata beurteilt. Bei 86 % der Patienten war das Transplantat vollständig angewachsen. In 14 % der Fälle wurde eine teilweise Nichtanpflanzung von Hauttransplantaten festgestellt. Trotz der Behandlung starben sechs (19,3 %) Kinder. Die Gesamtfläche der Hautschäden betrug bei ihnen 40 bis 70 % der Körperoberfläche.Die Transplantation kultivierter Allofibroblasten war bei keinem Patienten mit einer Mortalität bei Verbrennungen verbunden.

Bei der Analyse der Behandlungsergebnisse stellen die Autoren fest, dass zuvor tiefe thermische Hautschäden, die 35–40 % der Körperoberfläche bedecken, als lebensunvereinbar angesehen wurden (für jüngere Kinder – bis 3 Jahre – sind tiefe Verbrennungen, die 30 % der Körperoberfläche bedecken, kritisch, für ältere Kinder – über 40 % der Körperoberfläche). Bei der Durchführung einer chirurgischen Nekrektomie mit Transplantation kultivierter Allofibroblasten und anschließender Autodermoplastik mit Hautlappen mit hohem Perforationskoeffizienten bleiben Verbrennungen Grad IIIB – IV kritisch, aber derzeit besteht Aussicht, in vielen Fällen selbst das Leben solcher Opfer zu retten. Die chirurgische Nekrektomie in Kombination mit der Transplantation kultivierter Allofibroblasten und Autodermoplastik bei Kindern mit tiefen Verbrennungen hat sich bei Patienten mit großflächigen Hautläsionen und einem Mangel an Spenderstellen als besonders wirksam erwiesen. Aktive chirurgische Taktiken und die Transplantation kultivierter Allofibroblasten tragen zur schnellen Stabilisierung des Allgemeinzustands solcher Patienten bei, verringern die Anzahl infektiöser Komplikationen von Verbrennungen, schaffen günstige Bedingungen für die Transplantation von Transplantaten, verkürzen die Wiederherstellungszeit verlorener Haut und die Dauer der stationären Behandlung sowie verringern die Häufigkeit tödlicher Ausgänge bei Opfern mit ausgedehnten Verbrennungen. So ermöglicht die Transplantation kultivierter Allofibroblasten mit anschließender Autodermoplastik mit Hautlappen die Genesung bei Kindern mit schweren Verbrennungen, die zuvor als dem Untergang geweiht galten.

Es ist allgemein anerkannt, dass das primäre Ziel der Behandlung von Verbrennungen die möglichst vollständige und schnelle Wiederherstellung der geschädigten Haut ist, um toxische Effekte, infektiöse Komplikationen und Dehydratation zu verhindern. Die Ergebnisse der Verwendung kultivierter Zellen hängen weitgehend von der Transplantationsbereitschaft der Brandwunde selbst ab. Bei der Transplantation kultivierter Keratinozyten auf die Wundoberfläche nach chirurgischer Nekrektomie wachsen durchschnittlich 55 % (flächenbezogen) der transplantierten Zellen an, während die Anwachsrate bei granulierenden Wunden auf 15 % sinkt. Daher erfordert die erfolgreiche Behandlung ausgedehnter tiefer Hautverbrennungen vor allem aktive chirurgische Maßnahmen. Bei Brandwunden des Grades IIIB–IV wird die Brandoberfläche umgehend von nekrotischem Gewebe befreit, um die Intoxikation zu verringern und die Zahl der Komplikationen der Verbrennung zu reduzieren. Der Einsatz solcher Maßnahmen ist entscheidend, um die Zeit zwischen der Verbrennung und dem Wundverschluss sowie die Krankenhausaufenthaltsdauer von Patienten mit ausgedehnten Verbrennungen zu verkürzen und die Zahl der Todesfälle deutlich zu reduzieren.

Die ersten Berichte über den erfolgreichen Einsatz von kultivierten Keratinozyten zum Abdecken von Verbrennungsflächen erschienen Anfang der 1980er Jahre. Später wurde dieser Eingriff mit Schichten kultivierter Keratinozyten durchgeführt, die meist aus Autokeratinozyten, wesentlich seltener aus Allokeratinozyten gewonnen wurden. Die Technologie der Autokeratinozytoplastik ermöglicht jedoch nicht die Anlage einer Zellbank, und die Herstellung eines Keratinozytentransplantats mit ausreichender Fläche dauert lange und beträgt 3–4 Wochen. Während dieser Zeit steigt das Risiko zur Entwicklung von Infektions- und anderen Komplikationen der Verbrennungserkrankung stark an, was die Gesamtaufenthaltsdauer der Patienten im Krankenhaus deutlich verlängert. Außerdem wachsen Autokeratinozyten bei der Transplantation auf granulierende Verbrennungswunden praktisch nicht an, und die hohen Kosten spezieller Wachstumsmedien und biologisch aktiver Stimulatoren des Keratinozytenwachstums schränken ihren klinischen Einsatz erheblich ein. Andere biotechnologische Methoden wie die Kollagenoplastik, die Transplantation kryokonservierter Xenoskin und die Verwendung verschiedener Biopolymerbeschichtungen erhöhen die Wirksamkeit der Behandlung ausgedehnter oberflächlicher, jedoch nicht tiefer Verbrennungen. Die Methode, die Wundoberfläche mit kultivierten Fibroblasten zu bedecken, unterscheidet sich grundlegend darin, dass Fibroblasten anstelle von Keratinozyten als Hauptbestandteil der kultivierten Zellschicht verwendet werden.

Voraussetzung für die Entwicklung der Methode waren Daten, dass Perizyten, die kleine Gefäße umgeben, mesenchymale Vorläuferzellen sind, die sich in Fibroblasten umwandeln können, die zahlreiche Wachstumsfaktoren produzieren und aufgrund ihrer starken stimulierenden Wirkung auf die Proliferation und Adhäsion von Keratinozyten die Wundheilung sicherstellen. Die Verwendung von kultivierten Fibroblasten zum Schließen von Wundoberflächen offenbarte sofort eine Reihe bedeutender Vorteile dieser Methode im Vergleich zur Verwendung von kultivierten Keratinozyten. Insbesondere erfordert die Gewinnung von Fibroblasten in Kultur keine speziellen Nährmedien und Wachstumsstimulanzien, was die Kosten des Transplantats im Vergleich zu den Kosten der Gewinnung von Keratinozyten um mehr als das Zehnfache reduziert. Fibroblasten werden leicht passiviert, wobei sie teilweise ihre Oberflächenhistokompatibilitätsantigene verlieren, was wiederum die Möglichkeit eröffnet, allogene Zellen zur Herstellung von Transplantaten und zum Aufbau ihrer Banken zu verwenden. Die Zeit bis zur Herstellung klinisch einsatzbereiter Transplantate wird von 3 Wochen (für Keratinozyten) auf 1–2 Tage (für Fibroblasten) reduziert. Eine primäre Fibroblastenkultur kann durch Kultivierung von Zellen aus Hautfragmenten gewonnen werden, die während der Autodermoplastik entnommen wurden. Die Zelldichte zur Gewinnung menschlicher Fibroblasten-Subkulturen beträgt nur 20 x 10³ ^pro 1 ^cm².

Um die Wirkung von Fibroblasten und ihren regulatorischen Proteinen auf die Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten zu untersuchen, wurde eine vergleichende Analyse der Morphologie und Proliferation von Keratinozyten auf Substraten der Kollagentypen I und III sowie Fibronektin in einer gemeinsamen Kultur mit menschlichen Fibroblasten durchgeführt. Menschliche Keratinozyten wurden aus Hautfragmenten von Patienten mit Verbrennungen isoliert, die während einer Autodermoplastik entnommen wurden. Die Keratinozyten-Aussaatdichte betrug 50 x 103 Zellen pro 1 cm2. Die klinische Wirksamkeit der Transplantation kultivierter Fibroblasten wurde bei 517 Patienten beurteilt. Alle Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 – erwachsene Opfer mit Verbrennungen des Grades IIA, B – IV; Gruppe 2 – Kinder mit schweren Verbrennungen des Grades IIIB – IV. Durch Bewertung der Dynamik der strukturellen und funktionellen Organisation von Fibroblasten in Monolayer-Kultur unter Berücksichtigung der Rolle von Glykosaminoglykanen, Fibronektin und Kollagen in den Regenerationsprozessen konnten die Autoren den 3. Tag als günstigsten Zeitraum für die Verwendung von Fibroblastenkulturen zur Herstellung von Transplantaten bestimmen. Eine Studie über die Wirkung von Fibroblasten auf die Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten zeigte, dass Fibroblasten in vitro eine ausgeprägte stimulierende Wirkung vor allem auf die Prozesse der Keratinozytenadhäsion haben, indem sie die Anzahl der anhaftenden Zellen und die Geschwindigkeit ihrer Fixierung um mehr als das Doppelte erhöhen. Die Stimulierung von Adhäsionsprozessen geht mit einer Steigerung der Intensität der DNA-Synthese und des Keratinozytenproliferationsgrads einher. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass das Vorhandensein von Fibroblasten und der von ihnen gebildeten extrazellulären Matrix eine notwendige Voraussetzung für die Bildung des tonofibrillären Apparates der Keratinozyten, interzellulärer Verbindungen und letztendlich für die Differenzierung der Keratinozyten und die Bildung der Basalmembran ist. Bei der Behandlung von Kindern mit schweren Verbrennungen hat sich eine hohe klinische Wirksamkeit der Transplantation von Allofibroblastenkulturen gezeigt, insbesondere in der Gruppe der Patienten mit ausgedehnten Hautläsionen bei Spenderstellenmangel. Eine umfassende morphofunktionelle Studie hat gezeigt, dass transplantierte Fibroblasten durch eine aktive Synthese von DNA sowie Kollagen, Fibronektin und Glykosaminoglykanen gekennzeichnet sind, die Teil der von Zellen gebildeten extrazellulären Matrix sind. Die Autoren weisen auf eine hohe Anwachsrate transplantierter Fibroblasten (bis zu 96 %), eine deutliche Verkürzung der Zeit bis zur Transplantation (innerhalb von 24–48 Stunden statt 2–3 Wochen bei Verwendung von Keratinozyten), eine deutliche Beschleunigung der Epithelisierung der Verbrennungsoberfläche sowie eine deutliche Kostensenkung (um das Zehnfache) der Technologie zur Züchtung eines Transplantats aus Fibroblasten im Vergleich zur Keratinozytentransplantation hin. Die Transplantation kultivierter Allofibroblasten ermöglicht es, das Leben von Kindern mit schweren Verbrennungen zu retten – thermische Schäden an mehr als 50 % der Körperoberfläche.was zuvor als unvereinbar mit dem Leben galt. Es ist anzumerken, dass mit der Transplantation allogener embryonaler Fibroblasten nicht nur eine schnellere Wundregeneration und Genesung von Patienten mit Verbrennungen unterschiedlichen Ausmaßes und unterschiedlicher Größe, sondern auch eine signifikante Verringerung ihrer Sterblichkeit überzeugend nachgewiesen wurde.

Autologe Fibroblasten werden auch in einem so komplexen Bereich der plastischen Chirurgie wie der rekonstruktiven Korrektur von Stimmbandverletzungen verwendet. Zu diesem Zweck wird üblicherweise Rinderkollagen verwendet, dessen Wirkdauer durch seine Immunogenität begrenzt ist. Als Fremdprotein reagiert Rinderkollagen empfindlich auf die Kollagenase des Empfängers und kann Immunreaktionen hervorrufen. Um dieses Risiko zu verringern, wurden Technologien zur Gewinnung von mit Glutaraldehyd vernetzten Kollagenpräparaten entwickelt. Ihr Vorteil liegt in der höheren Stabilität und geringeren Immunogenität, was praktische Anwendung bei der Beseitigung von Defekten und Atrophie der Stimmbänder gefunden hat. Injektionen von autologem Kollagen wurden erstmals 1995 angewendet. Diese Technik gewährleistete den Erhalt der Primärstruktur der autologen Kollagenfasern, einschließlich der intramolekularen enzymatisch katalysierten Vernetzungen. Tatsächlich sind natürliche Kollagenfasern widerstandsfähiger gegen die Zerstörung durch Proteasen als rekonstituiertes Kollagen, bei dem die Telopeptide geschnitten sind. Die Integrität der Telopeptide ist wichtig für die Quartärstruktur der Kollagenfasern und die Bildung von Querverbindungen zwischen benachbarten Kollagenmolekülen. Anders als Rinderkollagenpräparate verursacht autologes Kollagen keine Immunreaktionen beim Empfänger, ist jedoch als Aufbaumittel nicht wirksam genug. Eine stabile Korrektur kann durch lokale Kollagenproduktion mittels Transplantation autologer Fibroblasten erreicht werden. Bei der Untersuchung der Wirksamkeit der autologen Fibroblastentransplantation in der Klinik wurden jedoch gewisse Schwierigkeiten festgestellt. In der Anfangsphase nach der Fibroblastentransplantation war der klinische Effekt schwächer als nach der Einführung von Rinderkollagen. Bei der Kultivierung autologer Fibroblasten kann die Möglichkeit einer Transformation normaler Fibroblasten in pathologische Fibroblasten, die sogenannten Myofibroblasten, nicht ausgeschlossen werden. Diese sind für die Entwicklung von Fibrose und Narbenbildung verantwortlich, wie die Kontraktion des Kollagengels aufgrund der spezifischen Interaktion von Fibroblasten und Kollagenfibrillen zeigt. Darüber hinaus verlieren Fibroblasten nach serieller Passagierung in vitro die Fähigkeit, extrazelluläre Matrixproteine zu synthetisieren.

Es wurde nun jedoch eine Methode zur Kultivierung autologer menschlicher Fibroblasten experimentell entwickelt, die die oben genannten Mängel behebt und nicht zu einer onkogenen Transformation normaler Fibroblasten führt. Mit dieser Methode gewonnene autologe Fibroblasten werden zur Wiederherstellung von Defekten in weichem Gesichtsgewebe verwendet. In einer Studie von G. Keller et al. (2000) wurden 20 Patienten im Alter von 37 bis 61 Jahren mit Falten und atrophischen Narben behandelt. Hautbiopsien (4 mm) aus der retroaurikulären Region wurden in sterilen Reagenzgläsern mit 10 ml Kulturmedium (Eagle-Medium mit Antibiotikum, Mykoseptikum, Pyruvat und fötalem Kälberserum) ins Labor transportiert. Das Material wurde in 3–5 Kulturschalen mit 60 mm Durchmesser gegeben und in einem Thermostat mit einer Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert. Nach 1 Woche wurden die Zellen durch Trypsinisierung aus den Schalen entfernt und in 25 cm2 große Fläschchen gegeben. Die Zellen wurden den Patienten in einer Menge von 4 x 107 injiziert. Ein signifikanter und anhaltender klinischer Effekt wurde bei Patienten während der Korrektur von Nasolabialfalten sowie bei Patienten mit Narben 7 und 12 Monate nach der dritten Transplantation autologer Fibroblasten beobachtet. Laut Durchflusszytometrie produzierten die kultivierten Fibroblasten eine große Menge Kollagen Typ I. In-vitro-Studien haben eine normale Kontraktilität der injizierten Fibroblasten gezeigt. Zwei Monate nach der subkutanen Verabreichung von kultivierten Fibroblasten in einer Dosis von 4 x 107 Zellen wurden bei Nacktmäusen keine Tumoren festgestellt. Die injizierten Fibroblasten verursachten bei den Patienten keine Narbenbildung oder diffuse Fibrose. Laut dem Autor sind die transplantierten autologen Fibroblasten in der Lage, kontinuierlich Kollagen zu produzieren, was einen kosmetischen Verjüngungseffekt erzielt. Da die Lebensdauer differenzierter Zellen begrenzt ist, sind Fibroblasten junger Patienten gleichzeitig wirksamer als die von älteren Menschen. Es wird angenommen, dass es in Zukunft möglich sein wird, eine Fibroblastenkultur eines jungen Spenders kryokonservieren zu können, um später dessen eigene junge Zellen einem älteren Patienten zu transplantieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Annahme, autologe Fibroblasten seien, sofern sie funktionell erhalten bleiben, ein ideales Mittel zur Korrektur von Weichteildefekten im Gesicht darstellten, nicht ganz korrekt ist. Gleichzeitig weist der Autor selbst darauf hin, dass während der Studie einige problematische Situationen im Zusammenhang mit der Verwendung des autologen Fibroblasten-Kollagen-Systems auftraten. Der klinische Effekt war oft schwächer als bei Verwendung von Rinderkollagen, was bei den Patienten zu Enttäuschungen führte.

Die Literaturdaten zu den Aussichten für den klinischen Einsatz mesenchymaler Stammzellen sind insgesamt recht optimistisch. Es gibt Versuche, autologe multipotente mesenchymale Progenitorzellen aus dem Knochenmark zur Behandlung degenerativer Gelenkschäden einzusetzen. Erste klinische Studien zur Behandlung komplexer Knochenbrüche mit kultivierten mesenchymalen Progenitorzellen laufen. Auto- und allogene mesenchymale Knochenmarkstromazellen werden zur Herstellung von Knorpelgewebe für Transplantationen zur Korrektur traumatisch oder autoimmun bedingter Gelenkknorpelschäden verwendet. Es werden Methoden für den klinischen Einsatz multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen entwickelt, um Knochenschäden bei Kindern mit einer schweren Form inkompletter Osteogenese aufgrund von Mutationen im Typ-I-Kollagen-Gen zu beheben. Nach der Myeloablation wird den Empfängerkindern Knochenmark von HLA-kompatiblen gesunden Spendern transplantiert, da unfraktioniertes Knochenmark eine ausreichende Anzahl mesenchymaler Stammzellen enthalten kann, um einen schweren Knochendefekt zu kompensieren. Nach der Transplantation von allogenem Knochenmark zeigten diese Kinder positive histologische Veränderungen im trabekulären Knochen, eine Erhöhung der Wachstumsrate und eine Verringerung der Knochenbruchrate. In einigen Fällen wird ein positives klinisches Ergebnis durch die Transplantation von eng verwandtem allogenem Knochenmark und Osteoblasten erzielt. Die MSC-Transplantation wird auch zur Behandlung angeborener Knochenbrüchigkeit eingesetzt, die durch ein Ungleichgewicht von Osteoblasten und Osteoklasten im Knochengewebe verursacht wird. In diesem Fall wird die Wiederherstellung der Knochenbildung durch Chimärisierung des Pools von Stamm- und Progenitorstromazellen im Knochengewebe der Patienten erreicht.

Die Verbesserung der Methoden zur genetischen Modifikation mesenchymaler Stammzellen von Spendern zum Zweck der Korrektur genetischer Defekte des Stromagewebes wird weiter vorangetrieben. Man geht davon aus, dass mesenchymale Progenitorzellen in naher Zukunft in der Neurologie zur gezielten Chimärisierung von Gehirnzellen und zur Schaffung eines gesunden Zellpools verwendet werden, der in der Lage ist, defekte Enzyme oder Faktoren zu produzieren, die für die klinischen Manifestationen der Krankheit verantwortlich sind. Die Transplantation mesenchymaler Stammzellen kann zur Wiederherstellung des Knochenmarkstromas bei Krebspatienten nach Radio- und Chemotherapie und in Kombination mit Knochenmarkzellen zur Wiederherstellung der Hämatopoese verwendet werden. Die Entwicklung einer Ersatztherapie zur Behebung von Defekten des Bewegungsapparats mit Hilfe von mesenchymalen Stammzellen wird durch technische Entwicklungen im Bereich der Gestaltung von Matrix-Biomaterialien oder Biomimetika gefördert, die Gerüste bilden, die mit Nachkommen mesenchymaler Stammzellen besiedelt werden.

Quellen mesenchymaler Stammzellen

Die Hauptquelle mesenchymaler Stammzellen ist das Knochenmark, dessen hämatopoetische Stammzellen sich im Körper von Säugetieren kontinuierlich in Blut- und Immunsystemzellen differenzieren. Mesenchymale Stammzellen hingegen bestehen aus einer kleinen Population fibroblastenähnlicher Zellen des Knochenmarkstromas und tragen zur Erhaltung des undifferenzierten Zustands hämatopoetischer Stammzellen bei. Unter bestimmten Bedingungen differenzieren mesenchymale Stammzellen in Knorpel- und Knochengewebezellen. Bei der Aussaat auf einem Kulturmedium unter Bedingungen geringer Zelldichte bilden mononukleäre Stromazellen des Knochenmarks Kolonien von Adhäsionszellen, die im Grunde fibroblastenähnliche multipotente mesenchymale Vorläuferzellen sind. Einige Autoren gehen davon aus, dass sich im Knochenmark ungebundene mesenchymale Stammzellen ablagern, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung und ihres hohen Differenzierungspotenzials alle Körpergewebe lebenslang mit mesenchymalen Vorläufern von Stromaelementen versorgen.

Im Knochenmark bilden stromale Zellelemente ein Netzwerk, das den Raum zwischen den Sinusoiden und dem Knochengewebe ausfüllt. Der Gehalt an ruhenden MSCs im Knochenmark eines Erwachsenen ist vergleichbar mit der Menge an hämatopoetischen Stammzellen und überschreitet nicht 0,01–0,001 %. Aus Knochenmark isolierte und nicht kultivierte mesenchymale Stammzellen enthalten keine Adhäsionsmoleküle. Solche MSCs exprimieren weder CD34, ICAM, VCAM, Kollagen Typ I und III, CD44 noch CD29. Folglich sind es in vitro nicht mesenchymale Stammzellen, die auf dem Kultursubstrat fixiert sind, sondern fortgeschrittenere Vorläuferderivate mesenchymaler Stammzellen, die bereits die Komponenten des Zytoskeletts und den Rezeptorapparat für Zelladhäsionsmoleküle gebildet haben. Stromazellen mit dem CD34-Phänotyp kommen sogar im peripheren Blut vor, obwohl sie im Knochenmark deutlich weniger vorhanden sind als CD34-positive mononukleäre Zellen. Aus dem Blut isolierte und in Kultur überführte CD34-Zellen heften sich an das Substrat und bilden Kolonien fibroblastenähnlicher Zellen.

Es ist bekannt, dass in der Embryonalperiode die Stromabasis aller Organe und Gewebe von Säugetieren und Menschen vor und im Stadium der Organogenese aus einem gemeinsamen Pool mesenchymaler Stammzellen entsteht. Daher wird angenommen, dass sich in einem reifen Organismus die Mehrheit der mesenchymalen Stammzellen im Binde- und Knochengewebe befinden sollte. Es wurde festgestellt, dass der Hauptteil der zellulären Elemente des Stromas von lockerem Binde- und Knochengewebe durch determinierte Progenitorzellen dargestellt wird, die jedoch die Fähigkeit behalten, sich in vitro zu vermehren und Klone zu bilden. Wenn solche Zellen in den allgemeinen Blutkreislauf eingeführt werden, werden mehr als 20 % der mesenchymalen Progenitorzellen zwischen den Stromaelementen des hämatopoetischen Gewebes und der parenchymatösen Organe implantiert.

Eine potenzielle Quelle mesenchymaler Stammzellen ist Fettgewebe, unter dessen Stammzellen unterschiedlich stark ausgeprägte Adipozytenvorläufer identifiziert wurden. Die am wenigsten reifen Vorläuferzellen des Fettgewebes sind stromal-vaskuläre Zellen, die sich wie multipotente mesenchymale Vorläuferzellen des Knochenmarks unter dem Einfluss von Glukokortikoiden, insulinähnlichem Wachstumsfaktor und Insulin in Adipozyten differenzieren können. In Kultur differenzieren sich stromal-vaskuläre Zellen in Adipozyten und Chondrozyten, und im Fettgewebe aus dem Knochenmark finden sich Zellen, die Adipozyten und Osteoblasten bilden.

Stromale Stammzellen wurden auch in Muskeln gefunden. In der Primärkultur von Zellen, die aus menschlichem Skelettmuskel isoliert wurden, wurden Sternzellen und mehrkernige Myotuben nachgewiesen. In Gegenwart von Pferdeserum proliferieren Sternzellen in vitro ohne Anzeichen einer Zytodifferenzierung, und nach Zugabe von Dexamethason zum Nährmedium ist ihre Differenzierung durch das Auftreten von Zellelementen mit dem Phänotyp von Skelett- und glatten Muskelzellen, Knochen, Knorpel und Fettgewebe gekennzeichnet. Daher sind im menschlichen Muskelgewebe sowohl determinierte als auch undeterminierte multipotente mesenchymale Vorläuferzellen vorhanden. Es wurde gezeigt, dass die Population der im Skelettmuskel vorhandenen Vorläuferzellen aus undeterminierten multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen des Knochenmarks stammt und sich von myogenen Satellitenzellen unterscheidet.

Adhäsive Sternzellen, die multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen im Differenzierungspotenzial entsprechen, wurden auch im Myokard neugeborener Ratten gefunden, da sie sich unter dem Einfluss von Dexamethason in Adipozyten, Osteoblasten, Chondrozyten, glatte Muskelzellen, Skelettmuskelmyotuben und Kardiomyozyten differenzieren. Es zeigte sich, dass vaskuläre glatte Muskelzellen (Perizyten) Derivate undifferenzierter perivaskulärer multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen sind. In Kultur exprimieren perivaskuläre mesenchymale Stammzellen glattes Muskel-α-Aktin und den Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor und sind in der Lage, zumindest in glatte Muskelzellen zu differenzieren.

Eine Sonderstellung nimmt aus Sicht der Stammreserven das Knorpelgewebe ein, dessen extrem geringes reparatives Potenzial vermutlich auf einen Mangel an multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen bzw. Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren zurückzuführen ist. Man geht davon aus, dass multipotente mesenchymale Vorläuferzellen, die zur Chondro- und Osteogenese prädisponiert sind, aus anderen Gewebequellen in das Knorpelgewebe eindringen.

Der Gewebeursprung und die Bedingungen für die Einlagerung mesenchymaler Vorläuferzellen in Sehnen sind ebenfalls nicht geklärt. Experimentelle Beobachtungen deuten darauf hin, dass Achillessehnenzellen von Kaninchen in der frühen postnatalen Phase in Primärkulturen und bei der ersten Passage die Expression von Kollagen Typ I und Decorin beibehalten, bei weiterer Kultivierung jedoch die Differenzierungsmarker der Tenozyten verlieren.

Es ist anzumerken, dass die Antwort auf die Frage, ob multipotente mesenchymale Vorläuferzellen, die in verschiedenen Geweben lokalisiert sind, tatsächlich ständig in ihrem Stroma vorhanden sind oder ob der Gewebepool mesenchymaler Stammzellen durch die Migration von Stromastammzellen aus dem Knochenmark aufgefüllt wird, noch nicht vorliegt.

Neben Knochenmark und anderen mesenchymalen Gewebezonen eines erwachsenen Organismus kann Nabelschnurblut eine weitere Quelle für MSCs sein. Es wurde nachgewiesen, dass Nabelschnurblut Zellen enthält, die ähnliche morphologische und antigene Eigenschaften wie multipotente mesenchymale Vorläuferzellen aufweisen, zur Adhäsion fähig sind und multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Bezug auf das Differenzierungspotenzial nicht nachstehen. In Kulturen mesenchymaler Stammzellen aus Nabelschnurblut wurden 5 bis 10 % ungebundene multipotente mesenchymale Vorläuferzellen gefunden. Es stellte sich heraus, dass ihre Anzahl im Nabelschnurblut umgekehrt proportional zum Gestationsalter ist, was indirekt auf die Migration multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen in verschiedene Gewebe während der fetalen Entwicklung hinweist. Es liegen erste Informationen über die klinische Verwendung von aus Nabelschnurblut isolierten mesenchymalen Stammzellen sowie von aus embryonalem Biomaterial gewonnenen Zellen vor. Diese basieren auf der bekannten Fähigkeit fetaler Stammzellen, sich in die Organe und Gewebesysteme erwachsener Empfänger zu integrieren, einzupflanzen und dort ihre Funktion zu übernehmen.

Suche nach neuen Quellen für mesenchymale Stammzellen

Die Verwendung mesenchymaler Stammzellen embryonalen Ursprungs sowie anderer fetaler Zellen wirft eine Reihe ethischer, rechtlicher, juristischer und gesetzgeberischer Probleme auf. Daher wird die Suche nach extraembryonalem Spenderzellmaterial fortgesetzt. Ein Versuch der klinischen Nutzung menschlicher Hautfibroblasten war erfolglos, was nicht nur an der hohen finanziellen Leistungsfähigkeit der Technologie lag, sondern auch an der schnellen Differenzierung von Fibroblasten zu Fibrozyten, die ein deutlich geringeres Proliferationspotenzial haben und eine begrenzte Anzahl von Wachstumsfaktoren produzieren. Weitere Fortschritte in der Erforschung der Biologie von MSCs und multipotenten mesenchymalen Progenitorzellen des Knochenmarks ermöglichten die Entwicklung einer Strategie für die klinische Nutzung autologer mesenchymaler Stammzellen. Die Technologie ihrer Isolierung, Kultivierung, Ex-vivo-Reproduktion und gezielten Differenzierung erforderte zunächst die Untersuchung des Spektrums molekularer Marker von MSCs. Ihre Analyse zeigte, dass Primärkulturen menschlichen Knochengewebes mehrere Arten multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen enthalten. Der Proosteoblasten-Phänotyp wurde in Zellen nachgewiesen, die den Marker stromaler Progenitorzellen STRO-1 exprimieren, aber nicht den Osteoblastenmarker alkalische Phosphatase tragen. Solche Zellen zeichnen sich durch eine geringe Fähigkeit zur Bildung mineralisierter Knochenmatrix sowie das Fehlen der Expression von Osteopontin und Parathormonrezeptoren aus. Derivate STRO-1-positiver Zellen, die keine alkalische Phosphatase exprimieren, werden durch intermediär und vollständig differenzierte Osteoblasten repräsentiert. Es wurde festgestellt, dass zelluläre Elemente geklonter Linien STRO-1-positiver menschlicher trabekulärer Knochenzellen in der Lage sind, sich in reife Osteozyten und Adipozyten zu differenzieren. Die Differenzierungsrichtung dieser Zellen hängt von der Wirkung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, proinflammatorischer Zytokine – IL-1b und Tumornekrosefaktor a (TNF-a) – sowie des entzündungshemmenden und immunsuppressiven TGF-b ab.

Später stellte sich heraus, dass multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen ein ihnen inhärenter spezifischer Phänotyp fehlt, sie jedoch einen Komplex von Markern exprimieren, die für mesenchymale, endotheliale, epitheliale und Muskelzellen charakteristisch sind, ohne dass immunphänotypische Antigene hämatopoetischer Zellen – CD45, CD34 und CD14 – exprimiert werden. Darüber hinaus produzieren mesenchymale Stammzellen konstitutiv und induzierbar hämatopoetische und nicht-hämatopoetische Wachstumsfaktoren, Interleukine und Chemokine, und Rezeptoren für einige Zytokine und Wachstumsfaktoren werden auf multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen exprimiert. Unter den Zellen der Stromamatrix des menschlichen Körpers wurden ruhende Zellen mit einem Immunphänotyp gefunden, der nahezu identisch mit dem Antigenprofil von 5-Fluorouracil-unbehandelten multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen ist – beide Zellen exprimieren CD117, das „adulte“ Stammzellen kennzeichnet.

Somit wurde bisher kein für mesenchymale Stammzellen spezifischer Zellmarker identifiziert. Es wird angenommen, dass ruhende Zellen eine Population ungebundener multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen darstellen, da sie keine Marker für Zellen exprimieren, die auf Osteo- (Cbfa-1) oder Adipogenese (PPAR-y-2) festgelegt sind. Längere Exposition langsam proliferierender ruhender Zellen gegenüber fötalem Rinderserum führt zur Bildung terminal differenzierender, festgelegter Vorläuferzellen, die sich durch schnelles Wachstum auszeichnen. Die klonale Expansion solcher mesenchymalen Stammzellen wird durch FGF2 unterstützt. Es scheint, dass das Genom stromaler Stammzellen recht eng „geschlossen“ ist. Es gibt Berichte über das Fehlen einer spontanen Differenzierung bei MSCs – ohne besondere Bedingungen für die Festlegung wandeln sie sich nicht einmal in Zellen mesenchymaler Abstammung um.

Um die Populationsstruktur von mesenchymalen Stammzellderivaten zu untersuchen, wird an Stromazelllinien und in Primärkulturen nach Differenzierungsmarkerproteinen gesucht. In-vitro-Klonanalysen von koloniebildenden Zellen des Knochenmarks haben gezeigt, dass EGF die durchschnittliche Koloniegröße erhöht und die klonale Expression von alkalischer Phosphatase verringert, wenn es auf Primärkulturen angewendet wird, während die Zugabe von Hydrocortison die Expression von alkalischer Phosphatase aktiviert, die ein Marker für die osteogene Richtung der MSC-Differenzierung ist. Monoklonale Antikörper gegen STRO-1 ermöglichten die Trennung und Untersuchung der Population STRO-1-positiver Adhäsionszellen in einem heterogenen System von Dexter-Kulturen. Es wurde ein Spektrum von Zytokinen bestimmt, die nicht nur die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen und lymphatischen Zellen regulieren, sondern auch durch para-, auto- und endokrine Mechanismen an der Bildung, Resorption und Resorption von Skelettgewebe beteiligt sind. Die rezeptorvermittelte Freisetzung sekundärer Botenstoffe wie cAMP, Diacylglycerol, Inositoltriphosphat und Ca2+ wird auch zur Markeranalyse verschiedener Kategorien von Stromagewebezellen verwendet, die die entsprechenden Rezeptoren exprimieren. Durch die Verwendung monoklonaler Antikörper als Marker konnte die Zugehörigkeit retikulärer Zellen des Stromas lymphatischer Organe zu den T- und B-abhängigen Zonen festgestellt werden.

Die Frage nach der Möglichkeit des Ursprungs von MSCs aus hämatopoetischen Stammzellen wurde lange Zeit wissenschaftlich diskutiert. Tatsächlich wachsen bei der Explantation von Knochenmarkzellsuspensionen in Monolayer-Kulturen einzelne Fibroblastenkolonien darin. Es zeigte sich jedoch, dass das Vorhandensein von Vorläuferzellen von Fibroblastenkolonien und verschiedenen Sprossen hämatopoetischer Gewebedifferenzierung im Knochenmark kein Beweis für deren gemeinsamen Ursprung aus einer hämatopoetischen Stammzelle ist. Mittels Diskriminanzanalyse von Knochenmarkstammzellen wurde festgestellt, dass das Mikromilieu während der heterotopen Knochenmarktransplantation nicht von hämatopoetischen Zellen übertragen wird, was die Existenz einer histogenetisch von hämatopoetischen Zellen unabhängigen MSC-Population im Knochenmark belegt.

Darüber hinaus ermöglichte die Methode des selektiven Klonens die Identifizierung einer neuen Kategorie stromaler Vorläuferzellen in Monolayer-Kulturen von Knochenmarkszellen, die Bestimmung ihrer Anzahl und die Untersuchung ihrer Eigenschaften sowie ihres Proliferations- und Differenzierungspotenzials. Es stellte sich heraus, dass stromale Fibroblasten-ähnliche Zellen in vitro proliferieren und diploide Kolonien bilden, die nach einer Rücktransplantation in den Körper für die Bildung neuer hämatopoetischer Organe sorgen. Die Ergebnisse der Untersuchung einzelner Klone deuten darauf hin, dass es unter den stromalen Vorläuferzellen eine Zellpopulation gibt, die aufgrund ihres Proliferations- und Differenzierungspotenzials die Rolle von Stammzellen des Stromagewebes beanspruchen kann, histogenetisch unabhängig von hämatopoetischen Stammzellen. Die Zellen dieser Population zeichnen sich durch selbsterhaltendes Wachstum aus und differenzieren sich in Vorläuferzellelemente von Knochen, Knorpel und retikulärem Gewebe des Knochenmarks.

Von großem Interesse sind die Ergebnisse der Studien von R. Chailakhyan und Co-Autoren (1997–2001), die Knochenmarkstroma-Progenitorzellen von Kaninchen, Meerschweinchen und Mäusen auf dem a-MEM-Nährmedium unter Zusatz von fötalem Kälberserum kultivierten. Die Autoren führten die Explantation mit einer Anfangsdichte von 2–4 x 103 Knochenmarkzellen pro 1 cm2 durch. Homologe oder heterologe strahleninaktivierte Knochenmarkzellen wurden als Feederzellen in einer Dosierung verwendet, die den Feedereffekt aufrechterhielt, ihre Proliferation jedoch vollständig blockierte. Zwei Wochen alte primäre diskrete Fibroblastenkolonien wurden trypsiniert, um monoklonale Stämme zu erhalten. Der klonale Ursprung der Kolonien wurde mithilfe eines chromosomalen Markers in gemischten Knochenmarkkulturen männlicher und weiblicher Meerschweinchen, durch Zeitrafferfotografie lebender Kulturen und in gemischten Kulturen aus syngenem Knochenmark von CBA- und CBAT6T6-Mäusen nachgewiesen. Die Transplantation einer Suspension frisch isolierter Knochenmarkzellen oder in vitro gezüchteter Stromafibroblasten unter die Nierenkapsel erfolgte in poröse Ivalon- oder Gelatinegerüste sowie in eine inaktivierte schwammartige Knochenmatrix von Kaninchen. Für die Transplantation der Klone in eine Knochenscheide wurden Weichteile und Periost aus Meerschweinchenfemuren entfernt, die Epiphysenfugen entfernt und das Knochenmark gründlich ausgewaschen. Der Knochen wurde in Fragmente (3 – 5 mm) geschnitten, getrocknet und mit einer Dosis von 60 Gy bestrahlt. Einzelne Fibroblastenkolonien wurden in Knochenscheiden platziert und intramuskulär implantiert. Für die intraperitoneale Transplantation von in vitro gezüchteten Stromafibroblasten wurden Diffusionskammern vom Typ A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) und O (V=0,15 cm3, h=2 mm) verwendet.

Bei der Untersuchung der Wachstumsdynamik klonaler Stämme haben R. Chailakhyan et al. (2001) festgestellt, dass einzelne Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, sowie deren Nachkommen über ein enormes proliferatives Potenzial verfügen. Bei der 10. Passage lag die Zahl der Fibroblasten in einigen Stämmen bei 1,2–7,2 x 10 ⁹ Zellen. Während ihrer Entwicklung führten sie zu 31–34 Zellverdoppelungen. In diesem Fall führte die heterotope Transplantation von aus Knochenmark stammenden Stämmen, die aus Stromavorläufern mehrerer Dutzend Klone gebildet wurden, zur Übertragung des Knochenmarkmikromilieus und zur Bildung eines neuen hämatopoetischen Organs in der Transplantationszone. Die Autoren stellten die Frage, ob einzelne Klone in der Lage sind, das Knochenmarkmikromilieus von Stromazellen zu übertragen oder ob hierfür die Zusammenarbeit mehrerer verschiedener klonogener Stromavorläufer erforderlich ist. Und wenn einzelne Klone in der Lage sind, das Mikroumfeld zu übertragen, ist es dann für alle drei hämatopoetischen Sprossen vollständig oder bilden unterschiedliche Klone das Mikroumfeld für unterschiedliche hämatopoetische Sprossen? Zur Lösung dieser Fragen wurde eine Technologie zur Kultivierung stromaler Progenitorzellen auf einem Kollagengel entwickelt, mit der die gewachsenen Fibroblastenkolonien für eine anschließende heterotope Transplantation von der Oberfläche entfernt werden können. Einzelne Klone stromaler Fibroblasten, die aus Knochenmarkszellen von CBA-Mäusen und Meerschweinchen gezüchtet wurden, wurden zusammen mit einem Fragment der Gelbeschichtung herausgeschnitten und heterotop transplantiert – unter die Nierenkapsel syngener Mäuse oder in den Bauchmuskel autologer Meerschweinchen. Nach der Transplantation in den Muskel wurden die Kolonien auf dem Gel in Knochenscheiden platziert.

Die Autoren stellten fest, dass 50–90 Tage nach der Transplantation von Knochenmarkfibroblastenkolonien in 20 % der Fälle die Entwicklung von Knochen oder von Knochen- und hämatopoetischem Gewebe in der Transplantationszone beobachtet wurde. Bei 5 % der Empfängertiere enthielten die gebildeten Knochengewebeherde einen mit Knochenmark gefüllten Hohlraum. Innerhalb der Knochenzylinder hatten diese Herde eine abgerundete Form und eine Kapsel aus Knochengewebe mit Osteozyten und einer gut entwickelten osteoblastischen Schicht. Der Knochenmarkhohlraum enthielt retikuläres Gewebe mit myeloiden und erythroiden Zellen, deren proportionales Verhältnis sich nicht von dem in normalem Knochenmark unterschied. In der Niere war das Transplantat ein typisches Knochenmarkorgan, das während der Transplantation von nativem Knochenmark gebildet wurde, wobei die Knochenkapsel den Knochenmarkhohlraum nur von der Seite der Nierenkapsel bedeckte. Das hämatopoetische Gewebe umfasste myeloide, erythroide und megakaryozytische Elemente. Das Stroma des Knochenmarkhohlraums hatte ein gut entwickeltes Sinussystem und enthielt typische Fettzellen. Gleichzeitig wurde in der Transplantationszone einiger Kolonien unter der Nierenkapsel Knochengewebe ohne Anzeichen von Hämatopoese gefunden. Die Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungspotenziale einzelner Klone wurde an monoklonalen Knochenmarkstämmen von Kaninchen fortgesetzt, deren Zellen in einem Nährmedium resuspendiert und in einem separaten Ivalon-Schwamm mit einer Masse von 1–2 mg unter die Nierenkapsel eines Kaninchen-Knochenmarkspenders transplantiert wurden. Zellen von 21 monoklonalen Stämmen wurden einer solchen Autotransplantation unterzogen. Die Ergebnisse wurden nach 2–3 Monaten berücksichtigt. Die Autoren fanden heraus, dass in 14 % der Fälle die transplantierten monoklonalen Stämme ein Knochenmarkorgan bildeten, das aus Knochengewebe und einer mit hämatopoetischen Zellen gefüllten Knochenmarkhöhle bestand. In 33 % der Fälle bildeten die transplantierten Stämme einen kompakten Knochen unterschiedlicher Größe mit in den Höhlen eingemauerten Osteozyten und einer entwickelten Osteoblastenschicht. In einigen Fällen entwickelte sich in den Schwämmen mit transplantierten Klonen retikuläres Gewebe ohne Knochen oder hämatopoetische Elemente. Manchmal bildete sich retikuläres Stroma mit einem gut entwickelten Netzwerk von Sinusoiden, das jedoch nicht mit hämatopoetischen Zellen besiedelt war. Die erhaltenen Ergebnisse ähnelten somit den Daten, die bei der Transplantation von Klonen auf Kollagengel erhalten wurden. Während jedoch die Transplantation von auf einem Substrat gewachsenen Klonen in 5 % der Fälle zur Bildung von Knochenmarkgewebe, in 15 % von Knochengewebe und in 80 % von retikulärem Gewebe führte, wurde bei der Transplantation monoklonaler Stämme die Bildung von Knochenmarkelementen in 14 % der Fälle, von Knochengewebe in 53 % und von retikulärem Gewebe in 53 % der Fälle beobachtet. Laut den Autoren weist dies darauf hin, dass die Bedingungen für die Entfaltung des proliferativen und differenzierenden Potenzials von Stromafibroblasten bei der Transplantation auf poröse Gerüste optimaler waren als bei ihrer Transplantation in Knochenscheiden und auf ein Kollagensubstrat.Es ist möglich, dass der Einsatz fortschrittlicherer Methoden zur Kultivierung und Rücktransplantation von Klonen die Bedingungen für die Realisierung ihres Differenzierungspotenzials durch Klone verbessern und diese Verhältnisse verändern kann. So oder so, die Hauptbedeutung der durchgeführten Studien liegt jedoch darin, dass einige Klone von Stromazellen in der Lage sind, Knochengewebe zu bilden und gleichzeitig ein stromales hämatopoetisches Mikroumfeld für drei Sprossen der Knochenmarkhämatopoese bereitzustellen: erythroide, myeloide und megakaryozytäre, wodurch ziemlich große Plattformen aus hämatopoetischem Gewebe und etwas Knochenmasse entstehen.

Die Autoren untersuchten anschließend die Fähigkeit einzelner klonogener Stroma-Progenitorzellen, diese Art der Zelldifferenzierung in einem geschlossenen System von Diffusionskammern zu durchlaufen. Darüber hinaus galt es zu klären, ob einzelne Klone Polypotenz besitzen oder ob die Manifestation des Differenzierungspotenzials die kooperative Interaktion mehrerer Klone mit einem festgelegten Zytodifferenzierungsmerkmal erfordert, deren unterschiedliche Verhältnisse die bevorzugte Bildung von Knochen-, Netz- oder Knorpelgewebe bestimmen. Durch die Kombination zweier methodischer Ansätze – der Gewinnung monoklonaler Stämme von Knochenmark-Stroma-Progenitorzellen und deren Transplantation in Diffusionskammern – erzielten R. Chailakhyan und Co-Autoren (2001) Ergebnisse, die ihnen ein besseres Verständnis der strukturellen Organisation des Knochenmarkstromas ermöglichten. Die Transplantation monoklonaler Stämme von Stroma-Progenitorzellen in O-Typ-Kammern führte zur Bildung von Knochen- und Knorpelgewebe, was auf die Fähigkeit der Nachkommen einer einzelnen stromalen koloniebildenden Zelle hindeutet, gleichzeitig Knochen- und Knorpelgewebe zu bilden. Die Annahme, dass Knochen- und Knorpelgewebe aus einer gemeinsamen stromalen Vorläuferzelle entstehen, wurde wiederholt aufgestellt. Diese Hypothese konnte jedoch experimentell nicht bestätigt werden. Die Bildung von Knochen und Knorpel in Diffusionskammern war der notwendige Beweis für die Existenz einer gemeinsamen Vorläuferzelle dieser beiden Gewebearten unter den stromalen Knochenmarkstammzellen.

Anschließend wurden 29 Klonstämme der zweiten bis dritten Passage, die aus Primärkulturen von Kaninchenknochenmark gewonnen wurden, in Diffusionskammern gegeben und homologen Tieren intraperitoneal implantiert. Die Untersuchungen zeigten, dass 45 % der monoklonalen Knochenmarkstämme osteogenes Potenzial besitzen. Neun Kammern enthielten ausschließlich retikuläres Gewebe, während es in 13 weiteren Kammern zusammen mit Knochen- und Knorpelgewebe vorhanden war; diese stellten 76 % aller Stämme dar. In Kammern vom Typ O, in denen eine Differenzierung sowohl von Knochen- als auch von Knorpelgewebe möglich war, wurden 16 Stämme untersucht. In vier Kammern (25 %) wurden sowohl Knochen- als auch Knorpelgewebe gebildet. Es sei noch einmal darauf hingewiesen, dass in den Untersuchungen von R. Chailakhyan et al. (2001) einzelne Progenitorzellen innerhalb eines Zellstamms 31 bis 34 Verdoppelungen durchliefen und ihre Nachkommenschaft 0,9–2,0 x 10 ⁹ Zellen umfasste. Die Zahl der Mitosen, die die Vorläuferzellen polyklonaler Stämme durchliefen, war praktisch identisch mit der monoklonaler Stämme. Die Entwicklungsgeschwindigkeit polyklonaler Stämme hing insbesondere in der ersten Phase ihrer Entstehung in erheblichem Maße von der Zahl der zur Initiierung der Stämme verwendeten Kolonien ab. Diploide Stämme menschlicher embryonaler Fibroblasten (WI-38) bildeten bei Reklonierung im Stadium 12-15 der Verdoppelung ebenfalls Kolonien mit unterschiedlichem Durchmesser und Zellgehalt. Große Kolonien mit mehr als 103 Zellen machten nur 5-10 % aus. Mit zunehmender Zahl der Teilungen nahm der Prozentsatz großer Kolonien ab. Mono- und polyklonale Stämme von Knochenmarkstromafibroblasten behielten nach 20 oder mehr Verdoppelungen einen diploiden Chromosomensatz, und die Tendenz ihrer Entwicklung war mit der Entwicklungsdynamik diploider Stämme embryonaler Fibroblasten vergleichbar. Die Analyse des Differenzierungspotenzials einzelner Knochenmarkstroma-Progenitorzellen, die durch Transplantation monoklonaler Stämme in Diffusionskammern durchgeführt wurde, zeigte, dass die Hälfte von ihnen osteogen war. Große Kolonien machten 10 % ihrer Gesamtzahl aus. Folglich entsprach die Anzahl osteogener koloniebildender Zellen etwa 5 % ihrer Gesamtpopulation. Die Gesamtmasse der von den Autoren identifizierten osteogenen Progenitorzellen umfasste Zellen, die gleichzeitig Knochen- und Knorpelgewebe bilden konnten. Darüber hinaus wurde erstmals nachgewiesen, dass diese beiden Gewebearten in einem erwachsenen Organismus eine gemeinsame Progenitorzelle besitzen: 25 % der getesteten Klone wurden von solchen Zellen gebildet, und ihr Anteil an der Gesamtpopulation der Progenitorzellen betrug mindestens 2,5 %.

So hat die heterotope Transplantation einzelner Klone von Knochenmarkfibroblasten neue Aspekte der strukturellen Organisation der Population mesenchymaler Vorläuferzellen enthüllt. Es wurden stromale Vorläuferzellen gefunden, die in der Lage sind, ein spezifisches Mikroumfeld für alle hämatopoetischen Sprossen gleichzeitig zu übertragen. Ihre Anzahl unter den in verschiedenen Modellen untersuchten großen Klonen liegt zwischen 5 und 15 % (0,5–1,5 % der Gesamtzahl der nachgewiesenen Vorläuferzellen). Neben Klonen, die das komplette Knochenmarkmikroumfeld übertragen, gibt es Vorläuferzellen, die nur zur Osteogenese bestimmt sind und bei Übertragung in ein offenes System Knochengewebe bilden, das die Entwicklung der Hämatopoese nicht unterstützt. Ihr Anteil an der Gesamtzahl der Vorläuferzellen beträgt 1,5–3 %. Einige dieser Zellen sind in der Lage, mit einer begrenzten Zeit der Selbsterhaltung Knochengewebe zu bilden. Folglich ist die Population stromaler Vorläuferzellen in ihrem Differenzierungspotenzial heterogen. Darunter befindet sich eine Kategorie von Zellen, die als Stromastammzellen gelten und sich in alle drei für Knochenmarkstromagewebe charakteristischen Richtungen differenzieren können, um Knochen, Knorpel und retikuläres Gewebe zu bilden. Die präsentierten Daten lassen hoffen, dass es mithilfe verschiedener Zellmarker möglich sein wird, den Beitrag jedes Stromazelltyps zur Organisation eines spezifischen Mikromilieus und zur Unterstützung der Hämatopoese in Dexter-Kulturen zu bestimmen.

Merkmale mesenchymaler Stammzellen

In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass multipotente mesenchymale Progenitorzellen in stationären Knochenmarkkulturen durch eine begrenzte Population kleiner agranulärer Zellen (RS-1-Zellen) repräsentiert werden, die sich durch eine geringe Koloniebildungsfähigkeit und das Fehlen der Expression des für proliferierende Zellen spezifischen Antigens Ki-67 auszeichnen. Die antigenen Parameter ruhender RS-1-Zellen unterscheiden sich vom Antigenspektrum rasch proliferierender, determinierter stromaler Progenitorzellen. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Proliferationsrate determinierter Progenitorzellen nur in Gegenwart von RS-1-Zellen beobachtet wird. RS-1-Zellen wiederum steigern ihre Wachstumsrate unter dem Einfluss von Faktoren, die von den reifsten Derivaten multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen sezerniert werden. Es scheint, dass RS-1-Zellen eine Unterklasse undeterminierter, recyclingfähiger MSCs darstellen. In vitro zeichnen sich 5-Fluorouracil-resistente Knochenmark-Stroma-Progenitorzellen durch einen niedrigen RNA-Gehalt und eine hohe Expression des Ornithindecarboxylase-Gens aus, einem Marker für nicht proliferierende Zellen.

Die intensive Proliferation stromaler Progenitorzellen beginnt nach ihrer Fixierung auf dem Substrat. Dabei wird das Markerprofil schlecht differenzierter Zellen exprimiert: SH2 (TGF-(3)-Rezeptor), SH3 (Signalproteindomäne), Kollagen Typ I und III, Fibronektin, Adhäsionsrezeptoren VCAM-1 (CD106) und ICAM (CD54), Cadherin-11, CD44, CD71 (Transferrinrezeptor), CD90, CD120a und CD124, jedoch ohne die Expression charakteristischer Marker hämatopoetischer Stammzellen (CD34, CD14, CD45). Klonales Wachstum ermöglicht wiederholte Passagen mesenchymaler Stammzellen mit der Bildung zahlreicher genetisch homogener pluripotenter stromaler Progenitorzellen in Kultur. Nach 2-3 Passagen erreicht ihre Zahl 50-300 Millionen. In einer Kultur ausreichender Dichte differenzieren sich stromale Vorläuferzellen nach Proliferationsstopp im Gegensatz zu hämatopoetischen Gewebefibroblasten in Adipozyten, Myozyten, Knorpel- und Knochenzellen. Eine Kombination dreier regulatorischer Differenzierungssignale, darunter 1-Methylisobutylxanthin (ein Induktor der intrazellulären cAMP-Bildung), Dexamethason (ein Inhibitor der Phospholipasen A und C) und Indomethacin (ein Inhibitor der Cyclooxygenase, der auch die Aktivität der Thromboxansynthase reduziert), wandelt bis zu 95 % der mesenchymalen Vorläuferzellen in Adipozyten um. Die Bildung von Adipozyten aus unreifen Stromaelementen wird durch die Expression des Lipoproteinlipase-Gens, den histochemischen Nachweis von Apolipoproteinen und peroxisomalen Rezeptoren bestätigt. Zellen desselben Klons bilden unter dem Einfluss von TGF-b in serumfreiem Medium eine homogene Chondrozytenpopulation. Die mehrschichtige Zellkultur dieses Knorpelgewebes zeichnet sich durch eine entwickelte interzelluläre Matrix aus Proteoglykan und Kollagen Typ II aus. In einem Nährmedium mit 10 % führt die Wirkung eines Differenzierungssignalkomplexes aus β-Glycerophosphat (einem anorganischen Phosphatspender), Ascorbinsäure und Dexamethason in derselben Kultur stromaler Vorläuferzellen zur Bildung von Zellaggregaten. In solchen Zellen ist ein fortschreitender Anstieg der alkalischen Phosphataseaktivität und des Osteopontinspiegels zu beobachten, was auf die Bildung von Knochengewebe hindeutet, dessen Mineralisierung durch einen fortschreitenden Anstieg des intrazellulären Calciumgehalts bestätigt wird.

Einigen Daten zufolge ist die Fähigkeit mesenchymaler Stammzellen zur unbegrenzten Teilung und Vermehrung verschiedener Zelltypen der mesenchymalen Differenzierungslinie mit einem hohen Grad an Plastizität verbunden. Beim Einbringen in die Ventrikel oder die weiße Substanz des Gehirns wandern mesenchymale Stammzellen in das Parenchym des Nervengewebes und differenzieren sich in Derivate der Glia- oder neuronalen Zelllinie. Darüber hinaus gibt es Informationen zur Transdifferenzierung von MSCs in hämatopoetische Stammzellen sowohl in vitro als auch in vivo. Eine eingehendere Analyse in einigen Studien hat eine außergewöhnlich hohe Plastizität von MSCs festgestellt, die sich in ihrer Fähigkeit zur Differenzierung in Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen, Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Skelettmuskelzellen manifestiert. Zahlreiche Studien zum Transdifferenzierungspotenzial von MSCs in vitro und in vivo haben ergeben, dass multipotente mesenchymale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark terminal in Zelllinien differenzieren, die Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Nerven- und Fettgewebe sowie Sehnen und Stroma bilden, die die Hämatopoese unterstützen.

Andere Studien konnten jedoch keine Anzeichen einer eingeschränkten Pluripotenz des Genoms mesenchymaler Stammzellen und der Vorläuferpopulationen von Stromazellen aufdecken, obwohl mehr als 200 aus einer Primärkultur isolierte MSC-Klone untersucht wurden, um eine mögliche Pluripotenz der Stromazellen zu testen. Die überwiegende Mehrheit der Klone behielt in vitro die Fähigkeit zur Differenzierung in osteogene, chondrogene und adipogene Richtung. Beim Ausschluss der Wahrscheinlichkeit einer Migration von Empfängerzellen durch Transplantation mesenchymaler Stammzellen unter die Nierenkapsel oder in Diffusionskammern stellte sich heraus, dass stromale Vorläuferzellen in situ einen heterogenen Phänotyp behalten, was entweder auf das Fehlen von Restriktionsfaktoren in der Transplantationszone oder das Fehlen der MSC-Pluripotenz als solcher hinweist. Gleichzeitig wird die Existenz eines seltenen Typs somatischer pluripotenter Stammzellen angenommen, die die gemeinsamen Vorläufer aller adulten Stammzellen sind.

Die Multi-, aber nicht Pluripotenz echter mesenchymaler Stammzellen, die einen sehr kleinen Anteil der Knochenmarkszellen ausmachen und unter bestimmten Bedingungen während der In-vitro-Kultivierung proliferieren können, ohne sich zu differenzieren, zeigt sich in ihrer induzierten Bindung an Knochen-, Knorpel-, Fett- und Muskelgewebezellen sowie Tenozyten und Stromaelemente, die die Hämatopoese unterstützen. In der Regel provoziert eine längere Exposition gegenüber einem Kulturmedium mit fötalem Kälberserum die Freisetzung von MSCs in determinierte stromale Progenitorzellen, deren Nachkommen eine spontane terminale Differenzierung durchlaufen. In vitro kann durch Zugabe von Dexamethason, ß-Glycerophosphat und Ascorbinsäure zum Konditionierungsmedium eine gezielte Bildung von Osteoblasten erreicht werden, während eine Kombination von Dexamethason- und Insulin-Differenzierungssignalen die Bildung von Adipozyten induziert.

Es wurde festgestellt, dass sich Knochenmark-MSCs vor dem Eintritt in das Stadium der terminalen Differenzierung unter bestimmten Kulturbedingungen zunächst in fibroblastenähnliche mesenchymale Stammzellen differenzieren. Derivate dieser Zellen sind in vivo an der Bildung von Knochen, Knorpel, Sehnen, Fett- und Muskelgewebe sowie des Stromas beteiligt, das die Hämatopoese unterstützt. Viele Autoren verstehen unter dem Begriff „multipotente mesenchymale Vorläuferzellen“ sowohl die MSCs selbst als auch determinierte stromale Vorläuferzellen des Knochenmarks und mesenchymaler Gewebe. Die Klonanalyse multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen aus dem Knochenmark zeigte, dass etwas mehr als ein Drittel aller Klone sich in Osteo-, Chondro- und Adipozyten differenzieren, während die Zellen der übrigen Klone lediglich osteogenes Potenzial besitzen und nur Chondro- und Osteozyten bilden. Ein Klon multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen wie BMC-9 differenziert unter geeigneten mikroökologischen Bedingungen zu Zellen mit dem Phänotyp und den funktionellen Merkmalen nicht nur von Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten, sondern auch von Stromazellen, die die Hämatopoese unterstützen. Ein Klon von RCJ3.1-Zellen, isoliert aus fetalem Rattenknochenmark, differenziert sich zu mesenchymalen Zellen verschiedener Phänotypen. Unter der kombinierten Wirkung von Ascorbinsäure, β-Glycerophosphat und Dexamethason bilden die Zellelemente dieses Klons zunächst multinukleäre Myozyten und anschließend Adipozyten, Chondrozyten und Inseln mineralisierten Knochengewebes. Die Population der Granulazellen aus dem Periost von Rattenfeten entspricht ungebundenen multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen, da sie sich durch eine niedrige Proliferationsrate auszeichnet, keine Differenzierungsmarker exprimiert und sich unter Kulturbedingungen zu Chondro-, Osteo- und Adipozyten sowie glatten Muskelzellen differenziert.

Somit ist anzuerkennen, dass die Frage der Pluri- bzw. Multipotenz des Genoms mesenchymaler Stammzellen offen bleibt, was dementsprechend auch die Vorstellungen über das ebenfalls nicht abschließend geklärte Differenzierungspotential stromaler Vorläuferzellen beeinflusst.

Ein experimentell nachgewiesenes und wichtiges Merkmal mesenchymaler Stammzellen ist ihre Fähigkeit, die Gewebenische zu verlassen und im Blutkreislauf zu zirkulieren. Um das genetische Differenzierungsprogramm zu aktivieren, müssen solche zirkulierenden Stammzellen in die entsprechende Mikroumgebung gelangen. Es wurde gezeigt, dass durch die systematische Einführung von MSCs in den Blutkreislauf von Empfängertieren unreife Zellen in verschiedene Organe und Gewebe implantiert werden und sich anschließend zu Blutzellen, Myozyten, Adipozyten, Chondrozyten und Fibroblasten differenzieren. Infolgedessen kommt es in lokalen Gewebezonen zu signalregulatorischen Interaktionen zwischen ungebundenen und gebundenen stromalen Vorläuferzellen sowie zwischen ihnen und den umgebenden reifen Zellen. Es wird angenommen, dass die Differenzierung durch parakrine regulatorische Faktoren mesenchymalen und nicht-mesenchymalen Ursprungs (Wachstumsfaktoren, Eicosanoide, extrazelluläre Matrixmoleküle) induziert wird, die räumliche und zeitliche Verbindungen in der Mikroumgebung multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen herstellen. Daher sollte eine lokale Schädigung des mesenchymalen Gewebes zur Bildung von Zonen der Mikroumgebung multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen führen, die sich qualitativ vom Komplex regulatorischer Signale intakter Gewebe unterscheiden, in denen eher physiologische als reparative Regenerationsprozesse stattfinden. Dieser Unterschied ist im Hinblick auf die Spezialisierung des zellulären Phänotyps in der normalen und schadensinduzierten Mikroumgebung äußerst wichtig.

Den Konzepten zufolge liegen hier die Mechanismen des grundlegenden Unterschieds zwischen den beiden bekannten Prozessen – physiologische Regeneration und entzündliche Proliferation – eingebettet. Der erste Prozess endet mit der Wiederherstellung der spezialisierten Zellzusammensetzung des Gewebes und seiner Funktion, während der Proliferationsprozess zur Bildung reifer Bindegewebselemente und zum Funktionsverlust der geschädigten Gewebezone führt. Um optimale Programme für den Einsatz multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen in der regenerativen und plastischen Medizin zu entwickeln, ist daher eine gründliche Untersuchung der Auswirkungen mikroökologischer Faktoren auf die Differenzierung von MSCs erforderlich.

Die Abhängigkeit der Struktur des Stammzellkompartiments von zellulären para- und autokrinen Regulatoren, deren Expression durch externe Signale moduliert wird, steht außer Zweifel. Zu den wichtigsten Funktionen der regulatorischen Faktoren zählen die Kontrolle der asymmetrischen Teilung von MSCs und die Expression von Genen, die die Entwicklungsstadien und die Zahl der Zellteilungen bestimmen. Externe Signale, von denen die weitere Entwicklung der MSCs abhängt, werden durch ihr Mikroumfeld bereitgestellt. In unreifem Zustand proliferieren MSCs lange Zeit, während sie die Fähigkeit zur Differenzierung in Adipozytenlinien, Myofibroblasten, hämatogenes Gewebestroma, Knorpel- und Knochenzellen behalten. Es wurde festgestellt, dass eine begrenzte Population CD34-negativer Stromazellelemente, die im Blut zirkulieren, aus dem allgemeinen Blutkreislauf in das Knochenmarkstroma zurückkehrt, wo sie in Linien CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen umgewandelt wird. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Rezirkulation mesenchymaler Progenitorzellen im Blutkreislauf das Gewebegleichgewicht stromaler Stammzellen in verschiedenen Organen aufrechterhält, indem sie einen gemeinsamen Pool unreifer Stromaelemente des Knochenmarks mobilisiert. Die Differenzierung von MSCs in Zellen mit multiplen mesenchymalen Phänotypen und ihre Beteiligung an der Regeneration oder Reparatur von Knochen, Knorpel, Fettgewebe und Sehnen in vivo wurde mithilfe adoptiver Transfermodelle an Versuchstieren nachgewiesen. Anderen Autoren zufolge ist die Fernmigration von MSCs entlang des Gefäßbetts mit der Kurzstrecken- oder lokalen Bewegung multipotenter mesenchymaler Progenitorzellen innerhalb des Gewebes während der Knorpelreparatur, Muskelregeneration und anderer Wiederherstellungsprozesse verbunden.

Lokale Stammreserven der Stromagewebebasis dienen als Zellquelle für die physiologische Geweberegeneration und werden durch Ferntransport von MSCs wieder aufgefüllt, sobald die Ressourcen des Stromagewebestamms verbraucht sind. Unter Bedingungen, bei denen jedoch eine Notfallmobilisierung des reparativen Zellpotenzials erforderlich ist, beispielsweise bei einem Polytrauma, ist die gesamte MSC-Ebene an den Prozessen der reparativen Regeneration beteiligt, und mesenchymale Vorläuferzellen des Knochenmarks werden über den allgemeinen Blutfluss in die Peripherie rekrutiert.

Mesenchymale Stammzelltransplantation

Es lassen sich gewisse Parallelen zwischen den Prozessen der physiologischen Geweberegeneration und ihrer Bildung während der intrauterinen Entwicklung feststellen. In der Embryogenese von Mensch und Säugetier erfolgt die Bildung verschiedener spezialisierter Zelltypen aus dem ekto-, meso- und endodermalen Pool der Keimblätter, jedoch unter obligatorischer Beteiligung des Mesenchyms. Das lockere Zellnetzwerk des embryonalen mesenchymalen Gewebes erfüllt zahlreiche regulatorische, metabolische, strukturelle und morphogenetische Funktionen. Die Bildung provisorischer Organe erfolgt erst nach der Kondensation des Mesenchyms durch das klonogene Wachstum von Vorläuferzellen, die die primären morphogenetischen Signale der Organogenese generieren. Stromaderivate des embryonalen Mesenchyms bilden das Zellgerüst provisorischer Organe und bilden die Grundlage für deren zukünftige energetisch-plastische Versorgung durch das Wachstum primärer Blut- und Lymphgefäße. Mit anderen Worten: Die Stromaelemente der Mikrozirkulationseinheit fetaler Organe entstehen vor der Bildung ihrer strukturellen und funktionellen Einheiten. Darüber hinaus sorgt die aktive Migration mesenchymaler Zellen während der Organogenese für die räumliche Orientierung der sich entwickelnden Organe, indem sie deren Volumengrenzen durch Einschränkung homöotischer Hox-Typen markiert. Das Stroma-Gerüst dient auch als Grundlage für den Aufbau struktureller und funktioneller Einheiten parenchymatöser Organe, die oft morphogenetisch und funktionell völlig unterschiedliche Zellen enthalten. Folglich sind die Funktionen des Mesenchyms während der Embryogenese primär und werden durch die Generierung regulatorischer Signale realisiert, die die regionale Proliferation und Differenzierung von Progenitor-Epithelzellen aktivieren. Embryonale Mesenchymzellen produzieren Wachstumsfaktoren wie HGF-b, HGF-b, CSF, für die parenchymale Progenitorzellen entsprechende Rezeptoren besitzen. In differenziertem, reifem Gewebe eines erwachsenen Organismus generiert das Stroma-Zellnetzwerk auch Signale, um die Lebensfähigkeit und Proliferation von Progenitorzellen nicht-mesenchymalen Ursprungs aufrechtzuerhalten. Das Spektrum der stromalen regulatorischen Signale in der postnatalen Ontogenese ist jedoch unterschiedlich (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF usw.) und zielt darauf ab, die physiologische Regeneration oder Reparatur geschädigter Gewebebereiche sicherzustellen. Außerdem sind die spektralen Eigenschaften der stromalen regulatorischen Faktoren in jedem Gewebetyp und sogar innerhalb eines Organs unterschiedlich. Insbesondere treten Hämatopoese und Lymphopoese mit der Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer und immunkompetenter Zellen nur in bestimmten Organen auf, innerhalb deren Grenzen das stromale Mikroumfeld wirkt, das Bedingungen für die Reifung hämatopoetischer und lymphatischer Zellen schafft. Die Fähigkeit hämatopoetischer und lymphatischer Zellen, ein bestimmtes Organ neu zu bevölkern, sich zu vermehren und in seinen mikrostrukturellen Nischen zu reifen, hängt von den regulatorischen Faktoren des Mikroumfelds ab.

Zu den Bestandteilen der extrazellulären Matrix, die von multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen produziert werden, zählen Fibronektin, Laminin, Kollagen und Proteoglykane sowie CD44 (Hyaluron- und Osteopontinrezeptor), die eine wichtige Rolle bei der Organisation interzellulärer Interaktionen und der Bildung der extrazellulären Matrix im Knochenmark und Knochengewebe spielen. Es ist erwiesen, dass multipotente mesenchymale Vorläuferzellen des Knochenmarks ein Stroma-Mikroumfeld schaffen, das induktive und regulatorische Signale nicht nur an MSCs, sondern auch an hämatopoetische Vorläuferzellen und andere nicht-mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks sendet. Es ist bekannt, dass die Beteiligung von MSCs an der Hämatopoese von ihrer Fähigkeit abhängt, sich in Stromazellen zu differenzieren, die die Hämatopoese unterstützen, und dieses struktive Signal erhalten MSCs direkt von hämatopoetischen Stammzellen. Aus diesem Grund dient das Netzwerk stromaler Vorläuferzellen in der Kultur als Nährboden für die Entwicklung aller Klone hämatopoetischer Zellen.

In einem reifen Organismus befindet sich die Intensität der Hämo- und Lymphopoese in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem „Verbrauch“ reifer Blutzellen und Zellen des Immunsystems in der Peripherie. Da sich Stromazellen des Knochenmarks und der lymphatischen Organe äußerst selten erneuern, kommt es in ihnen nicht zu einer signifikanten Umstrukturierung der Stromastrukturen. Das System kann durch mechanische Schädigung eines der Organe der Hämo- oder Lymphopoese aus dem dynamischen Gleichgewicht gebracht werden, was zu gleichmäßigen, sequenziellen Veränderungen führt, die nicht nur und weniger die hämatopoetischen oder lymphatischen Elemente als vielmehr die Stromastrukturen des geschädigten Organs betreffen. Im Prozess der reparativen Regeneration wird zunächst die Stromabasis gebildet, die dann mit hämatopoetischen oder immunkompetenten Zellen neu besiedelt wird. Diese seit langem bekannte Tatsache macht die posttraumatische Regeneration zu einem geeigneten Modell zur Untersuchung des Stromamilieus hämatopoetischer Organe. Insbesondere wird die mechanische Entleerung der Markhöhle von Röhrenknochen verwendet, um die reparative Regeneration des Knochenmarks zu untersuchen - die Kürettage, die eine schnelle und effektive Entfernung von hämatopoetischem Gewebe aus dem Zustand des dynamischen Gleichgewichts ermöglicht. Bei der Untersuchung der Prozesse der reparativen Regeneration der hämatopoetischen und stromalen Komponenten des Knochenmarks nach der mechanischen Entleerung der Markhöhle der Tibia von Meerschweinchen wurde festgestellt, dass keine direkte Korrelation zwischen den Indizes der Regeneration von hämatopoetischen und stromalen Zellen (der Anzahl der hämatopoetischen Zellen, der Konzentration und Anzahl der stromalen Vorläuferzellen) besteht. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass eine Zunahme der Population stromaler Vorläuferzellen zu einem früheren Zeitpunkt nach der Kürettage auftritt und die Stromafibroblasten selbst phosphatasepositiv werden, was typisch für osteogenes Gewebe ist. Es wurde auch festgestellt, dass die Kürettage von 3–5 Röhrenknochen zum Wachstum dieser Zellpopulation im Knochenmark nicht operierter Knochen und sogar in der Milz führt, die bei Meerschweinchen ein ausschließlich lymphopoetisches Organ ist.

Das morphologische Bild der Reparaturprozesse im Knochenmark entfernter Tibiae von Meerschweinchen entspricht im Allgemeinen den in der Literatur beschriebenen Daten, die bei Tierversuchen anderer Arten gewonnen wurden. Die Dynamik der nach der Entfernung des hämatopoetischen Gewebes auftretenden Veränderungen ist bei allen Tierarten gleich und unterscheidet sich lediglich in den Zeitparametern. Morphologisch gesehen besteht die Phasenfolge der Wiederherstellung der Hämatopoese in der entleerten Markhöhle aus aufeinanderfolgenden Prozessen der Blutgerinnselbildung, der Bildung von grobem, faserigem Knochengewebe, seiner Resorption, der Entwicklung von Sinusoiden und der Bildung von retikulärem Stroma, das anschließend mit hämatopoetischen Elementen neu besiedelt wird. Dabei steigt die Zahl der hämatopoetischen Vorläuferzellen im Prozess der Regeneration des Knochenmarkgewebes parallel zur Zunahme des Gehalts an hämatopoetischen Stammzellen.

Yu. Gerasimov und Co-Autoren (2001) verglichen Veränderungen der Zahl hämatopoetischer Zellen und der Zahl stromaler Vorläuferzellen in einzelnen Phasen des Regenerationsprozesses. Es zeigte sich, dass quantitative Veränderungen der Knochenmarkszellen im kürettierten Knochen der Dynamik der morphologischen Merkmale der Regeneration entsprechen. Die Autoren bringen die Abnahme des Zellgehalts im Regenerat während der ersten drei Tage mit dem Absterben hämatopoetischer Zellen aufgrund des ungünstigen Einflusses des Mikromilieus in Verbindung, das durch das proliferierende retikuläre Gewebe im konservierten Knochenmark in der Epiphysenregion entsteht, sowie mit der Bildung osteoider Gewebeherde in letzterer und Gefäßschäden während der Kürettage. Am 7.-12. Tag geht ein Anstieg der kernhaltigen Zellen mit dem Auftreten einzelner Herde myeloider Hämatopoese in den Proliferationszonen stromaler Elemente einher. Am 20. Tag treten signifikante Bereiche regenerierten Knochenmarks und gut entwickelter Nebenhöhlen auf, was mit einem signifikanten Anstieg der Gesamtzellzahl einhergeht. Die Anzahl der hämatopoetischen Elemente beträgt in diesem Zeitraum jedoch 68 % des Kontrollwerts. Dies steht im Einklang mit zuvor veröffentlichten Daten, wonach die Anzahl der hämatopoetischen Zellen nach der Kürettage erst am 35.–40. Tag nach der Operation den Normalwert erreicht.

In der frühen posttraumatischen Phase sind während der Kürettage konservierte lokale Zellelemente die Hauptquelle für die Wiederherstellung der Hämatopoese. In späteren Stadien sind Stammzellen, die freie Stromazonen neu besiedeln, die Hauptquelle der Regeneration des hämatopoetischen Gewebes im Knochenmark. Was die einzelnen Kategorien von Stromazellen (endotheliale, retikuläre und osteogene Zellen) betrifft, sind die Quellen, die ihre Bildung während der Reorganisation der Knochenmarkshöhle sicherstellen, unklar. Die Ergebnisse der Studie von Yu. V. Gerasimov und Co-Autoren (2001) weisen darauf hin, dass im nach der Kürettage konservierten Knochenmark die Konzentration von Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, deutlich höher ist als in normalem Knochenmark. Die Autoren glauben, dass die Kürettage zu einer intensiveren selektiven Auswaschung hämatopoetischer Zellen im Vergleich zu koloniebildenden Stromazellen führt, die an der Bildung des Stromas beteiligt sind und stärker mit seiner Hauptsubstanz verbunden sind als hämatopoetische Zellen.

Die Dynamik der Veränderung der Zahl der Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, korreliert mit der Intensität der Osteogeneseprozesse, der anschließenden Resorption von Knochentrabekeln und der Bildung von retikulärem Stroma, das von hämatopoetischen Zellen besiedelt wird. Die meisten Stroma-Progenitorzellen bilden in den angegebenen Regenerationsbedingungen grobes fibröses Knochengewebe und retikuläres Stroma. Bei Femurfrakturen unter Bedingungen anhaltender Osteosynthese steigen am 5. Tag in der Regenerationszone Konzentration und Zahl der Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, und während der Phase intensiver Knochenbildung steigt ihre Zahl um das 6-fache. Es ist bekannt, dass Knochenmarkszellen, die Fibroblastenkolonien bilden, osteogene Eigenschaften haben. Die Zahl der Stroma-Progenitorzellen steigt vor der Besiedlung des ausgeschnittenen Knochenmarkgebiets durch hämatopoetische Zellen an. Dies steht im Einklang mit den Daten, denen zufolge Stromazellen für die Bildung eines hämatopoetischen Mikromilieus sorgen. Offensichtlich entspricht die Schaffung einer hämatopoetischen Mikroumgebung einem bestimmten Grad der Regeneration des Stromagewebes, und die Anzahl der hämatopoetischen Zellen nimmt mit der Ausdehnung der für die Hämatopoese geeigneten Stromaplattform zu.

Besonders interessant sind die Daten der Autoren, die zeigen, dass unmittelbar nach der Kürettage die Anzahl stromaler Progenitorzellen in den entfernten Skelettregionen zunimmt. Ab der sechsten Stunde bis einschließlich zum zwanzigsten Tag ist in der kontralateralen Tibia ein mehr als doppelt so hoher Anstieg sowohl der Konzentration als auch der Anzahl der Zellen, die Fibroblastenkolonien bilden, zu beobachten. Der Mechanismus dieses Phänomens hängt vermutlich damit zusammen, dass eine massive Knochenmarksverletzung zur Bildung einer großen Anzahl von Blutgerinnseln führt, mit gleichzeitiger Zerstörung einer signifikanten Anzahl von Blutplättchen und der Freisetzung des plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF) ins Blut. Dieser Faktor ist dafür bekannt, die Proliferation von Zellen zu fördern, die Fibroblastenkolonien bilden und sich im Körper außerhalb des proliferativen Pools befinden. In Experimenten an Kaninchen fördert die lokale Gabe von MSCs die Regeneration des Knorpelgewebes des operativ geschädigten Kniegelenks, was mit der Bildung von Chondrozyten aus den injizierten MSCs einhergehen kann. Die reparative Regeneration von Knochendefekten bei Laborratten wird jedoch durch die Verwendung mesenchymaler Stammzellen in einem Keramikgerüst deutlich verbessert. Daher ist anzunehmen, dass – wenn nicht RBOC – ein anderer Faktor, der von geschädigten Stromazellen ausgeht, einen fernstimulierenden Effekt auf die Proliferation mesenchymaler Vorläuferzellen in intakten Knochenmarkszonen ausübt und deren Migration in den Knochenmarksdefektbereich stimuliert. Dem widersprechen wiederum Literaturdaten aus früheren Jahren, die darauf hinweisen, dass für das Mikromilieu verantwortliche Stromazellen im Gegensatz zu hämatopoetischen Zellen nicht migrationsfähig sind und aus lokalen Quellen stammen.

Dennoch deuten die Ergebnisse der Studie von Yu. Gerasimov und Co-Autoren (2001) darauf hin, dass ein mechanisches Trauma nicht nur eine drastische Umstrukturierung des Stromagewebes im ausgeschabten Knochen verursacht, sondern auch signifikante Veränderungen im Stroma in entfernten intakten Knochen, d. h., es gibt eine systemische Reaktion des Stromagewebes auf ein lokales Trauma. Darüber hinaus wird diese Reaktion bei einem Polytrauma – mehrfacher Kürettage – verstärkt und nicht nur im operierten Knochen und entfernten Teilen des Skeletts beobachtet, sondern auch in den lymphatischen Organen, insbesondere in der Milz. Der Mechanismus einer solchen systemischen Reaktion des Stromagewebes von Knochenmark und Milz auf ein lokales Trauma und Polytrauma ist noch unbekannt. Man nimmt an, dass dieser Prozess mit der Wirkung eines humoralen Faktors zusammenhängt, der vom mesenchymalen Stroma der Markhöhle des Knochenmarks abgesondert wird. Die Möglichkeit der Produktion eines organunspezifischen humoralen Faktors durch Stromazellen des Knochenmarks und der Milz, der für die Proliferation von Zellen verantwortlich ist, die Fibroblastenkolonien bilden, wird durch Daten über ihre koloniestimulierende Aktivität in einschichtigen Knochenmarkkulturen belegt.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass bei systemischer Verabreichung multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen deren Derivate nicht nur das Knochenmark, sondern auch andere Gewebe neu besiedeln, was insbesondere für die Gentherapie genutzt wird. Es wurde gezeigt, dass bei intravenöser Verabreichung großer Mengen von MSCs mit einem Wildtyp-Genom an Mäuse mit einer Mutation im Kollagen-I-Gen die Spenderzellen bis zu 30 % der Zellen im Knochen- und Knorpelgewebe der Empfänger ersetzen und transfizierte mesenchymale Maus-Stammzellen, die menschliches IL-3 sezernieren, die Hämatopoese 9 Monate lang wirksam unterstützen, wenn sie immundefizienten Mäusen gleichzeitig mit menschlichen hämatopoetischen Stammzellen verabreicht werden.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetische Modifikation mesenchymaler Stammzellen

Zu den Erfolgen der experimentellen genetischen Modifikation von MSCs gehört die Transfektion des Faktor-IX-Gens in humane MSCs mit anschließender Übertragung der transfizierten Zellen auf immundefiziente Mäuse. Dies führt zum Auftreten des antihämophilen Faktors B im Blut für 8 Wochen nach der Transplantation. In diesem Experiment wurde in den transfizierten Zellen eine posttranslationale Modifikation von Faktor IX durch γ-Glutamylcarboxylase durchgeführt. Die Transduktion von MSCs mit einem retroviralen Vektor, der für humanen Faktor IX kodiert, war weniger erfolgreich – die anschließende Verabreichung dieser Zellen an einen Hund mit Hämophilie B lieferte nur 12 Tage lang einen therapeutischen Faktor-IX-Spiegel und hielt die normale Intensität der Gerinnungshämostase aufrecht.

Die Transplantation mesenchymaler Stammzellen in das Hirnparenchym von Tieren hat gezeigt, dass sich unreife Spenderzellen sowohl in neuronale als auch in gliale Populationen transformieren. Die Transplantation neuronaler Derivate gesunden Spender-Mesenchymgewebes ermöglicht theoretisch die Korrektur genetischer Anomalien des Hirnstoffwechsels bei Patienten mit Morbus Gaucher und anderen Störungen des Lipid-, Gangliosid- oder Kohlenhydratstoffwechsels.

Die experimentelle Suche nach Bedingungen für die Transdifferenzierung von Knochenmarkstroma-Stammzellen in Nerven- und Lebergewebe-Progenitorzellen ist im Gange. Der Fokus der Forscher liegt auf Kombinationen von Differenzierungsinduktoren und speziell konditionierten Medien. Um die Primärkultur der Stromazellen zu isolieren, werden gewaschene und in DMEM/F12 (1/1)-Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum resuspendierte Knochenmarkzellen mit einer Dichte von 200.000/cm2 ausgesät. Nach 24 Stunden werden nicht anhaftende Zellen entfernt und an der Folie haftende fibroblastenähnliche Zellen eine Woche lang kultiviert. Zur Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Neuroblasten wird ein konditioniertes Medium verwendet, das durch dreitägige Kultivierung der Primärkultur embryonaler Mausfibroblasten gewonnen wurde, sowie DMEM/F12-Medium (1/1) mit 2 % fötalem Kälberserum und Zusatz von 20 ng/ml NF oder 10-6 M Retinsäure (Neuroinduktoren, die zur neuronalen Differenzierung embryonaler Stammzellen von Mäusen und Menschen verwendet werden). Die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Hepatozyten-Vorläuferzellen wird in einem konditionierten Medium induziert, das durch dreitägige Kultivierung der Primärkultur embryonaler Leberzellen von Mäusen in DMEM/F12-Medium (1/1) mit Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum entsteht.

Hier sei noch einmal darauf hingewiesen, dass die koloniebildenden Zellen des Knochenmarkstromas heteromorph sind und in zwei Typen unterteilt werden können. Der erste Typ umfasst fibroblastenähnliche Zellen, die Filopodien mit großen Kernen und einem oder zwei Nukleolen bilden. Der zweite Typ wird durch kleine spindelförmige Zellen repräsentiert. Werden Zellen beider Typen in einem konditionierten Medium kultiviert, das auf einer Nährschicht primärer embryonaler Mausfibroblasten gewonnen wurde, erscheinen am 3. bis 4. Tag neuroblastenähnliche Zellen in der Kultur. In diesem Stadium haben sie meistens eine spindelförmige Gestalt mit einem oder zwei langen Fortsätzen, die in Filopodien enden. Seltener sind pyramidenförmige oder sternförmige Zellen mit kurzen Dendriten. Die Dendriten einiger Neuroblasten haben in ihrem distalen Teil charakteristische Ausdehnungen (Wachstumsknospen) und Verzweigungen, während andere deutliche Wachstumskegel mit Filopodien haben, durch die die Dendriten wachsen. Ähnliche morphologische Merkmale (Knospen und Wachstumskegel mit Filopodien), die bei der Differenzierung von Neuroblasten zu Neuronen auftreten, wurden in Studien zur Neurogenese detailliert beschrieben. Darauf basierend schlussfolgern einige Autoren, dass es sich bei den in der Kultur gefundenen Zellen um Neuroblasten handelt. Insbesondere E. Shchegelskaya und Co-Autoren (2002) stellten nach zweiwöchiger Kultivierung einer Primärkultur von Stromazellen in einem alle 3 bis 4 Tage gewechselten konditionierten Medium fest, dass einige der Zellen proliferierten, dabei aber in einem undifferenzierten Zustand blieben. Äußerlich ähnelten solche Zellen Fibroblasten und wurden in der Kultur zusammen mit differenzierenden Neuroblasten nachgewiesen. Die Mehrzahl der Zellen (etwa 80 %) befand sich in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu Zellen des Nervengewebes, hauptsächlich zu Neuronen. Die dendritischen Fortsätze dieser Zellen standen in engem Kontakt miteinander, sodass die Zellen nach und nach Abschnitte des Nervennetzwerks in Form langer vielzelliger Stränge auf dem Substrat bildeten. Die dendritischen Fortsätze der Neuroblasten wurden deutlich länger, einige von ihnen übertrafen die Länge des Neuronenkörpers selbst um das 8- bis 10-fache. Der Anteil der Pyramiden- und Sternzellen nahm allmählich zu. Die Dendriten der Sternzellen verzweigten sich. Den Autoren zufolge entspricht die spätere Differenzierung von Pyramiden- und Sternzellen im Vergleich zu spindelförmigen Zellen der Abfolge der Stadien der normalen Neurogenese bei Tieren. Daraus schlussfolgern die Autoren, dass Stromastammzellen des Knochenmarks eine induzierte Neurogenese durchlaufen, bei der in vitro alle drei Haupttypen von Neuronen aus Neuroblasten entstehen. Nervenzellvorläufer wurden auch während der Kultivierung von Stromazellen des Knochenmarks für 3-4 Tage in einem Medium mit 2 % fötalem Serum und 20 ng/ml LIF nachgewiesen. In diesem Fall teilten sich die Stammzellen jedoch sehr langsam, eine Differenzierung der Neuroblasten fand nur in 30 % der Fälle statt und sie bildeten keine neuronalen Netzwerke. Durch die Verwendung von Retinsäure als einem der Induktoren der Nervenzelldifferenzierung erhielten die Autoren bis zu 25-30 % Nervenzellen in der Kultur.mit überwiegend glialen Elementen - Astrozyten und Oligodendrozyten. Neuronen machten nur ein Drittel aller Nervenzellen aus, obwohl sie durch alle drei Typen vertreten waren: spindelförmige, pyramidenförmige und sternförmige Zellen. Am sechsten Tag der Kultivierung von Stromazellen in einem Medium mit Retinsäure differenzierten sich die Nervenzellen stärker, und in einzelnen Pyramidenneuronen wurden Axone gefunden, die bei normaler Neuroontogenese später als die Bildung dendritischer Fortsätze auftreten. Laut den Autoren hat die Methode der Retinsäure-Induktion trotz der geringen Ausbeute an Nervenzellen ihre Vorteile: Oligodendrozyten und Astrozyten erfüllen myelinisierende und ernährungsphysiologische Funktionen während des Wachstums von Dendriten und Axonen und sind für die normale Bildung von Nervengewebe notwendig. Daher ist es für die Reparatur der geschädigten Bereiche in vivo besser, eine mit Gliazellen angereicherte Suspension von Neuronen zu verwenden.

In der zweiten Versuchsreihe versuchten die Autoren, die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Leberzellen zu induzieren. Nach dreitägiger Kultivierung von Knochenmarkstromastammzellen in einem konditionierten Medium, das durch Inkubation embryonaler Maushepatozyten gewonnen wurde, wurden große, kugelförmige, oft zweikernige Zellen mit zytoplasmatischen Einschlüssen unterschiedlicher Größe gefunden. Diese Zellen befanden sich in unterschiedlichen Differenzierungsstadien und unterschieden sich in Größe, Kernzahl und Einschlüssen im Zytoplasma. In den meisten dieser Zellen wurde Glykogen nachgewiesen, auf dessen Grundlage die Autoren sie als Hepatozyten-Vorläuferzellen identifizierten. Da in der Kultur keine neuroblastenähnlichen Zellen gefunden wurden, wurde der Schluss gezogen, dass dem durch die Kultivierung embryonaler Hepatozyten gewonnenen konditionierten Medium Differenzierungsfaktoren von Nervenzellen fehlten, es aber umgekehrt Faktoren enthielt, die die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Hepatozyten-Vorläuferzellen induzieren. Zusammenfassend gehen die Autoren davon aus, dass Stromazellen des Knochenmarks über Pluripotenz verfügen, da sie sich in vitro in Abhängigkeit von den verwendeten konditionierten Medien und Induktoren in Nerven- oder Lebergewebezellen differenzieren.

Einige Studien haben die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen in Kardiomyozyten, Knorpel-, Knochen- und Nervengewebezellen tatsächlich korrekt nachgewiesen. Es gibt Hinweise darauf, dass es unter Knochenmarkzellen Populationen von Stammzellen gibt, die sich zu Hepatozyten differenzieren können. Angesichts dieser Daten können die Ergebnisse der oben genannten Experimente an Mäusen als weitere Bestätigung des Vorhandenseins pluripotenter mesenchymaler Stammzellen im Knochenmark angesehen werden, die sich in Zellen verschiedener Gewebe eines erwachsenen Organismus differenzieren können.

Mesenchymale Stammzelltransplantation

In der klinischen Transplantation können humane mesenchymale Stammzellen genutzt werden, um die Expansion hämatopoetischer Stammzellen sowie ihrer frühen präkommittierten Nachkommen sicherzustellen. Insbesondere die Gabe autologer hämatopoetischer Stammzellen und MSCs an Krebspatienten nach Hochdosis-Chemotherapie beschleunigt die Wiederherstellung der Neutrophilen- und Thrombozytenzahl im peripheren Blut. Allo- und autologe Transplantationen mesenchymaler Stammzellen werden zur Behandlung von Multiplem Myelom, aplastischer Anämie und spontaner Thrombozytopenie eingesetzt – Erkrankungen, die mit einem primären Defekt im Stroma des hämatopoetischen Gewebes einhergehen. Die Effizienz der Zelltherapie in der onkohämatologischen Pathologie ist in vielen Fällen bei gleichzeitiger Einführung stromaler und hämatopoetischer Stammzellen höher, was sich in einer Verkürzung der postoperativen Phase der Wiederherstellung der Hämatopoese und einer Verringerung der Todesfälle durch nicht-selektive Zerstörung regionaler und zirkulierender Krebszellen äußert, bei der auch die patienteneigenen hämatopoetischen Vorläuferzellen absterben. Die Aussichten, MSCs und andere multipotente mesenchymale Vorläuferzellen in der klinischen Praxis einzusetzen, beruhen auf der relativ einfachen Gewinnung aus Knochenmarkaspiraten, der Expansion in Kultur und der Transfektion therapeutischer Gene. Gleichzeitig kann die lokale Implantation multipotenter mesenchymaler Vorläuferzellen zum Ausgleich lokaler Gewebedefekte genutzt werden, und bei systemischen Funktionsstörungen von Geweben mesenchymalen Ursprungs ist ihre Einführung in den allgemeinen Blutkreislauf nicht ausgeschlossen.

Die Autoren von Arbeiten, in denen die Aussichten für den Einsatz von MSCs für lokale, systemische Transplantationen und Gentherapie aus der Sicht der Stromazellbiologie analysiert werden, sind in ihrer Argumentation vorsichtiger. Postnatales Knochenmark wird traditionell als ein Organ betrachtet, das aus zwei Hauptsystemen klar definierter Zelllinien besteht – dem hämatopoetischen Gewebe selbst und dem damit verbundenen unterstützenden Stroma. Daher wurden mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks ursprünglich ausschließlich als Quelle der stromalen Basis für die Produktion regulatorischer Faktoren des hämatopoetischen Mikromilieus betrachtet. Dann richtete sich die Aufmerksamkeit der Forscher auf die Untersuchung der Rolle von MSCs als Stammquelle von Skelettgewebe. Die neuesten Daten deuten auf ein unerwartetes Potenzial für die Differenzierung von Knochenmarkstromazellen mit der Bildung von Nerven- oder Muskelgewebe hin. Mit anderen Worten, mesenchymale Stammzellen weisen transgermale Plastizität auf – die Fähigkeit, sich in Zelltypen zu differenzieren, die phänotypisch nicht mit den Zellen des ursprünglichen Gewebes verwandt sind. Gleichzeitig bleiben einige Aspekte der Biologie von Knochenmarkstromazellen sowohl in allgemeiner biologischer Hinsicht als auch in einzelnen Details unklar und ungeklärt, darunter die Identifizierung, Natur, Herkunft, Entwicklung und Funktion von Knochenmarkstromazellen in vivo sowie das zulässige Differenzierungspotenzial ex vivo und die Möglichkeiten der therapeutischen Nutzung in vivo. Die gewonnenen Daten zum Potenzial von MSCs sowie die Ergebnisse von Studien zum regenerativen Potenzial anderer Stammzellen stehen in scharfem Widerspruch zu den in der Biologie etablierten Dogmen.

Bei geringer Kulturdichte bilden Knochenmarksstromastammzellen eindeutige Kolonien, die jeweils aus einer einzigen Vorläuferzelle stammen. Der Prozentsatz stromaler Vorläuferzellen in kernhaltigen Knochenmarkszellen, der durch die Fähigkeit zur Koloniebildung bestimmt wird, hängt stark von den Kulturbedingungen und der MSC-Spezies ab. Bei Nagetieren beispielsweise ist die Anwesenheit von bestrahlten Knochenmarks-Feederzellen und Serum in der Kultur absolut notwendig, um die maximale Anzahl stromaler Vorläuferzellen zu erhalten, während beim Menschen die Koloniebildungseffizienz mesenchymaler Stammzellen unabhängig vom Feeder und vom Kulturmedium ist. Die Anzahl bekannter mitogener Faktoren, die die Proliferation stromaler Vorläuferzellen stimulieren, ist begrenzt. Dazu gehören PDGF, EGF, FGF, TGF-b und IGF-1. Unter optimalen Kulturbedingungen können polyklonale MSC-Linien in vitro über 50 Zellteilungen überstehen, wodurch die Gewinnung von Milliarden von Knochenmarksstromazellen aus 1 ml ihres Aspirats möglich ist.

Die Population der Knochenmarkstromazellen ist jedoch heterogen, was sich sowohl in der Variabilität der Koloniegrößen und unterschiedlichen Bildungsraten als auch in der Vielfalt der Zellmorphologie äußert, die von fibroblastenartigen, spindelförmigen Zellen bis hin zu großen, flachen Zellen reicht. Während der Entwicklung solcher Kulturen wird nach 20 Tagen auch eine phänotypische Heterogenität festgestellt. Einige Kolonien sind durch eine hohe Expression von alkalischer Phosphatase gekennzeichnet, andere exprimieren sie überhaupt nicht, und Kolonien des dritten Typs sind im zentralen Bereich Phosphatase-positiv und in der Peripherie Phosphatase-negativ. Einzelne Kolonien bilden Knötchen aus Knochengewebe (der Beginn der Matrixmineralisierung wird durch Färbung mit Alizarinrot oder für Calcium nach Van Koss markiert). In anderen Kolonien kommt es zu Fettansammlungen, die durch G-Färbung mit Ölrot identifiziert werden können. Seltener bilden Kolonien mesenchymaler Stammzellen Knorpel, die mit Alcianblau gefärbt sind.

Nach ektopischer Transplantation in Versuchstiere bilden polyklonale MGK-Linien ektopischen Knochen mit einem retikulären Stroma, das mit Myelopoese und Adipozyten sowie seltener mit Knorpelgewebe assoziiert ist. Bei der Transplantation monoklonaler Linien von Knochenmarkstromazellen wird in einigen Fällen Chimärismus beobachtet, bei dem der De-novo-Knochen aus Knochengewebezellen besteht, Stroma und Adipozyten des Spenderursprungs enthält, während die Zellen der hämatopoetischen Linie und des Gefäßsystems vom Empfänger stammen.

Die Ergebnisse dieser Studien bestätigen die Stammnatur der Knochenmark-Stroma-Progenitorzelle, aus der die Klonlinie stammt. Sie weisen auch darauf hin, dass nicht alle in Kultur klonogenen Zellen wirklich multipotente Stammzellen sind. Einige Forscher glauben – und wir teilen ihre Meinung –, dass die zuverlässigsten Informationen über das tatsächliche Differenzierungspotenzial einzelner Klone nur in vivo nach der Transplantation gewonnen werden können und nicht durch die Bestimmung des Phänotyps ihrer Derivate in vitro. Die Expression phänotypischer Marker der Osteo-, Chondro- oder Adipogenese in der Kultur (bestimmt durch mRNA oder histochemische Techniken) und sogar die Produktion einer mineralisierten Matrix spiegeln nicht den Grad der Pluripotenz eines einzelnen Klons in vivo wider. Deshalb ist die Identifizierung von Stammzellen in einer Gruppe von Stromazellen nur a posteriori unter den entsprechenden Bedingungen eines biologischen Transplantationstests möglich. Insbesondere Chondrogenese wird in offenen Transplantationssystemen sehr selten beobachtet, während Knorpelbildung in geschlossenen Systemen wie Diffusionskammern oder In-vitro-Mikromassenkulturen von Stromazellen, wo ein lokal niedriger Sauerstoffdruck erreicht wird, der die Bildung von Knorpelgewebe fördert, keine Seltenheit ist. Daher beeinflussen sowohl die Transplantationstechnik als auch unspezifische In-vitro-Kulturbedingungen die Bandbreite der MSC-Differenzierung erheblich.

Die experimentelle Transplantation unter spezifizierten experimentellen Bedingungen ist der Goldstandard zur Bestimmung des Differenzierungspotenzials von Knochenmarkstromazellen und ein Schlüsselelement für deren Identifizierung. Historisch betrachtet werden Studien zur Knochenmarkstromazelltransplantation mit der allgemeinen Problematik der Knochenmarktransplantation in Verbindung gebracht. Es wurde festgestellt, dass durch die Transplantation von Knochenmarkstromazelllinien ein hämatopoetisches Mikroumfeld geschaffen wird, das die ektopische Entwicklung von hämatopoetischem Gewebe im Transplantationsgebiet ermöglicht. Da das Mikroumfeld vom Spender und das hämatopoetische Gewebe vom Wirt stammen, kann ektopischer Knochen als eine echte „invertierte“ Knochenmarktransplantation betrachtet werden. Die lokale Transplantation von Knochenmarkstromazellen fördert die effektive Korrektur von Knochendefekten, die ausgeprägter ist als bei spontaner reparativer Regeneration. Mehrere präklinische Studien an experimentellen Modellen haben die Möglichkeit des Einsatzes von Knochenmarkstromazelltransplantaten in der Orthopädie überzeugend belegt, obwohl selbst in einfachsten Fällen äußerst sorgfältige Arbeit und Analysen erforderlich sind, um diese Methoden zu optimieren. Insbesondere sind die optimalen Bedingungen für die Expansion osteogener Stromazellen ex vivo noch nicht geklärt, die Struktur und Zusammensetzung des idealen Trägers sowie die für die volumetrische Knochenregeneration notwendige Zellzahl sind noch nicht bekannt.

Neben der Verwendung ex vivo expandierter Knochenmarkstromazellen zur Regeneration mesenchymalen Gewebes eröffnet die ungewöhnliche Plastizität von MSCs potenzielle Anwendungen für die Regeneration neuronaler Zellen oder den Transport von Genprodukten in das ZNS. Dies vereinfacht prinzipiell die Zelltherapie bei Nervenschädigungen, da keine autologen menschlichen neuronalen Stammzellen gewonnen werden müssen. Mögliche Anwendungen von Knochenmarkzellen zur Erzeugung von Kardiomyozyten und myogenen Vorläuferzellen sowohl stromalen als auch extrastromalen Ursprungs wurden bereits beschrieben.

Es werden Experimente zur systemischen Transplantation von Knochenmarkstromazellen zur Behandlung häufiger Skeletterkrankungen durchgeführt. Es besteht kein Zweifel daran, dass Knochenmarkstromazellen die Population sind, die für genetische Störungen bei Skeletterkrankungen verantwortlich ist. Dies wird durch den Vektortransfer genetischer Informationen mithilfe dieser Zellen deutlich, der zur Bildung pathologischen Knochengewebes bei Versuchstieren führt. Die Fähigkeit von Stromazellen, sich nach der Einführung in den allgemeinen Blutkreislauf in Skelettknochen einzunisten, anzuwachsen, zu proliferieren und zu differenzieren, ist jedoch noch nicht nachgewiesen.

Dies liegt zum Teil daran, dass bei einer herkömmlichen Knochenmarktransplantation das Stroma nicht zusammen mit dem hämatopoetischen Gewebe transplantiert wird. Strenge Kriterien für die erfolgreiche Ansiedlung systemisch verabreichter Stromazellen müssen daher erst noch entwickelt werden. Es ist zu beachten, dass das Vorhandensein von Markergenen in Gewebeextrakten oder die Isolierung von Spenderzellen in Kultur nicht auf eine Ansiedlung der Zellen schließen lässt, sondern nur auf deren Überleben. Selbst die intraarterielle Injektion von Knochenmarkstromazellen in eine Mausgliedmaße kann zu nahezu keiner Ansiedlung führen, obwohl Spenderzellen in großer Zahl in der Mikrovaskulatur des Knochenmarks vorkommen. Leider werden solche Zellen meist allein aufgrund des Nachweises von Markergenen für Spenderzellen in der Ex-vivo-Kultur als „ansiedlungsfähig“ bezeichnet. Darüber hinaus müssen überzeugende Belege für die langfristige Integration differenzierter und funktionell aktiver Spenderzellen in die untersuchten Gewebe erbracht werden. In vielen veröffentlichten Arbeiten über die Transplantation von Knochenmarkstromazellen in das Skelett fällt das Fehlen eindeutiger Daten dieser Art auf. Es ist jedoch anzumerken, dass einige korrekte Tierversuche tatsächlich eine begrenzte, aber tatsächliche Transplantation von Stroma-Progenitorzellen nach ihrer systemischen Verabreichung nachgewiesen haben.

Diese Daten decken sich mit den Ergebnissen von Studien zur Möglichkeit, myogene Knochenmarks-Progenitorzellen über das Gefäßsystem in den Muskel zu transportieren. Es darf jedoch nicht vergessen werden, dass sowohl Skelett- als auch Muskelgewebe während der Entwicklung und des Wachstums auf der Grundlage extravaskulärer Zellbewegungen gebildet werden, die Migrationsprozesse ohne Beteiligung der Blutzirkulation nutzen. Sollte ein unabhängiger Kreislaufweg für den Transport von Progenitorzellen in Festphasengewebe existieren, kann man dann von der Existenz physiologisch zirkulierender mesenchymaler Progenitorzellen ausgehen? Woher stammen diese Zellen sowohl im sich entwickelnden als auch im postnatalen Organismus, und wie durchdringen sie die Gefäßwand? Die Lösung dieser Fragen erscheint zwingend erforderlich und erfordert sorgfältigste präklinische Analysen. Selbst nach der Beantwortung dieser Fragen bleiben problematische kinetische Aspekte im Zusammenhang mit dem Skelettwachstum und dem Bindegewebsumbau ungeklärt. Gleichzeitig erscheint die Behandlung von Osteogenesestörungen durch den Ersatz der gesamten Population mutierter Skelett-Progenitorzellen durch gesunde Stromaelemente eine realistische klinische Perspektive. Dabei können lokale Bruchzonen oder Deformationen aufgrund pathologischer Osteogenese sowie destruktive Veränderungen des Knochengewebes mit Hilfe von in vitro kultivierten Stromastammzellen korrigiert werden. Daher empfiehlt es sich, zukünftige Forschungen auf die Problematik der Transformation bzw. genetischen Korrektur autologer mutierter osteogener Vorläuferzellen ex vivo zu konzentrieren.

Die gentechnische Veränderung von Zellen, ob kurzzeitig oder dauerhaft, bildet die Grundlage der Zell- und Molekularbiologie und ist Quelle zahlreicher wissenschaftlicher Erkenntnisse über die Rolle einzelner Proteine im Zellstoffwechsel in vitro und in vivo. Der Einsatz molekularer Technologien zur Korrektur erblicher Pathologien und menschlicher Erkrankungen ist für die praktische Medizin vielversprechend, da die Eigenschaften von Knochenmarkstroma-Stammzellen die Entwicklung einzigartiger Transplantationsschemata zur Korrektur genetischer Skeletterkrankungen ermöglichen. Mesenchymale Vorläuferzellen können zudem leicht vom zukünftigen Empfänger gewonnen werden, sind genetisch manipulierbar und können sich in kurzer Zeit in großen Mengen vermehren. Die Verwendung mesenchymaler Stammzellen ermöglicht es, die Einschränkungen und Risiken zu vermeiden, die mit der direkten Übertragung genetischen Informationsmaterials an den Patienten über intravaskuläre Vektorkonstrukte verbunden sind. Eine ähnliche Strategie ist auf embryonale Stammzellen anwendbar, jedoch sind autologe postnatale Knochenmarkstromazellen das bevorzugte Material, da ihre Einführung mögliche immunologische Komplikationen nach der Transplantation ausschließt. Um einen kurzfristigen Effekt zu erzielen, beispielsweise um die Knochenregeneration zu beschleunigen, ist die genetische Modifikation mesenchymaler Stammzellen mittels Elektroporation, chemischer Fusion, Lipofektion, Plasmiden und adenoviralen Konstrukten die optimalste Methode. Insbesondere die virale Transfektion in Knochenmarkstromazellen BMP-2 hat sich bei der Beschleunigung der Knochenregeneration bei experimentellem Polytrauma als wirksam erwiesen. Die Erzeugung adenoviraler Vektorkonstrukte ist aufgrund ihrer fehlenden Toxizität vorzuziehen. Die genetische Modifikation von Knochenmarkstromazellen ist in diesem Fall jedoch durch eine extrem geringe Stabilität gekennzeichnet. Darüber hinaus erfordern normale transformierte Knochenmarkstromazellen die Verwendung von Vektorträgern genetischer Informationen, die zehnmal infektiöser sind als andere Zelltypen, was die Sterberate transfizierter Zellen deutlich erhöht.

Die Behandlung rezessiver Erkrankungen, die durch eine geringe oder fehlende biologische Aktivität bestimmter Gene verursacht werden, erfordert eine langfristige oder permanente Modifikation mesenchymaler Stammzellen. Dies erfordert den Einsatz von Adeno-assoziierten Viren, Retroviren, Lentiviren oder adeno-retroviralen Chimären. Die Transportregionen dieser Viren sind in der Lage, große DNA-Transfekte (bis zu 8 kb) zu übertragen. In der wissenschaftlichen Literatur wurde bereits über die exogene biologische Aktivität von Knochenmarkstromazellen berichtet, die mit retroviralen Konstrukten transfiziert wurden, die für die Synthese von regulatorischen und Markermolekülen – IL-3, CD2, Faktor VIII sowie Enzymen, die an der Synthese von L-DOPA beteiligt sind – kodieren. Doch auch in diesen Studien weisen die Autoren auf eine Reihe von Einschränkungen hin, die vor der praktischen Anwendung dieser Technologie überwunden werden müssen. Das erste Problem besteht darin, den Prozess der MSC-Modifikation ex vivo zu optimieren. Es ist bekannt, dass eine langfristige (3-4 Wochen) Proliferation von Knochenmarkstromazellen in vitro deren Transfektion reduziert. Um ein hohes Maß an genetischer Modifikation von MSCs zu erreichen, sind mehrere Transfektionszyklen erforderlich. Ein zweites Problem hängt mit der Dauer der therapeutischen Genexpression zusammen, die derzeit nicht mehr als vier Monate beträgt. Ein natürlicher Rückgang der effektiven Genexpression ist auf die Inaktivierung des Promotors und den Tod modifizierter Zellen zurückzuführen. Angesichts der allgemeinen Aussichten für die Übertragung genetischer Informationen mittels mesenchymaler Stammzellen deuten die Ergebnisse vorläufiger Studien darauf hin, dass die Ex-vivo-Transfektionsmethoden weiter optimiert werden müssen, ein geeigneter Promotor zur Regulierung der biologischen Aktivität in die gewünschte Richtung gewählt werden muss und die Fähigkeit modifizierter Knochenmarkstromazellen zur Selbsterhaltung in vivo nach der Transplantation erhöht werden muss. Es ist zu beachten, dass die Verwendung retroviraler Konstrukte zur Modifikation von Knochenmarkstromazellen in die gewünschte Richtung nicht immer deren obligatorische Transplantation erfordert. Transfizierte mesenchymale Stammzellen können vor dem Hintergrund einer stabilen Residuenlage und ohne obligatorische aktive physische Eingliederung und Funktion im Bindegewebe eine korrigierende Funktion erfüllen. In diesem Fall sollten sie als biologische Minipumpe betrachtet werden, die in vivo einen Faktor produziert, dessen Mangel die Manifestation einer genetischen Pathologie bestimmt.

Die Verwendung transformierter Knochenmarksstromazellen zur Behandlung dominanter genetischer Pathologien, die durch die Expression eines Gens mit pathologischer oder anomaler biologischer Aktivität gekennzeichnet sind, ist wesentlich problematischer, da in diesem Fall die Übertragung oder Implementierung verzerrter genetischer Informationen blockiert werden muss. Eine der Methoden der Gentechnik ist die homologe Rekombination embryonaler Stammzellen zur Erzeugung transgener Tiere. Der extrem niedrige Grad homologer Rekombination in Verbindung mit den Problemen der Identifizierung, Trennung und Expansion solcher Rekombinanten wird jedoch wahrscheinlich nicht dazu beitragen, dass diese Methode in naher Zukunft weite Verbreitung findet, selbst wenn neue technologische Methoden entwickelt werden. Der zweite Ansatz in der Gentherapie dominanter Pathologien basiert auf der automatischen Korrektur geschädigter DNA, da genetische Mutationen durch die Einführung exogener DNA mit der gewünschten Sequenz (kurze DNA-Oligonukleotide oder chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide) korrigiert werden, die an Homologe im geschädigten Genom bindet. Bei der dritten Option geht es darum, die Übertragung pathologischer Informationen zu blockieren. Dies wird durch den Einsatz speziell entwickelter Oligonukleotide erreicht, die an ein bestimmtes Gen binden und eine ternäre Helixstruktur bilden, die die Möglichkeit einer Transkription ausschließt.

Obwohl die Korrektur einer genetischen Erkrankung auf Genomebene nach wie vor die optimale und bevorzugte Therapiemethode darstellt, ist mRNA auch ein vielversprechender (und möglicherweise sogar leichter zugänglicher) Vektor zur Blockierung eines dominant-negativen Gens. Proteinmoleküle mit Antisense-Oligonukleotiden oder vollständigen Sequenzen, die die mRNA-Bindung an den zellulären Biosyntheseapparat blockieren, werden seit langem eingesetzt, um die Translation zu hemmen und/oder den mRNA-Abbau zu beschleunigen. Doppelsträngige RNA induziert zudem einen schnellen mRNA-Abbau, dessen Mechanismus noch unklar ist. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die bloße Eliminierung von mRNA, die von einem mutierten Allel mit kurzen oder einzelnen Mutationen transkribiert wird, die Expression von mRNA des normalen Allels fördert. Eine Alternative ist die Verwendung von Hammerhead- und Hairpin-Ribosynthesen, die an hochspezifische mRNA-Regionen binden und deren Spaltung und Inaktivierung während der Translation induzieren können. Die Möglichkeit des Einsatzes dieser Methode in der Therapie der pathologischen Osteogenese wird derzeit untersucht. Unabhängig davon, was genau das Ziel ist – genomische oder zytoplasmatische Elemente – wird der Erfolg neuer Gentherapietechnologien von der Effizienz der Aufnahme von Reagenzien in Knochenmarkstromazellen ex vivo, der optimalen Wahl eines spezifischen Vektors und der stabilen Fähigkeit mesenchymaler Stammzellen, die notwendigen Faktoren in vivo zu exprimieren, abhängen.

Die Entdeckung mesenchymaler Stammzellen mit ihren unerwarteten Eigenschaften schafft somit ein neues konzeptionelles Schema für die Entwicklung von Zelllinien. Weitere interdisziplinäre Forschung ist jedoch erforderlich, um die biologische Rolle stromaler Stammzellen, ihre Natur, ihre Fähigkeit zur Transdifferenzierung oder Dedifferenzierung, ihre physiologische Bedeutung während der Embryonalentwicklung, des postnatalen Wachstums, der Reifung und Alterung sowie bei menschlichen Erkrankungen zu verstehen.