Hämopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut

Gut für proliferative Potenzial und die Chancen repopulyatsionnym hämatopoetischen Zellquelle von hämatopoetischen Stammzellen wirkt als Nabelschnurblut. Gezeigt wiederholt, dass die Zeit der Geburt die Nabelschnur Blut eine ausreichend große Anzahl von schwach begangen Vorläufern Hämatopoese enthält. Einige Autoren glauben, dass der Vorteil der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen von Nabelschnurblut keine Notwendigkeit, einen Spender kompatibel für HLA-Antigene zu finden. Nach ihnen, die Unreife des Immunsystem Ursache des Neugeborenen verringerte funktionelle Aktivität von immunkompetenten Zellen und dementsprechend niedriger als in Knochenmarktransplantation, die Inzidenz der schweren Reaktion „Graft versus Host“. In dieser Zelle Transplantation das Überleben von Nabelschnurblut nicht niedriger ist als die Knochenmarkzellen, auch im Fall einer kleineren Anzahl von GSK unter Verwendung von je 1 kg Patientengewicht verabreicht. Aber aus unserer Sicht die optimale Anzahl von Fragen Nabelschnurblutzellen für eine effiziente Einpflanzung in dem Körper des Empfängers, ihre immunologischen Verträglichkeit notwendig transplantierte und eine Reihe anderer Aspekte der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut ernsterer Analyse erfordert.

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Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

Das Verfahren für die hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut erhalten werden erfordert seine Aufnahme unmittelbar nach der Geburt und seine Trennung von der Plazenta, wenn die Plazenta in utero oder ex utero ist, sowie für Kaiserschnitt, sondern auch ex utero. Es wird gezeigt, dass im Falle einer Verkürzung der Zeit von der Geburt bis zur Trennung des Neugeborenen von der Plazenta auf 30 Sekunden das Volumen des erhaltenen Nabelschnurblutes durchschnittlich um 25 bis 40 ml zunimmt. Mit einem späteren Verfahren ist die gleiche Menge an Blut verloren. Es ist erwiesen, dass die frühe Trennung des Kindes vom Nachbrennen keine negativen Folgen für das Neugeborene hat.

Das russische Forschungsinstitut für Hämatologie und Bluttransfusion entwickelten effektive und kostengünstige Technologie sowohl für Nabelschnurblut bei physiologischen Linien ((70,2 + 25,8) ml) und Sectio ((73,4 + 25,1) ml). Ein Verfahren zur Trennung von Nabelschnurblut mit einer ausreichend hohen Ausbeute an mononukleären Zellen und nukleierten - (83,1 + 9,6) und (83,4 + 14,1)% betragen. Verbessertes Verfahren für die Kryokonservierung von Nabelschnurblut, die eine hohe Sicherheit der einkernigen Zellen und CFU-GM gewährleistet, - (96,8 + 5,7) und (89,6 + 22,6)% betragen. Die Effizienz der Entwässerungsmethode der Nabelschnurblutprobenahme mit dem "Kompoplast-300" -Behälter (Russland) wurde bestimmt. Fence Nabelschnurblut Autoren unmittelbar nach der Geburt und seine Trennung von der Plazenta, in Bezug auf die Platzierung der Plazenta in der Gebärmutter oder ex utero. Vor dem Einstich der Nabelvene Nabelschnur einmal mit 5% Jodtinktur behandelt und dann zweimal - 70% Ethylalkohol. Das Blut floss spontan durch die Verbindungsschläuche zum Behälter. Die Dauer des Zauns dauerte nicht mehr als 10 Minuten. 66 gesammelt Drainage-Volume-Verfahren umbilical Blutproben gemittelt (72 + 28) ml, und die Anzahl der Leukozyten in der Probe gemittelt full - (1,1 + 0,6) x x 107. Die Analyse von Nabelschnurblut auf Sterilität (bakterieller Kontamination, HIV-1-Viren der Hepatitis B und C, Syphilis und Cytomegalovirus-Infektion) in nur eine Probe wurden in einer weiteren Studie einmal die Plazenta nach der Geburt fötale Oberfläche wurde nach unten auf einem speziellen Rahmen platziert IgG-Antikörper gegen Hepatitis-C identifiziert wurde der Kord mit 5% igem behandelt Jod und 75% Ethyl th Alkohol. Die Venen der Nabelschnur wurden mit einer Nadel aus dem Transfusionssystem (G16) abgelassen. Das Blut lief spontan in den Behälter ab. Das auf diese Weise entnommene Blutvolumen betrug durchschnittlich (55 + 25) ml. Das Papier G. Kogler et al (1996) Nabelschnurblut entnommen geschlossener Weg und erhielt große Mengen von Blut - im Durchschnitt (79 + 26) ml. Die Autoren stellen fest, dass unter den 574 Nabelschnurblutproben enthalten etwa 7% weniger als 40 ml Blut, das sie nicht zu verwenden für die Transplantation nicht gestattet. K. Isoyama et al (1996), das Nabelschnurblut durch aktive exfusion Einnahme Spritzen verwenden, erhielten durchschnittlich 69,1 ml Blut (Nabelschnurblut Volumen von 15 bis 135 ml variiert). Schließlich A. Abdel-Mageed PI Mitarbeiter (1997) von punovinnoy Vene Katheterisierung wurden in durchschnittlich 94 ml Nabelschnurblut (56 bis 143 ml) erhalten.

Um das Risiko einer iatrogenen Infektion und Kontamination durch mütterliche Sekrete geschlossenes System Blutentnahme entwickelt zu reduzieren basiert auf dem weit verbreiteten transfuzioinoy System Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), mit 62,5 ml CPDA (Citrat-Phosphat-Dextrose mit Adenin) als Antikoagulans. Die Technologie zur Gewinnung des Materials ist für die Herstellung einer qualitativen Probe in Bezug auf das Volumen, den Gehalt und die Reinheit der Zellsuspension von primärer Wichtigkeit. Von den bestehenden Methoden des Nabelschnurblut, kotoryeuslovno klassifizierte in geschlossenen, halboffene und offene System sleduetotdavat Präferenz zuerst, wie in einem geschlossenen System signifikant das Risiko einer mikrobiellen Kontamination des Materials reduziert, sowie eine Verunreinigung der Zellsuspension der Mutterzelle.

A. Nagler und Co-Autoren (1998) führten eine vergleichende Analyse der Wirksamkeit aller drei Nabelschnurblut-Probenahmesysteme durch. In der ersten Variante wurde das Verfahren in einem geschlossenen System durch Exfusion von Blut direkt in den Behälter durchgeführt. In der zweiten Variante wurde Nabelschnurblut nach der Methode der aktiven Blutabnahme von Spritzen1 mit weiterem Waschen der Venen der Plazenta und gleichzeitiger Blutabfuhr in den Behälter gewonnen (offene Methode). Bei der dritten Variante wurde das Blut in einem halboffenen System entnommen, indem es aktiv mit Spritzen extrahiert und durch die Nabelschnurarterie mit gleichzeitiger Exfusion in den Behälter gewaschen wurde. In der ersten Version erhielten die Autoren Nabelschnurblut im Volumen (76,4 + 32,1) ml mit einer Leukozytenzahl (10,5 + 3,6) × 10 ⁶ pro 1 ml Blut. In der zweiten Variante waren die entsprechenden Indizes (174,4 + 42,8) ml und (8,8 + 3,4) × 10 ⁶ / ml; im dritten - (173,7 + 41,3) ml und (9,3 + 3,8) × 10 ⁶ / ml. Die häufigste Infektion von Nabelschnurblutproben wurde bei Verwendung eines offenen Systems festgestellt. Eine direkte Korrelation zwischen der Plazenta-Masse und dem Volumen des extrahierten Blutes wird festgestellt - mit zunehmender Plazenta-Masse erhöht sich die Menge an gesammeltem Blut.

Nach der Entnahme von Nabelschnurblut folgt der Trennschritt - Isolierung von mononukleären Zellen und Reinigung der Zellsuspension von Erythrozyten. Unter den experimentellen Bedingungen werden die kernhaltigen Zellen durch die Methode ihrer Sedimentation mit Methylcellulose während der Lyse von Ammonium-Erythrozyten durch Chlorid isoliert. Für klinische Zwecke sollte jedoch Methylcellulose nicht verwendet werden, da der Verlust an hämatopoetischen Stammzellen 50-90% erreicht. Lysieren rotes Blutkörperchen im Zusammenhang mit großen Volumina der Arbeitslösung in der Klinik auch kaum durchgeführt, obwohl der Anteil der Trennung auf diese Weise Zellen mit dem Phänotyp CD34 + nukleiert und Vorläuferzellen CFU-GM-Funktionen und CFU-GEMM deutlich höher. Ein neues Agens zur Isolierung von mononukleären Zellen in der Dichtegradienten-Lösung (BDS72) wurde beschrieben. Diese Substanz hat die folgenden physiologischen Parameter: pH - 7,4, Osmolalität - 280 mosm / kg, Dichte - 1,0720 g / ml. Den Autoren zufolge ist es mit ihrer Hilfe möglich, bis zu 100% der CD34-positiven Zellen zu isolieren und 98% der roten Blutkörperchen zu entfernen. Die Klinik wendet BDS72 noch nicht an.

Bei bewährten Verfahren zum Isolieren kernhaltiger Zellen aus Nabelschnurblut wird üblicherweise eine 10% ige Lösung von Hydroxyethylstärke oder eine 3% ige Gelatinelösung verwendet. Die Effizienz der Fällung von Erythrozyten und die Isolierung von kernhaltigen Zellen ist in beiden Fällen ungefähr gleich. Wenn jedoch Gelatine als Sedimentationsmittel verwendet wird, ist es möglich, eine etwas größere Menge an CFU-GM als mit Hydroxyethylstärke zu erhalten. Es wird angenommen, dass der Unterschied in der Wiedergewinnungseffizienz CFU-GM ungleicher Geschwindigkeit aufgrund der Ablagerung von einzelnen Fraktionen oder nukleierte Zellen Fähigkeit HES-Moleküle auf hämatopoetischen Zelloberflächenrezeptoren absorbierten und dadurch ihre Empfindlichkeit gegenüber koloniestimulierende Faktoren blockieren, die verwendet werden, wenn in-vitro-CFU-GM Kultivierung. Nichtsdestoweniger können beide Sedimentierer gut zur Isolierung von kernhaltigen Zellen geeignet sein, wenn groß angelegte Nabelschnurblutbanken erzeugt werden.

Methoden der Trennung und der Kryokonservierung von Nabelschnurblut im Prinzip nicht von denen, die in den hämatopoetischen Stammzellen des peripheren Blutes und des Knochenmarks von erwachsenen Spendern anzuwenden. Bei der Vorbereitung einer großen Anzahl von Nabelschnurblutproben für ihre Banken müssen die Trennmethoden jedoch vor allem kostengünstig sein. Daher werden nun leider für klinische Bedürfnisse bereits routinemäßige Methoden der Isolierung und Kryokonservierung von Nabelschnurblutzellen eingesetzt, und effektivere, aber finanziell wirksame Methoden bleiben den Experimentatoren vorbehalten.

Insgesamt Bewertungskriterien selbst Anforderungen hämatopoetischen Zellzahl festgelegt und auf die Untersuchung von Nabelschnurblutproben, um Infektionserreger zu erkennen. Um die Transplantation von hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen sicherzustellen, müssen alle Blutproben primär auf hämatogene Infektionen und genetische Krankheiten untersucht werden. Einige Autoren empfehlen zusätzliche spezielle Methoden der Untersuchung von Nabelschnurblut zur Diagnose von genetischen Krankheiten wie Thalassämie und Sichelzellanämie, Adenosindesaminase-Mangel, Agammaglobulinämie Bruton, Krankheit Harlera und Punter.

Nach den Empfehlungen Ticheli L. Et al (1998), die in jeder Probe von Nabelschnurblut ist notwendig, die Anzahl von nukleierten Zellen, SB34-positive Zellen und CFU-GM, tragen HLA-Typisierung zur Bestimmung der Blutgruppen ABO und Rh seiner Mitgliedschaft zu bestimmen. Zusätzlich wird seeding bakteriologische, serologische Tests für HIV-Infektion und CMV, HBsAg, Hepatitis C, HTLY-I und HTLV-II (T-Zell-Leukämie, human), Syphilis, Toxoplasmose getragen. Eine Polymerasekettenreaktion auf Cytomegalovirus und HIV-Infektion ist obligatorisch.

Das Verfahren zur Gewinnung von Nabelschnurblut sollte in strikter Übereinstimmung mit den Prinzipien der medizinischen Bioethik durchgeführt werden. Vor dem Beginn der Blutabnahme ist es notwendig, die Zustimmung der schwangeren Frau für ihre Durchführung zu erhalten. Vorgespräch mit der schwangeren Frau informierte Zustimmung zu erhalten alle Manipulationen durchzuführen, da Blut exfusion Füllung und Fertigstellung von Dokumenten ist nur von Medizinern durchgeführt. In jedem Fall unzulässig eines dieser Verfahren durch Personal mit biologischen, chemischen, pharmazeutischen und anderen nicht-medizinischen Ausbildung, im Hinblick auf die Verletzung der etablierten Normen der Bioethik und Menschenrechte durchzuführen. Für positive Tests für HBsAg Träger, Antikörper gegen den Erreger der Hepatitis C, HIV und Syphilis Nabelschnurblut nicht getroffen, und die gesammelten Blutproben bereits verworfen und zerstört. Es soll beachtet werden, dass die Beförderung von latenten Infektionen bei Neugeborenen ist viel seltener als bei Erwachsenen, also die Wahrscheinlichkeit, hämatogene Transfers und Entwicklung von infektiösen Komplikationen von hämatopoetischen Infusionen von Nabelschnurblutzellen ist deutlich geringer als bei der Transplantation von Knochenmark von erwachsenen Spendern.

Ein wichtiger Punkt bei der Anwendung von Nabelschnurblut in der Klinik ist die Beurteilung der Transplantation, die auf der Bestimmung der Anzahl hämatopoetischer Stammzellen in der Nabelschnurblutprobe und der für die Transplantation erforderlichen Zelldosen beruht. Standards für die optimale Anzahl von Nabelschnurblutzellen, die für die Transplantation benötigt werden, sind noch nicht entwickelt worden. Es gibt keinen allgemein akzeptierten Standpunkt, selbst bei solchen Routineparametern wie der Anzahl von CD34-positiven Zellen und CFU-GM. Einige Autoren bewerteten das Potential von hämatopoetischen Zellen durch Analyse der langfristigen Kulturen mit Bestimmung des Gehalts von koloniebildenden Einheiten gemeinsam Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten - CFU-GEMM.

In klinischen Studien umfasst die Standardbewertung der Nabelschnurbluttransplantation jedoch üblicherweise nur die Bestimmung der Anzahl der kernhaltigen oder mononukleären Zellen.

Lagerung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

Einige Probleme bestehen in der Technologie zur Aufbewahrung von blutbildenden Nabelschnurblutzellen. Wenn die Kryokonservierung von hämatopoetischen Stammzellen, um ihren optimalen Gefriermodus zu erreichen, muss die Menge an Nabelschnurblut und roter Blutkörperchen zuvor entfernt minimiert Hämolyse und das Risiko einer Unverträglichkeitsreaktion von Erythrozyten-Antigenen (ABO, Rh) zu vermeiden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren zur Isolierung von kernhaltigen Zellen geeignet. In den frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts die am weitesten verbreitete Methode der kernhaltigen Zellen in einem Dichtegradienten Trennung basierend auf Ficoll mit einer Dichte von 1,077 g / ml, oder Perkolation mit der Dichte 1,080 g / ml. Die Trennung von Nabelschnurblut im Dichtegradienten ermöglicht die Isolierung vorwiegend mononukleärer Zellen, führt jedoch zu signifikanten Verlusten an hämatopoetischen Vorläuferzellen - bis zu 30-50%.

Die Sedimentationseffizienz von Hydroxyethylstärke bei der Isolierung von Nabelschnurblutzellen wird auf verschiedene Arten geschätzt. Einige Autoren weisen auf eine schlechte Trennungsqualität mit dieser Methode hin, während andere Forscher im Gegensatz zu allen möglichen Methoden es vorziehen, HSC-Nabelschnurblut genau unter Verwendung einer 6% igen Lösung von Hydroxyethylstärke zuzuordnen. Dies unterstreicht die hohe Effizienz der Sedimentation hämatopoetischer Zellen, die nach einigen Daten von 84% bis 90% reicht.

Anhänger von einem anderen Blickwinkel denken, dass fast alle Fraktionierungsprozesse große Verluste yadrosoderzhashih Zellen beinhalten und bieten Trennung machen durch Zentrifugieren, Trennen des Nabelschnurblutes in 3 Fraktionen: Erythrozyten, Leukozyten und Plasmaring. 90, 88 und 100% der ursprünglichen Ebene Trennung der Zellen auf diese Weise haben die Erfinder festgestellt, dass der Gehalt der mononuklearen Zellen von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen und Zellen mit CD34 + Immunophänotyp letztlich jeweils war. Ähnliche Mengen an gereinigtem Wachstum in diesem Verfahren von Nabelschnurblutzellen von anderen Forschern erhalten: nach der Sedimentation 92% zugeteilt Nukleiert, 98% - einkernigen, 96% - CD34-positiven Zellen und 106% der koloniebildenden Einheiten.

In den späten 1990er Jahren wurde Gelatine weit verbreitet als Sedimentationsmittel verwendet. In der klinischen Praxis wurden seit 1994 mit Hilfe von Gelatine hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut isoliert. Wenn eine 3% ige Gelatinelösung verwendet wird, erreicht die Effizienz der Isolierung von kernhaltigen Zellen 88-94%. Die weit verbreitete Verwendung von Gelatine bei der Entwicklung der Nabelschnurblutbank hat ihre Vorteile gegenüber anderen Sedimentationsmitteln bestätigt. Vergleichende Analyse der alle oben genannten Verfahren zur Isolierung von kernhaltigen Zellen im Hinblick auf ihre sequenzielle Verwendung in jedem der Testnabelschnurblutproben zeigten, dass die optimalen Sedimentator-out einkernigen Zellen mit dem Phänotyp CD34 + / CD45 +, sowie durch die Anzahl der CFU-GM und CFU-GEMM beträgt 3% Gelatinelösung. Es erwies sich als signifikant weniger wirksam sein Methoden Ficoll-Dichtegradienten unter Verwendung von und die Verwendung von Methylcellulose und Hydroxyethylstärke in dem hämatopoietischen Zellverlust von 60% erreicht.

Die Erweiterung des Umfangs der Stammzelltransplantation von Nabelschnurblut ist nicht nur mit der Entwicklung von Methoden zu deren Herstellung, sondern auch mit der Lagerung verbunden. Es gibt viele Probleme, die direkt mit der Herstellung von Nabelschnurblut für die Langzeitlagerung und die Auswahl der optimalen Kryokonservierungstechnologie für seine Proben verbunden sind. Unter ihnen sind die Probleme der Zweckmäßigkeit der Durchführung von Trennverfahren, die Verwendung verschiedener Kryokonservierungsmedien und die Verwendung von Verfahren zur Vorbereitung von aufgetauten Zellen für die Transplantation. Der Transport von nativen Proben von Nabelschnurblut wird häufig aus Regionen fern von hämatologischen Zentren durchgeführt. In diesem Zusammenhang stellt sich das Problem der zulässigen Aufbewahrungsfristen für Nabelschnurblut vom Zeitpunkt ihres Eingangs bis zum Beginn der Kryokonservierung, was für die Entwicklung von Nabelschnurblutbanken von besonderer Bedeutung ist.

Die Untersuchung der funktionellen Aktivität von hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen nach einer Langzeitlagerung (bis 12 Jahre) in flüssigem Stickstoff ergab, dass etwa 95% der hämatopoetischen Zellen während dieser Zeit nicht ihre hohe Vermehrungsfähigkeit verlieren. Das Papier Yurasova S. Et al (1997) zeigte, dass Nabelschnurblut bei Raumtemperatur gelagert (22 ° C) oder bei 4 ° C für 24 und 48 Stunden nicht wesentlich die Lebensfähigkeit der hämatopoetischen Zellen reduzieren, dass die Anfangsstufe ist geeigneterweise 92 und 88%. Wenn jedoch die Lagerungszeit auf drei Tage verlängert wird, ist die Anzahl lebensfähiger kernhaltiger Zellen im Nabelschnurblut signifikant reduziert. Gleichzeitig wurde während anderer Studien gefunden, dass, wenn sie für 2-3 Tage bei einer Temperatur von 22 oder 4 ° C gelagert werden, die Lebensfähigkeit von reifen Granulocyten eher als von hämatopoetischen Zellen hauptsächlich betroffen ist.

Die Lebensfähigkeit von hämatopoetischen Stammzellen von Nabelschnurblut kann durch Systemkomponenten für seine Sammlung beeinträchtigt werden. Analyse der Wirkung von verschiedenen Antikoagulantien, welcher Wirkmechanismus zur Bindung von Calciumionen (ACD, EDTA, XAPD-1) für hämatopoetische Vorläuferzellen im Nabelschnurblut Lagerbedingungen von 24 bis 72 Stunden ergab, die negativen Auswirkungen auf der Lebensfähigkeit der Zellen mit Zellkern zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang empfehlen die Autoren die Verwendung von PBS (Phosphatpufferlösung) unter Zusatz von nativem Heparin ohne Konservierungsmittel in einer Konzentration von 20 U / ml, die in ihrer Meinung es ermöglicht, die Dauer der Lagerung unfraktioniertem Nabelschnurblut bis zu 72 Stunden zu erhöhen, und speichern die funktionelle Aktivität von koloniebildenden Einheiten. Bei der Untersuchung der Sicherheit von CFU-GM und CFU-G wird jedoch gezeigt, dass die Lagerzeit für Nabelschnurblut vor der Kryokonservierung neun Stunden nicht überschreiten sollte. Offensichtlich sollte in diesem Fall das Prinzip handeln, wenn es widersprüchliche Daten ist die empfohlene Mindest Nabelschnurblut Haltbarkeit verwenden sollten, und eine programmierbare Einfrieren isolierten Zellen so schnell wie möglich beginnen.

Beim Einfrieren von hämatopoetischen Stammzellen von Nabelschnurblut wird üblicherweise eine 10% ige Lösung von DMSO als Kryoprotektor verwendet. Jedoch hat Dimethylsulfoxid in dieser Konzentration zusätzlich zu dem ausgedrückten kryoprotektiven Effekt eine direkte zytotoxische Wirkung, selbst unter der Bedingung einer minimalen Exposition gegenüber den blutbildenden Zellen des Nabelschnurbluts. Um die zytotoxische Wirkung von DMSO zu reduzieren, werden eine Null-Expositionstemperatur, eine Erhöhung der Geschwindigkeit aller Manipulationen und ein wiederholtes Waschen nach dem Auftauen von Nabelschnurproben angewendet.

Das Institut für Hämatologie und Transfusiologie der Akademie der Medizinischen Wissenschaften der Ukraine entwickelt seit 1995 eine wissenschaftliche Leitung, deren Ziel es ist, das Nabelschnurblut als alternative Quelle von Stammzellen zu untersuchen. Insbesondere wurden neue Technologien zur Tieftemperatur-Kryokonservierung hämatopoetischer Zellen aus unfraktioniertem und fraktioniertem Nabelschnurblut entwickelt. Als Kälteschutzmittel wird medizinisches Polyvinylpyrolidon mit niedrigem Molekulargewicht verwendet. Die Methode der Kryokonservierung von unfraktioniertem Nabelschnurblut basiert auf der ursprünglichen Technologie der Vorpräparation von Zellen zum Einfrieren und der Technik der speziellen Behandlung von Zellsuspension unmittelbar vor der Transplantation.

Einer der wichtigsten Faktoren, die das Niveau der funktionellen Aktivität von kryokonservierten hämopoetischen Stammzellen beeinflussen, ist die Abkühlgeschwindigkeit der Zellsuspension, insbesondere während der Kristallisationsphase. Ein Software-Ansatz zur Lösung des Problems der Geschwindigkeit und der Einfrierzeit bietet große Möglichkeiten, einfache und hochwirksame Methoden der Kryokonservierung zu entwickeln, ohne die Zellsuspension vor der Transplantation von Kryoprotektoren abzuwaschen.

Die Stadien des sofortigen Einfrierens und Auftauens sind für die Lebensfähigkeit der Zellen während ihrer Herstellung am gefährlichsten. Beim Einfrieren der hämatopoetischen Zellen kann ein bedeutender Teil von ihnen im Moment des Übergangs des interzellulären Mediums von der flüssigen zur festen Phase - Kristallisation - zerstört werden. Um den Prozentsatz des Zelltods zu verringern, werden Kryoprotektiva verwendet, deren Wirkungsmechanismen und ihre kryoprotektive Wirksamkeit in der wissenschaftlichen Literatur angemessen behandelt worden sind.

Eineine vielversprechende Richtung Optimierungstechniken der Kryokonservierung von Knochenmark und Nabelschnurblut-Zellen sind in der gleichen Lösung zu niedrigeren Konzentrationen von Gefrierschutzmitteln mit verschiedenen Wirkmechanismen, beispielsweise zu kombinieren, auf dem intrazellulären Pegel von DMSO wirkenden und Hydroxyethylstärke oder Albumin besitzt extrazelluläre umschließenden Wirkung.

Für die Kryokonservierung von Nabelschnurblut-Zellen, die traditionell 20% DMSO-Lösung verwendet werden, die zu erreichen, gleich langsam gegossen in die Zellsuspension wurde permanent mechanisch ist, in einem Eisbad gerührt werden (1: 1) das Volumenverhältnis von Zellsuspension und dem Gefrierschutzmittel. Die Endkonzentration von Dimethylsulfoxid beträgt 10%. Die Zellsuspension wurde mit einer Geschwindigkeit krioustanovke HS / min bis -40 ° C auf einem Programm, abgekühlt, wonach die Abkühlgeschwindigkeit auf 10ºC / min erhöht wurde. Nach Erreichen von -100 ° C wird der Behälter mit der Zellsuspension in flüssigen Stickstoff (-196 ° C) gegeben. Mit dieser Methode der Kryokonservierung erreicht die Sicherheit von funktionell aktiven mononukleären Zellen nach dem Auftauen 85% des Ausgangsniveaus.

Modifikationen Kryokonservierungstechniken werden bei der Verringerung der Konzentration von DMSO gerichtet durch Zugabe von Hydroxyethylstärke (Endkonzentration von DMSO und Hydroxyethylstärke sind jeweils 5 und 6%). Die hohe Wirksamkeit dieser Kombination von Gefrierschutzmitteln wird beobachtet, wenn die Suspension von Myeloidzellen gefroren ist, mit nicht weniger Zytoprotektion als mit einer einzelnen 10% igen Lösung von Dimethylsulfoxid. Die Anzahl der lebensfähigen kernhaltigen Zellen erreichte 96,7% der Grundlinie, und ihre funktionelle Aktivität, geschätzt durch die Anzahl der CFU-GM, betrug 81,8%.

Unter Verwendung einer Lösung von Dimethylsulfoxid in Konzentrationen von 5 bis 10% in Kombination mit 4% Hydroxyethylstärke (Endkonzentration) wurde festgestellt, dass sich die Sicherheit von CD34-positiven Zellen in solchen Bereichen von Dimethylsulfoxid praktisch nicht ändert. Gleichzeitig wird unter den Bedingungen einer abnehmenden Dimethylsulfoxidkonzentration von 5 bis 2,5% ein Massenverlust von Nabelschnurblutzellen beobachtet - die Anzahl der lebensfähigen Zelleinheiten nimmt von 85,4 auf 12,2% ab. Andere Autoren kamen auch zu dem Schluss, dass genau 5 und 10% Lösungen von Dimethylsulfoxid (in der Autorenversion - in Kombination mit autologem Serum) eine Zytoprotektion mit Kryokonservierung von HSC-Nabelschnurblut mit maximaler Effizienz ermöglichen. Zusätzlich wird bei einer Kombination von 5 oder 10% Dimethylsulfoxid mit 4% Hydroxyethylstärke-Lösung, insbesondere bei einer kontrollierten Abkühlgeschwindigkeit von HS / min, eine hohe Konservierung von nacheinander gefrorenen und aufgetauten Zellen festgestellt. In einer anderen Arbeit kryoprotektive Lösung bereits aus drei Bestandteilen verwendet - DMSO, gereinigtes Humanalbumin und RPMI-Medium in einem Verhältnis von 1: 4: 5, die zu der Zellsuspension bis zu einem gleichen Volumen-Verhältnissen (End-DMSO-Konzentration betrug 5%) wurden zugegeben. Nach dem Auftauen in einem Wasserbad mit einer Temperatur von + 4 ° C überschritt die Sicherheit des CFU-GM 94%.

Einige Autoren schlagen vor, unfraktioniertes Nabelschnurblut zur Kryokonservierung zu verwenden, da während der Entfernung von roten Blutkörperchen signifikante Mengen an hämatopoetischen Zellen verloren gehen. In dieser Ausführungsform wird eine 10% ige Lösung von Dimethylsulfoxid verwendet, um mononukleare Zellen vor dem schädigenden Effekt der Kryokristallisation zu schützen. Das Einfrieren wird bei einer konstanten Kühlgeschwindigkeit von HS / min bis -80ºC durchgeführt, wonach die Suspension von Nabelschnurblutzellen in flüssigen Stickstoff eingetaucht wird. Bei dieser Einfriermethode findet eine teilweise Lyse der Erythrozyten statt, weshalb Blutproben nicht fraktioniert werden müssen. Nach dem Auftauen wird die Zellsuspension von freiem Hämoglobin und Dimethylsulfoxid in einer Lösung von Humanalbumin oder im autologen Serum des Patienten gewaschen und zur Transplantation verwendet.

Erhaltung von hämatopoetischen Vorläuferzellen nach unfraktioniertem Nabelschnurblut Abtauen ist in der Tat höher als die fraktionierten, aber in Verbindung mit krioustoychivostyu des roten Blutkörperchen kann zu ernsthaften Problemen als Folge der Posttransfusionstransfusion von ABO-inkompatible roter Blutkörperchen. Außerdem erhöht sich das Volumen von gespeichertem unfraktioniertem Blut signifikant. Aus klinischer Sicht ist es immer noch vorzuziehen, Kryokonservierung vorisoliert und aus anderen Zellfraktionen hämatopoetischer Nabelschnurblutzellen zu reinigen.

Insbesondere ist ein Verfahren fraktionierten Kryokonservierung von Nabelschnurblut-Zellen, so dass Erythrozyten zum Einfrieren in Vorbereitung entfernen, die in der Zusammensetzung plazmozameshchath Lösung „Stabizol“ eine 6% ige Lösung von Hydroxyethylstärke verwendet. Nach dem Auftauen ist die so erhaltene Zellsuspension ohne weitere Manipulation für den klinischen Einsatz bereit.

Daher gibt es gegenwärtig viele recht wirksame Wege der Kryokonservierung von Nabelschnurblut. Der Hauptunterschied besteht darin, dass Blutproben während der Vorbereitungsphase unfraktioniert gefroren oder einer Trennung in Zellfraktionen unterworfen werden und geerntete Zellen ohne eine Beimischung von Erythrozyten geerntet werden.

Transplantation von hämopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

In den späten 80er und frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass das Nabelschnurblut, das während der Schwangerschaft den Fötus versorgt, durch einen hohen Gehalt an hämatopoetischen Stammzellen gekennzeichnet ist. Die relative Einfachheit der Gewinnung von Nabelschnurblutzellen und das Fehlen offensichtlicher ethischer Probleme förderte die Verwendung von Nabelschnurblut-Stammzellen in der praktischen Medizin. Die erste erfolgreiche Transplantation von Nabelschnurblut bei einem Kind mit Fanconi-Anämie diente als Ausgangspunkt, um das Volumen der Nabelschnurblut-Stammzelltransplantation zu erweitern und ein System für die Bankversorgung zu schaffen. Im globalen System der Nabelschnurblutbanken ist das New Yorker Zentrum für plazentales Blut das größte, das in der Bilanz der National Institutes of Health aufgeführt ist. Die Anzahl der gespeicherten Nabelschnurblutproben in dieser Bank nähert sich 20 LLC. Die Anzahl der Empfänger (hauptsächlich Kinder) wächst ebenfalls, und eine erfolgreiche Transplantation wurde durchgeführt. Laut dem US-Gesundheitsministerium hat die rezidivfreie Zeit nach der Transplantation von Empfängern von HSC-Nabelschnurblut bereits 10 Jahre überschritten.

Dies ist nicht überraschend, da zahlreiche Studien des hämatopoetischen Potential von Nabelschnurblut haben gezeigt, dass die Menge und die Qualität der frühesten Stammzellen nicht nur an einen erwachsenen Menschen Knochenmark nicht schlechter ist, sondern auch durch einige Maßnahmen übersteigen sie. Ein höheres proliferative Potenzial von Nabelschnurblut-Stammzellen verursacht Entwicklungszellsignalmerkmale, die Anwesenheit von Rezeptoren auf HSCs auf spezifische Wachstumsfaktoren, die Kapazität von Nabelschnurblutzellen Produktion von Wachstumsfaktoren auf autokrine, die großen Größe und Länge des Telomere.

So genomische und phänotypische Merkmale der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut prädestinieren Qualität Verpflanzung hoher potenzieller Spender hämatopoetische Erholung in dem Empfänger.

Vorteile von hämatopoetischen Stammzellen von Nabelschnurblut

Unter den wirklichen Vorteile der Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Transplantation über andere Quellen von hämatopoetischen Zellen sollte es fast Null Risiko für die Gesundheit des Spenders festgestellt werden (wenn nicht als eine solche Plazenta betrachtet), während die Notwendigkeit einer Vollnarkose zu beseitigen. Die Verwendung von Nabelschnurblut erweitert die Möglichkeiten der Zelltransplantation durch teilkompatible Transplantation im HLA-System (Inkompatibilität von ein bis drei Antigenen). Die Technik der Langzeitlagerung von hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen in einem gefrorenen Zustand, die die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens seltenen HLA-Typs erhöht und verringert HLA-passende Suchzeit allogener Transplantation. Gleichzeitig wird das Risiko, einige latente Infektionen zu entwickeln, die durch den Übertragungsweg übertragen werden, signifikant reduziert. Darüber hinaus gibt es eine kostengünstige Form der biologischen Lebensversicherung in Verbindung mit der Möglichkeit, Nabelschnurblutzellen für die autologe Transplantation zu verwenden.

Da jedoch kleine Mengen von Blut, das aus der Plazenta gesammelt werden kann (im Durchschnitt nicht mehr als 100 ml) in den Vordergrund des Problem der die maximal mögliche Menge an Blut aus der Nabelschnur Vene unter strikter Einhaltung der Bedingungen von minimalem Risiko einer bakteriellen Kontamination von Nabelschnurblut abgeleiteten Proben zu erhalten.

Primitive hämatopoetischer Zellen aus Nabelschnurblut sind durch die Anwesenheit auf ihrer Oberfläche glikofosfoproteina CD34, und auf der Basis ihrer funktionalen Eigenschaften durch Untersuchung der klonogenen Assay oder Koloniebildung in vitro im allgemeinen identifiziert. Vergleichende Analyse zeigte, dass im Nabelschnurblut und Knochenmark maximales Gehalt an CD34-positiven mononukleare Zellen in der Fraktion jeweils 1,6 und 5,0%, die maximale Höhe der koloniebildenden Einheiten in einer Subpopulation von CD34 + Zellen, - 80 bis 25%, insgesamt Klonierungseffizienz von CD34 + Zellen - 88 und 58%, der maximale Gehalt an koloniebildenden Zellen mit einem hohen Proliferationspotential (HPP-CFC in der CD34 + -Population) beträgt 50 und 6,5%. Es sollte hinzugefügt werden, dass die Klonierungseffizienz von CD34 + CD38-Zellen und der Fähigkeit, Cytokinstimulierung reagiert auch höher in hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut.

Kombination phänotypische Antigene Thy-1, CD34 und CD45RA bestätigen die hohe proliferative Kapazität von Nabelschnurblut hämatopoetischen Zellen und die Expression der drei Antigene auf der Oberfläche der Nabelschnurblutzellen anzeigt, dass sie an die Stammzelle gehören. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Nabelschnurblut Zellen mit einem CD34 + Phänotyp enthält, die keine linearen Differenzierungsmarker aufweisen. Das Niveau im Nabelschnurblut von Zellsubpopulationen mit dem phänotypischen Profil von CD34 + / Lin beträgt etwa 1% der Gesamtzahl von CD34-positiven Zellen. Hämatopoetische Nabelschnurblut-Vorläuferzellen führen sowohl zur lymphoiden Zelllinie als auch zur polypotenten myeloiden Reihe der linearen Zelldifferenzierung, was ebenfalls ihre Zugehörigkeit zu Stammzellen anzeigt.

Wie bereits erwähnt, sind die wesentlichen Unterschiede zwischen Knochenmark und Nabelschnurblut die Menge der für die Transplantation verwendeten hämatopoetischen Zellen, die mit einem Verfahren erhalten werden. Wenn Knochenmarktransplantation Verlust von Zellmasse in dem Trennverfahren, die Kryokonservierung, Auftauen und Prüfung im Bereich von 40-50% zulässig ist, ist die Nabelschnurblutzellen, wie Verlust sehr signifikant, da, wenn die unzureichende Anzahl von HSC-Transplantation unter Verwendung von nicht haltbar sein kann. Nach G. Kogler et al (1998), für die Zelltransplantation im Rezipienten Körpergewicht von 10 kg potentiellen Transplantat (Gesamtzahl der Blutproben gesammelt cord - 2098) - 67%, und kann nur alle Nabelschnurblutproben, Körpergewicht 35 kg sein, 25% der Proben können eine effektive Transplantation bei Patienten mit einem Körpergewicht von 50-70 kg ermöglichen. Diese klinische Situation weist auf die Notwendigkeit hin, die Wirksamkeit bestehender Verfahren zur Probennahme, Reproduktion und Lagerung von Nabelschnurblutzellen zu optimieren und zu verbessern. Daher werden die Fragen der Standardisierung von Probenahmemethoden, Prüfung, Trennung und Kryokonservierung von Nabelschnurblut nun weit verbreitet in der Literatur für die Erzeugung von Blutbanken diskutiert, seine Verwendung in der Klinik, sowie die Bedingungen und Bedingungen der Lagerung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut zu etablieren.

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Die Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut in der Medizin

In der Regel können bis zu 10 ⁶ hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut isoliert werden , selten mehr. In Verbindung damit bleibt bis heute die Frage der Hinlänglichkeit von so vielen hämatopoetischen Nabelschnurblutzellen, um die Hämatopoese des erwachsenen Empfängers wiederherzustellen. Die Meinungen zu diesem Thema waren geteilt. Einige Forscher glauben, dass diese Menge für die Transplantation bei Kindern ausreicht, aber zu wenig für eine Transplantation an einen Erwachsenen, für die die optimale Verabreichung (7-10) × 10 ⁶ CD34-positive Zellen pro 1 kg Körpergewicht im Durchschnitt 7 × 10 ^{8 ist} pro Transplantation. Aus diesen Berechnungen folgt, dass eine Nabelschnurprobe 700 Mal weniger hämatopoetische Stammzellen enthält, als für eine Transplantation bei einem erwachsenen Patienten benötigt wird. Eine solche quantitative Beurteilung wird jedoch in Analogie zur Anzahl der transfundierten Zellen im Knochenmark durchgeführt und ignoriert vollständig die ontogenetischen Merkmale der Hämatopoese.

Insbesondere die Tatsache, ignoriert es die höhere proliferative Kapazität der hämatopoetischen Stammzellen von Nabelschnurblut im Vergleich zu den hämatopoetischen Vorläuferzellen des Knochenmarks. Die Ergebnisse in vitro Kolonie-bildenden Potential legen nahe, dass eine Einzeldosis Nabelschnurblut hämatopoetische Rekonstitution von erwachsenem Empfänger zur Verfügung stellen kann. Vergessen Auf der anderen Seite sollten wir nicht, dass die Zahl der HSCs nimmt auch in dem Prozess der embryonalen Entwicklung: den Gehalt an CD34-positiven Zellen im Nabelschnurblut linear 5-mal in einem Zeitraum von 20 Wochen reduziert (Blut für die Studie wurde im Fall der vorzeitigen Beendigung der Schwangerschaft erhalten) bis 40 Wochen der Schwangerschaft (die Periode der physiologischen Geburten), die von einem parallelen, permanenten Anstieg der Expression von linearen Zytodifferenzierungsmarkern begleitet wird.

Aufgrund des Fehlens eines standardisierten Ansatzes zur Quantifizierung von Progenitorzellen in Nabelschnurblutproben geht die Kontroverse über die optimale Dosis von hämatopoetischen Nabelschnurblut-Stammzellen weiter. Einige Forscher glauben, dass die Anzahl der kernhaltigen Zellen und mononukleären Zellen, die für das Körpergewicht des Empfängers neu berechnet wurden, das heißt ihre Dosis, als Kriterium für die Auswahl von Nabelschnurproben verwendet werden kann. Einige Autoren glauben, dass die minimale quantitative Schwelle von CD34 + -Zellen, selbst für die Durchführung einer autologen Transplantation von HSC, 2 × 10 ⁶ / kg ist. Die Erhöhung der Dosis von hämatopoetischen Zellen auf 5 x 10 ⁶ Zellen / kg (insgesamt 2,5) bietet bereits ein geeignetere für frühe postoperative Periode verringert das Auftreten von infektiösen Komplikationen und verkürzt die Dauer von präventiver Antibiotika - Therapie.

Nach E. Gluckman und Co-Autoren (1998) ist in der Onkohämatologie die Voraussetzung für die erfolgreiche Transplantation von Nabelschnurblutzellen die Einführung von mindestens 3,7 x 10 ⁷ kernhaltigen Zellen pro 1 kg Körpergewicht des Empfängers. Mit einer Abnahme der Dosis von hämatopoetischen Stammzellen auf 1 × 10 ⁷ und weniger kernhaltige Zellen pro 1 kg Körpergewicht ist das Risiko von Transplantatversagen und Wiederauftreten von Krebs stark erhöht. Es sollte erkannt werden, dass die minimale Anzahl von Vorläuferzellen, die für die rasche Wiederherstellung der Hämopoese nach GSG-Allotransplantation notwendig ist, noch nicht bekannt ist. Theoretisch kann dies dadurch erreicht werden , um eine einzelne Zelle verwendet wird , aber in der klinischen Knochenmarktransplantation schnelle und stabile Transfusions engraftment garantiert mindestens (1-3) × 10 ⁸ kernhaltigen Zellen pro 1 kg Körpergewicht des Patienten.

Eine kürzlich durchgeführte detaillierte Studie zur Bestimmung der optimalen Menge an HSC in der Onkohämatologie umfasste die Beobachtung von Patienten aus drei Gruppen, die in Abhängigkeit vom Gehalt an CD34-positiven Zellen im Transplantatmaterial isoliert wurden. Die Patienten der ersten Gruppe erhielten (3-5) x 10 ⁶ Zellen / kg. Die HSC-Dosis bei Patienten der zweiten Gruppe betrug (5-10) × 10 ⁶ Zellen / kg, und die Patienten der dritten Gruppe erhielten eine Transplantation von mehr als 10 × 10 ⁶ CD34 + -Zellen / kg. Die besten Ergebnisse wurden in der Gruppe von Empfängern beobachtet, die ein Transplantat erhielten, wobei die Anzahl der CD34-positiven Zellen gleich (3-5) × 10 ⁶ / kg war. Bei einer Erhöhung der Dosis von transplantierten Zellen über 5 × 10 ⁶ / kg wurden keine statistisch signifikanten Vorteile festgestellt. Gleichzeitig ist ein sehr großer HSC-Gehalt im Transplantat (> 10 x 10 ⁶ / kg) mit einer Reinfusion einer signifikanten Anzahl von Resttumorzellen verbunden, was zu einem Rückfall der Erkrankung führt. Es gab keine direkte Beziehung zwischen der Anzahl der transplantierten allogenen Progenitorzellen und der Entwicklung der "Graft-versus-Host" -Reaktion.

Die akkumulierte Welterfahrung der Transplantation von HSC-Nabelschnurblut bestätigt ihr hohes Wiederauffüllungspotenzial. Die Transplantationsrate der Nabelschnurbluttransplantation korreliert mit der Anzahl der eingebrachten kernhaltigen Zellen. Die besten Ergebnisse werden mit einer Transplantation von 3 × 10 ⁷ / kg beobachtet, während für das Knochenmark diese Dosis 2 × 10 ⁸ / kg beträgt . Nach den Daten der Koordinationszentren wurden Ende 2000 weltweit 1200 Transplantate von Nabelschnurblutzellen erzeugt, hauptsächlich von Verwandten der Spender (83%). Offensichtlich sollte Nabelschnurblut als Alternative zum Knochenmark zur Transplantation bei Patienten mit Hämoblastosen in Betracht gezogen werden.

Allerdings fördert Neugeborenen Natur Cordova Quelle von hämatopoetischen Geweben aufgrund der Anwesenheit von funktionellen Eigenschaften seiner GCW. Jedoch nur die klinische Erfahrung kann eine Antwort auf die Frage nach der Angemessenheit einer Probe von Nabelschnurblut für erwachsene hämatopoetische Rekonstitution des Empfängers mit Aplasie der Hämatopoese geben. Leukämien und myelodysplastischen Syndromen, Non-Hodgkin-Lymphom und Neuroblastom, aplastische Anämie, angeborene Fanconi-Anämie und Diamond Black Fan, Mangel an Leukozyten-Adhäsion, Barr-Syndrom, Morbus Günther Harlera Syndrom, Thalassämie: Transplantation von Nabelschnurblutzellen wird in der Behandlung vieler Krankheiten von Tumor- und Nicht-Tumor Natur verwendet .

Besondere Aufmerksamkeit verdienen die immunologischen Aspekte der Transplantation von blutbildenden Zellen des Nabelschnurblutes. Es wird mit unvollständigen HLA-angepassten Transplantationsergebnissen sind recht zufriedenstellend, dass nach Ansicht der Autoren, dass im Fall der Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut von Spendern dargestellt ist, einen geringeren Immunreaktivität Nabelschnurblutes als Knochenmark anzeigt.

Eine detaillierte Untersuchung der zellulären Zusammensetzung von Nabelschnurblut zeigten Merkmale sowohl phänotypischen Spektrums von Effektorzellen des Immunsystems und ihrer funktionellen Aktivität, so dass mit relativ geringem Risiko einer Reaktion „Graft versus Host“ Nabelschnurblut als Quelle von HSCs zu betrachten. Unter den Zeichen der funktionellen Unreife von immunkompetenten Nabelschnurblutzellen sollte man ein Ungleichgewicht in der Zytokinproduktion und eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber der Zytokinregulation der Immunantwort bemerken. Die resultierende Hemmung der zytotoxischen Lymphozytenaktivität wird als ein Faktor angesehen, der zur Bildung einer immunologischen Toleranz gegenüber dem transplantierten hämatopoetischen Gewebe beiträgt. In der Nabelschnurblut-Lymphozytenpopulation überwiegen im Gegensatz zu peripherem Blut und Knochenmark adulter Spender inaktive, unreife Lymphozyten und Suppressorzellen. Dies deutet auf eine verminderte Verfügbarkeit von Nabelschnurblut-T-Lymphozyten für die Immunantwort hin. Ein wichtiges Merkmal der Monozytenpopulation von Nabelschnurblutzellen ist der geringe Gehalt an funktionell vollständigen und aktiven antigenpräsentierenden Zellen.

Auf der einen Seite erstreckt sich ein geringer Grad der Reife von Effektorzellen des Immunsystems in Nabelschnurblut Ablesungen auf seine Verwendung in der Klinik, da diese Eigenschaften die Reduzierung in der Intensität der Immun Konflikt zwischen Spender- und Empfängerzellen erlauben. Aber auf der anderen Seite wissen wir von der Existenz einer Korrelation zwischen dem Grad der Reaktion „Graft-versus-Host-Krankheit“ und Transplantation Anti-Tumor-Wirkung, dh die Wirkung der Entwicklung von „Graft-versus-Leukämie“. Im Zusammenhang mit dieser Studie Anti-Tumor-Zytotoxizität von Nabelschnurblutzellen durchgeführt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz der wirklich geschwächte Immunantwort von Nabelschnurblutzellen auf Antigenstimulation, in erster Linie aktiviert sind die natürlichen Killerzellen und killeropodobnymi Zellen, die aktiv in den Mechanismen der Umsetzung der Anti-Tumor-Zytotoxizität beteiligt sind. Außerdem mit dem Phänotyp CD16 + CD56 + und CD16 in Nabelschnurblut Lymphozytensubpopulationen wurden gefunden „TCRa / p +. Es wird angenommen, dass diese Zellen in einer aktivierten Form Reaktion umzusetzen sind“ graft-versus-Leukämie“.

Am Institut für Onkologie, Akademie der Medizinischen Wissenschaften der Ukraine kryokonservierten hämatopoetischen Zellen aus Nabelschnurblut wurden mit persistierendem hypoplasia der Hämatopoese an Krebspatienten verabreicht durch Chemotherapie und Strahlentherapie. Bei diesen Patienten der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut effektiv Blut Unterdrückung gestellt, wie durch persistierende Erhohung von reifen geformten Elementen im peripheren Blut nachgewiesen, sowie eine Erhöhung der Indikatoren, die den Zustand der zellulären und humoralen Immunität charakterisieren. Die Stabilität der Repopulationswirkung nach Transplantation von blutbildenden Zellen aus Nabelschnurblut ermöglicht eine fortgesetzte Bestrahlung und Chemotherapie ohne den Behandlungsverlauf zu unterbrechen. Es gibt Hinweise auf eine größere Effizienz Allograft Stammzellen aus Nabelschnurblut Krebspatienten: das jährliche Risiko eines erneuten Auftretens eines Tumors in ihrer Verwendung betrug 25% im Vergleich zu 40% bei Patienten mit einem transplantierten allogenen Knochenmark-Gen.

Der Wirkmechanismus von kryokonservierten Nabelschnurblut-Stammzellen sollte durch die einzigartige Fähigkeit der neonatalen Zellen verursacht als Ergebnis einer humoralen Stimulation des Hämatopoese Empfängers angesehen Produktion von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren zu Autokrine sowie eine Folge der temporären Verpflanzung von Spenderzellen (als Bestätigung - eine deutliche Steigerung des Gehaltes an peripherem Blut fetalen Hämoglobins Empfängers 7-15 Tag nach der Transfusion im Vergleich zu den Ausgangsdaten). Fehlen bei Empfängern von Nabelschnurblut nach den Transfusionsreaktionen - aufgrund seiner relativen Toleranz von Immunzellen, sowie das Vertrauen Kriterium der Nützlichkeit von kryokonservierten biologischem Material.

Progenitorzellen T-Lymphozyten Killer Nabelschnurblut fähig Aktivierung unter der Einwirkung von exogener Cytokinstimulierung, die neue ex vivo zu entwickeln, verwendet wird, und in-vivo-Verfahren zur Induktion cytotoxischer Antitumor-Lymphoidzellen für die nachfolgende Transplantation Immuntherapie. Darüber hinaus ermöglicht der „Unreife“ des Genoms von Nabelschnurblut Immunzellen ihre Verwendung für Anti-Tumor-Aktivität durch molekulare Modellierung zu verbessern.

Heute hat Nabelschnurblut vor allem in der pädiatrischen Hämatologie breite Anwendung gefunden. Bei Kindern mit akuter Leukämie Allotransplantation von hämatopoetischen Stammzellen von Nabelschnurblut im Vergleich zu marrow allografts Knochen reduziert signifikant das Auftreten der Reaktion „Graft versus Host“. Es wird jedoch darauf hingewiesen, eine lange Zeit der Neutropenie und Thrombozytopenie über, und leider ein höheres Niveau der 100-Tage-Mortalität nach der Transplantation. Eine längere Zeit der Erholung in dem peripheren Blut Granulozyten und Thrombozyten konnte aufgrund unzureichender Differenzierung einzelner Subpopulationen von CD34 positiven Zellen von Nabelschnurblut sein, wie durch das niedrige Niveau der Absorption radioaktiven Rhodamin und geringer Expression von CD38-Antigenen auf ihrer Oberfläche belegt.

Zur gleichen Zeit, die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut von erwachsenen Patienten durchgeführt, wegen des Mangels an sowohl einem kompatiblen nicht verwandten Knochenmarkspender, sowie Möglichkeiten zur Mobilisierung autologe HSC zeigte eine hohe jährliche rezidivfreie Überleben bei Patienten unter 30 Jahren (73%) . Expansion Empfänger Altersgruppe (18-46 Jahre) verringerte sich um das Überleben auf 53%.

Quantitative Analyse von Zellen mit der Phänotyp CD34 + Knochenmark und Nabelschnurblut zeigte höhere (3,5-fache), um ihre Inhalte in dem Knochenmark, aber Nabelschnurblut eine deutliche Übergewicht der Zellen mit phänotypischem Profil von CD34 + HLA-DR .Izvestno, chtokletkikrovisimmunologicheskimi Markern zeigte CD34 + HLA-DR proliferieren aktiver als Zellen mit Immunphänotyp CD34 + HLA-DR +, wie in experimentellen Studien des Wachstums der lang~~POS=TRUNC von hämatopoetischen Zellen in vitro bestätigt. Primitive Zellvorläufer mit dem Phänotyp CD34 + CD38 im Nabelschnurblut und Knochenmark enthalten ist, aber Nabelschnurblutzellen mit dem Marker gesetzt CD34 + CD38 haben eine höhere Aktivität als klonogenen hämatopoetischen Zellen des gleichen Phänotyp, isoliert aus erwachsener Spender-Knochenmark. Darüber hinaus wird Nabelschnurblut-Zellen mit CD34 + CD38 Immunphänotyp in Reaktion auf die Stimulation proliferieren mit Zytokinen (IL-3, IL-6, G-CSF) und reproduzieren 7-mal mehr Kolonien in den Langzeitkulturen als Knochenmarkszellen.

Banken von Nabelschnurblut-Stammzellen

Für eine korrekte Entwicklung des neuen Bereichs der praktischen Medizin - Transplantation von Blutstammzellen Kabeln, sowie Transplantationen von hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks durchführt, müssen Sie über ein umfangreiches Netzwerk von Blutbanken haben, die in den USA und Europa bereits etabliert sind. Die innerstaatlichen Netze von Nabelschnurblutbanken werden vom Verband der Netcord-Banken vereint. Die Machbarkeit einer internationalen Vereinigung von Nabelschnurblutbanken Festlegung wird durch die Tatsache bestimmt, dass in keinem Zusammenhang Transplantationen benötigen eine große Anzahl von Proben von Nabelschnurblut getippt auszuführen, so dass die HLA-identischen Spender wählen. Nur die Einrichtung eines Systems von Banken mit der Lagerung von Blutproben verschiedener HLA-Typen in ihnen kann wirklich das Problem lösen, den notwendigen Spender zu finden. Die Organisation eines solchen Systems von Nabelschnurblutbanken erfordert die vorläufige Entwicklung von ethischen und rechtlichen Normen, die derzeit auf internationaler Ebene diskutiert werden.

Um Nabelschnurblutbanken in der Ukraine zu schaffen, ist es notwendig, eine Reihe von Bestimmungen und Dokumenten auszuarbeiten.

Dies sind vor allem Fragen der Standardisierung der Probenahme, Fraktionierung und des Einfrierens von Nabelschnurblut. Es ist notwendig, die Nabelschnurblut Sammlung Regeln in Krankenhäusern, in Übereinstimmung mit den Anforderungen der medizinischen Ethik zu regeln, die minimale Menge an Nabelschnurblut, um zu bestimmen, was eine erfolgreiche Transplantation zur Verfügung stellt. Es sollte verglichen und Standardisierung verschiedenen Kriterien der Qualitätsbewertung und die Anzahl der hämatopoetischen Vorläuferzellen sowie HLA-Typisierungsmethoden und Methoden der Diagnose von genetischen und Infektionskrankheiten, die durch die Infusion von Nabelschnurblutzellen eingestellt allgemeine Auswahlkriterien gesunde Spender übertragen werden kann. Es lohnt sich auch, die Schaffung separater Speicher für Serum, Zellen und DNA aus Nabelschnurblut zu diskutieren.

Es ist absolut notwendig, ein Computernetzwerk von Daten über Nabelschnurblut für die Umsetzung der Beziehung zu den Registern der Knochenmarkspender zu organisieren. Um die Zelltransplantologie weiter zu entwickeln, sollten spezielle Protokolle zum Vergleich der Ergebnisse von Nabelschnurblut und Knochenmarktransplantation von HLA-identischen Verwandten und nicht verwandten Spendern entwickelt werden. Bei der Lösung von ethischen und rechtlichen Problemen der klinischen Anwendung von Nabelschnurblutzellen kann die Standardisierung der Dokumentation, einschließlich der Einwilligung der Eltern und der Benachrichtigung der Mutter oder Verwandten über die genetischen und / oder infektiösen Krankheiten des Kindes, helfen.

Die Bestimmung Voraussetzung für die Entwicklung von Zelltransplantation in der Ukraine wird für die Spende von Stammzellen und der Entwicklung der internationalen Zusammenarbeit mit anderen Ländern durch den Weltverband der Spenderknochenmark (WMDA), die National US Spender-Knochenmark-Programm (NMDP) und andere Register die Annahme des Nationalen Programms sein.

Noch kurze Geschichte der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen von Nabelschnurblut zu verallgemeinern, stellen wir fest, dass die erste Annahme der Möglichkeit einer klinischen Anwendung von Nabelschnurblut, in den frühen 70er Jahren gemacht, die Ergebnisse der experimentellen Studien an Tieren in den 80er Jahren bestätigt wurden, und im Jahr 1988 Jahr wurde die erste Transplantation von hämatopoetischen Zellen von menschlichem Nabelschnurblut der Welt durchgeführt wird, und dann begann ein globales Netzwerk von Nabelschnurblutbanken zu entwickeln. Nach 10 Jahren, die Natur die Zahl der Patienten mit transplantierten hämatopoetischen Zellen, Nabelschnurblut näher an 800. Unter sie waren Patienten mit verschiedenen Tumorerkrankungen (Leukämie, Lymphom, solide Tumoren) und Nicht-Tumor (angeborener Immunschwäche, Anämie, Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen).

Im Nabelschnurblut ist der Gehalt an frühen und gebundenen Zellvorläufern höher als im peripheren Blut eines Erwachsenen. Durch die Anzahl der Granulozyten-Makrophagen-koloniebildenden Einheiten und deren proliferatives Potential übersteigt Nabelschnurblut das periphere Blut von Erwachsenen auch nach der Einführung von Wachstumsfaktoren signifikant. In Langzeit-Zellkulturen in vitro gab es eine größere proliferative Aktivität und Lebensfähigkeit von Nabelschnurblutzellen als Knochenmarkzellen. Die kritischen Momente in der Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen sind hämatopoetische potentielle Anzahl kernhaltiger Zellen und die Anwesenheit von Cytomegalovirus-Infektion, HLA-kompatiblen Spender und dem Empfänger, dem Körpergewicht und dem Alter des Patienten.

Dennoch sollte die Stammzelltransplantation von Nabelschnurblut als Alternative zur Knochenmarktransplantation in Betracht gezogen werden, um schwere Blutkrankheiten, insbesondere bei Kindern, zu behandeln. Klinische Probleme der Transplantation von Nabelschnurblutzellen nach und nach aufgelöst - es gibt bereits sehr effizient Stichprobenverfahren, Trennung und Kryokonservierung von Nabelschnurblutzellen, sofern die Bedingungen für die Bildung von Nabelschnurblutbanken werden die Testmethoden kernhaltigen Zellen verbessert. Optimal für die Trennung bei einer großflächigen Beschaffung von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut bei der Erstellung von Banken sollten 3% Gelatinelösung und 6% ige Lösung von Hydroxyethylstärke in Betracht gezogen werden.

Perehrestenko P. Et al (2001) weist darauf hin, zu Recht, dass die Transplantation von Blutstammzellen Kabeln sollte seinen rechtmäßigen Platz in den komplexen therapeutischen Maßnahmen, um die Depression der Hämatopoese unterschiedlicher Herkunft zu überwinden, wie GSK Nabelschnurblut in einer Reihe von signifikanten Vorteilen unterscheiden, unter denen wichtig ist die relative Leichtigkeit der Ernte, gibt es an den Spender, geringe Verschmutzung der neonatalen Zellen mit Viren und relativ geringen Kosten des Transplantats kein Risiko. Einige Autoren schlagen vor, dass die Transplantation von Nabelschnurblutzellen weniger häufig als Knochenmarkzellen von Komplikationen im Zusammenhang mit der Umsetzung von „Graft-versus-host“ zugeordnet begleitet wird, die fällig ist, in ihrer Sicht eine schwache Expression in den Nabelschnurblutzellen von HLA-DR-Antigenen und ihrer Unreife. Dennoch sind die Hauptpopulation von kernhaltigen Zellen von Nabelschnurblut T-Lymphozyten (SDZ-positive Zellen), deren Gehalt beträgt etwa 50%, was als im peripheren Blut eines Erwachsenen 20% weniger, aber die phänotypischen Unterschiede von Subpopulationen von T-Zellen aus diesen Quellen sind unbedeutend.

Zu den Faktoren, die direkt das Überleben der Stammzelltransplantation von Nabelschnurblut beeinflussen, sollten wir das Alter der Patienten beachten (die besten Ergebnisse bei Empfängern im Alter von bis zu 5 Jahren gesehen), eine frühe Diagnose der Krankheit und eine Form der Leukämie (Effizienz ist signifikant höher als bei akuter Leukämie). Von großer Bedeutung sind die Dosis von nukleierten Nabelschnurblutzellen sowie deren HLA-Kompatibilität mit dem Empfänger. Es ist kein Zufall Analyse der klinischen Wirksamkeit von Nabelschnurblut-Transplantation GSK in der Onkologie und Hämatologie der besten Ergebnisse der Behandlung zeigt mit verwandten Transplantationen: Ein-Jahr krankheitsfreie Überleben in diesem Fall erreicht 63%, während der unabhängigen Transplantation - nur 29%.

Somit macht die Anwesenheit einer großen Anzahl von Stammzellen im Nabelschnurblut und hohe repopulyatsionnaya Fähigkeit neonatalen hämatopoetischen Stammzellen sie geeignet für allogene Transplantation bei Patienten mit hämatologischen Malignitäten. Beachten Sie jedoch, dass die Rekapitulation der Hämatopoese nach der Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut „in der Zeit gedehnt wird“: Wiederherstellung der Inhalte im peripheren Blut Neutrophilen in der Regel gegen Ende der 6. Woche stattfindet, und Thrombozytopenie Phänomen verschwinden in der Regel nach 6 Monaten. Darüber hinaus bedeuten die unreifen blutbildenden Zellen von Nabelschnurblut schließen nicht immunologischen Konflikt: schweren Verlauf von akuter und chronischen Reaktion „Graft versus Host“ beobachtete jeweils in 23 und 25% des Empfängers. Rezidive der akuten Leukämie durch das Ende des ersten Jahres nach den Nabelschnurblutzellen Umpflanzen wird in 26% der Fälle gefunden.

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