Nichtvirale Gentherapie bietet Hoffnung bei chronischen Rückenschmerzen
Zuletzt überprüft: 14.06.2024
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In einer kürzlich im Journal Biomaterials veröffentlichten Studie entwickelten Forscher eine neuartige nicht-virale Gentherapie zur Behandlung von diskogenen Rückenschmerzen (DBP), indem sie den Transkriptionsfaktor Forkhead Box F1 (FOXF1) mithilfe künstlich erzeugter extrazellulärer Vesikel (eEVs) in degenerative Bandscheiben (IVDs) in vivo einbringen.
Chronische Rückenschmerzen (LBP) sind aufgrund der alternden Bevölkerung und zunehmender Opioidprobleme ein wachsendes globales Problem. Zu den aktuellen Behandlungsmethoden gehören kurzfristige Linderung oder teure Operationen, was den Bedarf an nicht süchtig machenden und weniger invasiven Therapien unterstreicht.
Aktuelle biologische Therapien, darunter die Verabreichung von Wachstumsfaktoren, Zelltherapie und virale Gentherapien, können die Degeneration in Tier- und Menschenmodellen reduzieren. Bedenken wie kurzfristige Auswirkungen, schlechte langfristige Wirksamkeit und unnötige Immunogenität und Tumorigenität können jedoch die direkte Anwendung dieser Methoden verhindern.
In dieser Studie haben Forscher eine nicht-virale Gentherapie für Bandscheibendegeneration (IVD) unter Verwendung von FOXF1-eEV entwickelt.
Die Forscher transfizierten primäre embryonale Mausfibroblasten (PMEFs) mit einem Plasmid, das FOXF1 oder pCMV6 als Kontrolle enthielt, und charakterisierten eEV-Proben mithilfe eines Nanopartikel-Tracking-Assays (NTA).
Sie bewerteten die effiziente Beladung von eEVs mit molekularer Fracht mithilfe der quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und der konventionellen PCR. Die Western-Blot-Analyse identifizierte FOXF1 und spezifische EV-Proteine in eEV-Formationen. Das Team verwendete Plasmide, die die vor- und nachgelagerten Polylinker-Regionen verstärken, um das Vorhandensein von FOXF1-Plasmid-DNA in Spenderzellen zu bestimmen, und erzeugte eEVs.
Sie untersuchten die vollständige mRNA, die aus Plasmid-DNA in eEVs und Spenderzellen produziert wurde.
Die Forscher erstellten extrazelluläre Vesikel mit Transkriptionsfaktoren, um die Gewebefunktion wiederherzustellen und Schmerzreaktionen in einem Tiermodell von DBP zu modifizieren.
Sie identifizierten EVs zum Transport und zur Verteilung von FOXF1 an beschädigte Bandscheiben in einem Mausmodell für diskogenen Rückenschmerz, um die Hemmung der Bandscheibendegeneration durch FOXF1-eEVs zu bestimmen.
Das Team kombinierte biomechanische Tests von Maus-Bandscheiben mit Bildgebung, Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) und Schmerzreaktionen, die nach 12 Wochen beurteilt wurden, um Veränderungen in Struktur und Funktion sowie durch den therapeutischen Eingriff verursachte Schmerzen zu bestätigen.
Schmerzen vor und nach der Behandlung Zu den Untersuchungen gehörten Mikrocomputertomographie (Mikro-CT), Magnetresonanztomographie (MRT), mechanische Tests, Alcianblau- (AB) und Picrosiriusrot- (PSR) Färbung, Dimethylmethylenblau-Test und Immunhistochemie (IHC).
Die Studie umfasste eine chirurgische Technik, bei der Forscher Mäusen Buprenorphin ER subkutan injizierten, um postoperative Schmerzen zu kontrollieren.
Das Team führte Verhaltensuntersuchungen vor der Operation und alle zwei Wochen von vier bis zwölf Wochen nach der Operation durch und verwendete dabei eine Vielzahl von Techniken wie den Open-Field-Test, Kaltplatten-, Schwanzaufhängungs- und Drahtaufhängungstest.
Der Open-Field-Test bewertete die spontane Aktivität der Mäuse; Kaltplattentests maßen thermische Hyperalgesie; Schwanzaufhängungstests maßen axialen Schmerz; und Drahtaufhängungstests maßen die Stärke.
Zwölf Wochen nach der Operation sezierte das Team die Lendenwirbelsäule der Tiere und verwendete eine Femoralnerven- und Arterienverfolgung, um Bandscheiben zwischen L4 und L5, L5 und L6 und L6 und S1 IVD zu identifizieren. Sie verwendeten L5/L6 IVD, um die Histologie zu bewerten und den Glykosaminoglykangehalt (GAG) zu bestimmen.
FOXF1 eEVs reduzierten die Schmerzreaktionen erheblich und stellten gleichzeitig die IVD-Struktur und -Funktion wieder her, einschließlich Verbesserungen der Bandscheibenhöhe, der Gewebehydratation, des Proteoglykangehalts und der mechanischen Eigenschaften.
Die Studie konzentrierte sich auf die Freisetzung von FOXF1-beladenen eEVs aus primären Fibroblasten, die mit dem FOXF1-Transkriptionsfaktor transfiziert wurden. Quantitative RT-PCR zeigte einen signifikanten Anstieg der FOXF1-mRNA-Transkriptwerte und der voll transkribierten FOXF1-mRNA-Werte im Vergleich zu mit pCMV6 transfizierten Zellen.
Die FOXF1-eEV-Therapie kann Schmerzreaktionen in einem Mausmodell mit Bandscheibenpunktion in der Lendenwirbelsäule bis zu 12 Wochen lang reduzieren. Weibliche Mäuse zeigten in der mit FOXF1 behandelten Gruppe längere Akquisitionszeiten als in der Gruppe mit Verletzungen, die mindestens 12 Wochen nach der Behandlung anhielten.
Die FOXF1-eEV-Therapie verbesserte die Hydratation und die IVD-Gewebehöhe bei verletzten und degenerativen Tieren in vivo, während die Hydratationswerte und die T2-gewichtete IVD-Bildintensität erhalten blieben.
Das Team beobachtete jedoch eine Abnahme der Bandscheibenhöhe bei verletzten Tieren und Tieren, die mit pCMV6 eEV behandelt wurden. Bei Mäusen, die mit FOXF1 eEV behandelt wurden, war 12 Wochen nach der Behandlung keine Verringerung der Bandscheibenhöhe zu verzeichnen. Das Geschlecht hatte keinen Einfluss auf die funktionellen Ergebnisse.
FOXF1 eEVs stellten die mechanische Funktion beschädigter und degenerierter IVDs in vivo wieder her. Unter axialer Belastung zeigten mit FOXF1 eEV behandelte IVDs eine höhere normalisierte NZ-Steifigkeit als beschädigte IVDs.
Unter Kriechbedingungen zeigten beschädigte IVDs erhöhte normalisierte Kriechverschiebungen, was auf eine Abnahme der normalisierten elastischen Kriechsteifigkeit hindeutet.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduzierung des GAG-Gehalts in beschädigten IVDs die mechanische Flexibilität erhöht, die eEV-Therapie jedoch den Verlust von Glykosaminoglykanen und nachfolgende Veränderungen der mechanischen Funktion verhindert.
FOXF1 eEVs verursachten strukturelle und funktionelle Veränderungen in IVDs, indem sie die Proteoglykan- und GAG-Werte erhöhten.
Die Studienergebnisse zeigten, dass mit Entwicklungstranskriptionsfaktoren beladene eEVs schmerzhafte Gelenkerkrankungen wie DBP behandeln können, indem sie diese Transkriptionsfaktoren an degenerative und schmerzhafte IVD-Gelenke abgeben.
Diese Strategie kann dazu beitragen, durch die Krankheit verursachte strukturelle und funktionelle Anomalien zu reduzieren und geschlechtsspezifische Schmerzreaktionen zu regulieren.
Forscher haben außerdem empfohlen Verwendung von Entwicklungstranskriptionsfaktoren wie FOXF1, um degenerative NP-Zellen in vivo in einen proanabolen Zustand zu überführen. Weitere Forschung ist erforderlich, um die therapeutische Wirksamkeit zu bestimmen.