Experimentelle Arbeiten zur Transplantation allogener Keratinozyten auf künstlich erzeugte Narben weißer Ratten

Der Wunsch, das zelluläre Potenzial zu nutzen und die Suche nach neuen effektiven Methoden zur Verbesserung des ästhetischen Erscheinungsbildes von Narben führte zu der Idee, die Möglichkeit der Keratinozytentransplantation auf Narbenoberflächen zu untersuchen.

Um die Möglichkeit der Verwendung von Keratinozyten-Kultur zu beweisen, das Auftreten von Narben experimentelle Arbeit zu verbessern hat dich auf weiße Laborratten durchgeführt worden, die Narbenoberfläche erstellt wurden. Das Pansenmodell von Ratten wurde als Ergebnis der Heilung von künstlich zugefügten Wunden auf dem Rücken entlang der Wirbelsäule erhalten. Die Ratten wurden Stücke aus dem gleichen Leder, Größe von 2x3 cm geschnitten. Nach 2,5 Monaten nach der Operation „Simulation Vernarbung“ Ratten wurde Dermabrasion Chirurgie durchgeführt (Entfernung der oberen Schichten über ignioperation Pansen) und transplantierte allogenen Keratinozyten, isoliert aus der Haut von jungen Ratten 2-4 Tage nach der Geburt.

Isolierung und Wachstum von Ratten-Epidermozyten wurde im Labor für Zellentechnologien des Institute of Cytology RAS der folgenden Technologie durchgeführt.

Die Haut wurde in Hanks Kochsalzlösung gewaschen, die 200 U / ml Gentamicin enthielt und in kleine Stücke mit einer Fläche von 0,2 bis 0,5 cm ² geschnitten . Die Hautwürfel wurden in einer 0,5% igen Lösung von Disaspase in einer ausgeglichenen phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei 37 ° C für eine Stunde inkubiert. Die Stücke wurden dann auf Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung übertragen und die Epidermis wurde von der Dermis getrennt. Die Epidermis wurde in einer 0,125% igen Trypsinlösung für 10 bis 15 Minuten unter Rühren bei 50 U / min inkubiert, wonach die Wirkung des Enzyms durch die Zugabe von 5% fötalem Rinderserum gestoppt wurde. Ein Drittel der erhaltenen Zellsuspension wurde in reiner Form für eine der Varianten der Transplantation in Narben verwendet, das zweite Drittel wurde auf biokompatiblen Haushaltsfolien "Polypor", der dritte auf Petrischalen ohne Substrat gezüchtet. Die Operation der Dermabrasion der erhaltenen Narben bei Ratten mit anschließender Transplantation von Ratten-Epidermozyten wurde unter Etheranästhesie unter Verwendung eines Hitzekauters durchgeführt.

Die erste Gruppe von Ratten nach Dermabrasion auf poliert, mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet Oberfläche sterile Pansenstücke Rasen überlagert, die abgeschieden wurde verwürfelten allogenen Ratten epidermotsitov Aufschlämmung bei einer Konzentration von 1,5 Millionen Zellen pro 1 ml (nach dem Institute of Cytology). Batistovye Stücke passen auf die polierte Narbe, so dass die Zellen auf der Oberfläche der Narbe liegen. Ein Verband aus mehreren Lagen Gaze wurde oben genäht, der an die Ränder der Narbe genäht wurde.

Ein Teil der resultierenden Zellsuspension wurde in Petrischalen auf sterile Polypore-Filme in Form von Bechern, der andere Teil auf Petrischalen ohne Film aufgebracht. Die Kultivierung wurde in einem FAD-Medium durchgeführt, das aus einer Mischung von DMEM und F12 in einem Verhältnis von 3: 1 bestand. Mit der Zugabe von 10% fötalem Rinderserum, 5 ug / ml Insulin (Sigma), 0,5 ug / ml Hydrocortisonhemisuccinat (Sigma). 10 μg / ml epidermaler Wachstumsfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Die zweite und dritte Rattengruppe mit 7 Individuen wurde 6 Tage nach der ersten operiert. Zu dieser Zeit wurden aus der Suspension von ausgesäten Keratinozyten in Petrischalen, die in Ratten transplantiert wurden, mehrschichtige Schichten gebildet. Die zweite Gruppe wurde mit Epidermozyten auf dem Film, die dritte Gruppe - mit einer mehrschichtigen Schicht ohne Substrat transplantiert. Nach 7 Tagen wurden die auf Polypore-Folien ausgesäten mehrschichtigen Schichten von alogischen Keratinozyten (MPALK) durch Kultur direkt auf die Wundoberfläche transplantiert. Oben wurde der Film, um sein Aufreißen zu vermeiden, mit einem mehrschichtigen Mullverband fixiert und an die Haut von Ratten genäht.

Bevor Keratinozyten dritte Gruppe von Ratten Umpflanzen, ohne das Substrat aufgewachsen, um eine Trennung von PAC aus dem Boden der Schale Dispase-Behandlung Petri Herstellung, mit der Fähigkeit, selektiv die dermo-epidermalen Kommunikation zu unterbrechen. Unter der Wirkung eines mehrlagigen Reservoir Dispase zerstört die Verbindung der basalen Zellschicht auf dem Boden der Petrischale und in einem viel geringeren Ausmaß, beeinflusst es die interzelluläre Kommunikation, die es ermöglicht, „zu entfernen“, um die gesamte Schicht macht. Die Ablösung der mehrschichtigen Zellschicht durch die Anordnung wurde wie folgt durchgeführt. Das Transportmedium wurde aus den Petrischalen abgelassen, die Zellschichten wurden dreimal mit einem Antibiotika enthaltenden Nährmedium, insbesondere Gentamicin (0,2 mg / ml), gewaschen. Mehrschichtige Betten wurden in eine 0,125% ige Dispersionslösung ("Sigma") gegossen und in einen Thermostaten gegeben, wo sie 20 bis 30 Minuten bei t = 37 ° C inkubiert wurden. Das Auftreten einer weißen Krone, die von der Peripherie der Formation abblättert, ist ein Anzeichen für den Beginn des Trennprozesses von den Kanten und dem Boden der Petrischale. Wenige Minuten nach Beginn des Trennprozesses wurde die Lösung der Disaspase zusammengeführt, die Epithelschichten wurden 2-3 mal mit Medium gewaschen. Auf der Oberfläche der epidermalen Schicht aufgebracht wurde, auf Größe geschnitten steriler Napfteil Wundverband „Leith-Farbe, die Dispase Bildung, weitere Delaminierung des Bodens des Bechers mit einem Spatel geschnitten wird abgetrennt. Ophthalmologischen Pinzette Verwendung mit der Beschichtung der Binde Schicht zusammen“ Leith-color „(Russian ) löste sich von der Unterseite weg von einer Petrischale und vorsichtig auf die vorbereitete Fläche der Narbe übertragen. Servietten „Lita-color“ enthält in seiner Zusammensetzung und Gentamicin eksolin (Kollagen-Extrakt), die sprießen in der Zukunft, wenn nasser Umgebung bleibt Sem Salzlösung gequollen und wurde moderne Wundauflage, die mit der Struktur einen guten Schutz vor externen Infektion und eine schnelle Heilung aufgrund beginnenden Nässe bietet.

Polyprop-Folien und Lita-Color-Servietten wurden mit Mullbändern überlagert, die zur dauerhaften Fixierung auf die Haut von Ratten aufgenäht wurden. Jede Ratte wurde in einen separaten Käfig gepflanzt, um optimale Bedingungen für ihre Erhaltung und Einpflanzung transplantierter Keratinozyten zu schaffen. Bandagen Ratten, die Aufhängung und mehrschichtige Reservoir epidermotsitov Schuss Dispase transplantiert, täglich mehrmals täglich mit steriler Kochsalzlösung befeuchtet die günstigsten Bedingungen die Zellen für Einpflanzung zu erstellen. Wenn man bedenkt, dass der Film "Polypor" wasserundurchlässig war, befeuchten die Ratten der zweiten Gruppe die Verbände nicht, was einer der Vorteile gegenüber Transplantaten ohne Filme war. Nach 10 Tagen wurden die Verbände entfernt. Das klinische Bild der Narben nach der Zelltransplantation unterschied sich kaum von den Narben ohne Transplantation, mit Ausnahme einer rosa Färbung (aufgrund der Dermabrasion) und einer stärkeren Abschälung. Diese Tatsache deutet darauf hin. Dass unmittelbar nach dem Verschwinden der Wundbeläge mit IPC keine Veränderungen im Pansen auftraten.

Biopsiematerial in Ratten nehmen.

Nach 1, 2, 5 und 9 Monaten nach dem Transfer von Ratten-alogischen Keratinocyten zu den Boden-Narben weißer Ratten wurde das Material zur histologischen, zytomorphologischen und elektronenmikroskopischen Untersuchung entnommen. Als Kontrollproben wurden normale Rattenhaut und -narben ohne Transplantation von Zellen entnommen. Anästhesie bei Ratten wurde mit Etheranästhesie durchgeführt.

Nach der Anästhesie, von den markierten Bereichen, in die Keratinozyten transplantiert wurden, ein Biopsie Piercer mit einem Durchmesser von 2 mm. Die Stücke des Narbengewebes wurden entnommen und in eine 2,5% ige Glutaraldehydlösung gegeben, um das Material für die Elektronenmikroskopie vorzubereiten. Gewebestück für die histologische Untersuchung entnommen wurden in 10% neutralen Formalin-Lösung gegeben, gefolgt von Durchgangsverdrahtung Alkoholen und in Paraffin gefüllt, gefolgt von den Ultradünnschnitten schneiden und sie im Lichtmikroskop betrachtet.

Kontrolle I. Normale Rattenhaut.

Um den Unterschied zwischen dem mikroskopischen Bild der normalen Narben-veränderten Haut von Ratten und Narben zu bestimmten Zeiten nach der IPC-Transplantation zu sehen, werden Fotografien und Beschreibungen zu ihnen in allen Stadien dieser Studie gezeigt.

Die Epidermis der normalen Haut besteht aus 7-9 Zellschichten. Horny Schicht von mittlerer Dicke. An manchen Stellen besteht es aus 6-8 Schichten geilen Schuppen. Die basale Schicht wird durch Zellen von zylindrischer Form mit großen hellen, regelmäßigen Kernen und mehreren Nukleolen dargestellt. Desmosomale Verbindungen zwischen den Zellen und der Basalmembran werden deutlich ausgedrückt. Unter einer gut ausgeprägten Basalmembran, die kleine Auswüchse in der subepidermalen Schicht aufweist, liegen parallel dazu feine Bündel von Kollagen- und Elastinfasern, darunter eine längliche Form von Fibroblasten, kleine Gefäße. In tieferen Schichten liegen die Bündel aus Kollagen- und Elastinfasern in unterschiedlichen Richtungen. Unter ihnen gibt es viele Gefäße mit dünnen Wänden des gleichen Kalibers, zelluläre Elemente (Fibroblasten, Mastzellen, Leukozyten). In einer großen Anzahl von Haarfollikeln, Talgdrüsen.

Kontrolle 2. Narbe einer 2 Monate alten Ratte.

Klinisches Bild. Narben blassrosa, mit Peeling, stellenweise bleiben die Krusten zurück. Ihre Fläche verringert wird aufgrund der Kontraktion der Kollagenfasern und etwa 3,0 bis 3,5 cm werden ^:. Hautanhänge fehlen.

Mikroskopisches Bild. Die Epidermis besteht aus 3-5 Schichten von Zellen, gefaltet, vertreten durch Basalzellen von abgerundeter Form, eine Reihe von Subulate, 1-2 Reihen von Granula mit Keratogialin Körner in der oberen Schicht, gibt es Abschnitte der intrazellulären Ödeme. Die Hornhautschicht wird heterogen von sehr dünn zu verdickt verändert. Es gibt eine Faltung des Pansens aufgrund von (Kontraktion) von Narbengewebe. Die Falten dringen in die Papillarschicht ein und vermitteln den Eindruck von Papillen. Die Grenze zwischen der Epidermis und der Dermis ist eine gerade Linie. Die Basalmembran kann nicht überall verfolgt werden. Im unteren Teil der subepidermalen und tieferen Schichten - Gefäße mit einer dicken, gelockerten Wand, viele verlassen, mit Stase-Phänomenen. Um die Gefäße - ein Cluster von Makrophagen, Fibroblasten. Makrophagen umgeben die aus den Kapillaren austretenden Erythrozyten und phagozytieren diese. In den oberflächlicheren Schichten - kleine Kapillaren. Unter der Epidermis sind Kollagenfasern locker. In der tieferen Schicht des Pansens - grobe Bündel von Kollagenfasern, unter denen sich viele Fibroblasten befinden.

Narbenbildung einer Ratte einen Monat nach Transplantation von MPAl-Rattenratten-Keratinozyten.

Klinisches Bild. Die Narben rosa, ihre Fläche hat abgenommen, besonders im Durchmesser und durchschnittlich 2,5-3 cm ². Haare und Talgdrüsen fehlen.

Die Daten der mikroskopischen Untersuchung des Materials, das von den Ratten mit der Transplantation MPALK auf den Film und MPALK ohne Substrat bekommen ist, sind praktisch identisch. Jedoch technisch, die Arbeit mit MPAlK ungestützt viel schwieriger und mühsamer, als wenn MPAlK auf dem Substrat, so dass die weitere Untersuchung der Frage auf die Transplantation gewachsen kertainotsitov Narben wir als Grundlage für den Anbau verwendet ( „Substrat“) geschichteten Rasen.

Mikroskopisches Bild. Es gibt eine Verdickung der Epidermis auf 15-20 Schichten, von denen die Keratinozyten fast bis zur Mitte eine schmale, längliche, vertikale Form und eine kompakte Anordnung aufweisen. Die Basalzellen sind in einer unebenen Linie angeordnet. Ihre Kerne sind hell, groß, rund mit einem oder zwei Nukleolen, was auf ihre hohe synthetische und proliferative Aktivität hinweist. Die Grenze zwischen der Epidermis und der Dermis ist eine gerade Linie. Die dornige Schicht ist gut entwickelt, besteht aus 3-5 Schichten der rundförmigen Zellen, es gibt 2 nukleolusnyje die Käfige.

Unmittelbar unter der Basalmembran - dicht gedrängten dünnen Bündeln von Kollagenfasern, parallel zu ihnen eine große Anzahl von leeren Gefäßen, sind tiefere Kollagenfasern gröber, in dichten Bündeln gesammelt. Viele große Fibroblasten, Mastzellen (2-3 im Sichtfeld), Makrophagen, Leukozyten und leere Gefäße, deren Wände gelockert sind, um sie herum liegen lose Kollagenfasern. In einigen Gefäßen - Stase, Diapedese von einheitlichen Elementen. Um die Gefäße - Fibroblasten, einzelne Lymphozyten. Hautanhänge fehlen.

Wenn eine Keratinozytensuspension in eine polierte Narbe transplantiert wird, unterscheidet sich das mikroskopische Bild von dem vorherigen. Bei den meisten Tieren - die Epidermis ist dünn, besteht aus 5-6 Schichten von Zellen. Die untere Schicht besteht aus unregelmäßig polygonalen Zellen mit unregelmäßig geformten Kernen. Der Zustand der subepidermalen Schicht ist ähnlich dem in der Gruppe der Tiere ohne Transplantation.

In diesem Fall kann man entweder von einer Verzögerung der Prozesse, die mit einer Zelltransplantation einhergehen, oder von einem großen Verlust von Zellen, die in Form einer Suspension transplantiert werden, sprechen. Daher wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die Korrektur der Narbenbildung durch Keratinozytentransplantation in Form einer Suspension ungeeignet ist.

Narbenbildung der Ratte 2 Monate nach der Transplantation von Keratinozyten der MPAl-Rattenratte.

Klinisches Bild. Die Narbe sieht dünn und zart aus. An Orten gibt es eine Ecdysis, Skalen.

Mikroskopische Bilder. Das Stratum corneum ist verdickt, stellenweise - Hyperkeratose. Die Epidermis ist verdickt, sie besteht aus 12-20 Zellreihen. Die Grenze zwischen der Epidermis und der Dermis ist eine gerade Linie. Zarte Kollagenfasern unter der Epidermis liegen ziemlich dicht beieinander. In tieferen Schichten des Pansens werden sie in groben großen Bündeln gesammelt. In der subepidermalen Schicht erscheint eine neue Gefässbildung. In den unteren Schichten des Narbengewebes - viele leere Gefäße, die parallel zur Oberfläche der Epidermis liegen. Große Fibroblasten sind gleichmäßig in der Dicke des Pansens verteilt, es gibt riesige, facettenreiche, viele Makrophagen.

Narbenbildung der Ratte 5 Monate nach Transplantation der MP von Rattenspermocyten.

Klinisches Bild. Scar sieht glatt, glatt, ohne Abschälen gibt es einzelnes Haar ihrer höheren Dichte an der Peripherie der Narbe, die den Rand eingewachsenen Haarfollikeln im Pansen und Neoplasie der Haarfollikel anzeigt. Der Bereich der Narben nimmt weiter ab.

Mikroskopisches Bild. Die Epidermis ist immer noch dick (15-20 Schichten, manchmal bis zu 30) in den oberen Schichten ist mit Keratogialin Körner gefüllt. Die Basalmembran ist deutlich sichtbar. Unter ihr liegen die Kollagenfasern lose. In den unteren Schichten - Kollagen ist stärker und dicht gepackt. Unter den Kollagenstrahlen befinden sich viele Kapillaren. In den oberen Schichten nahm die Anzahl der leeren Gefäße ab. Die Epidermis und Dermis sind leicht wellig. Es gibt tiefe epidermale Auswüchse im Narbengewebe. Unter den Kollagenfasern sind sichtbar neu gebildete Gefäße. Erscheinen einzelne Haarfollikel und Talgdrüsen.

Narbenbildung der Ratte 9 Monate nach der Transplantation von IPA-Ratten-Ratten-Epidermozyten.

Klinisches Bild. Narben wurden im Vergleich zu früheren Begriffen viel kleiner, ihre Fläche beträgt durchschnittlich 1,5-2,0 cm ². Die Narben sind ungleichmäßig mit dünnem Haar bedeckt, besonders an der Peripherie. Geringfügige Small-Plate-Skalierung bleibt erhalten.

Mikroskopisches Bild.

Die Epidermis wurde dünner, dargestellt aus 6-8 Reihen von Zellen, die an die epidermale Struktur der normalen Haut von Ratten erinnern, nur die Dichte von Zellen um 1 mm. Höher und sie sind kleiner. Die Basalschicht besteht aus kleinen Zellen von rundzylindrischer Form. Die Basalmembran ist gut definiert, die Hemidesmosomen sind deutlich sichtbar. Das Vorhandensein von epidermalen Auswüchsen in der subepidermalen Schicht wird festgestellt. Die Papillarschicht ist entlang der gesamten Länge der Narbe exprimiert. Diese Tatsachen zeigen, dass für diesen Zeitraum die Adhäsion der transplantierten Keratinozyten mit den darunter liegenden Geweben des Pansens signifikant stärker geworden ist. Folglich kann die Pflege von Narben von Menschen mit MALC-Transplantation 9 Monate nach der IPC-Transplantation traditionell sein. Unter der Epidermis befinden sich empfindlichere Kollagenfasern als in den tiefen Schichten. Es gab viele Schiffe, besonders an der Oberfläche. In größeren Gefäßen sind die Wände verdickt. Haarfollikel und Talgdrüsen in großen Mengen. Das mikroskopische Muster ähnelt einem Hautgewebe.

Ergebnisse der experimentellen Arbeit und ihre Diskussion.

Während dieser Arbeit auf künstliche Haut Narben von Ratten nach der Operation Dermabrasion, transplantierte Keratinocyten in verschiedenen formah- auf Wundoberflächen, als Suspension in cambric und Schichtbildung ohne einen Substrat. Die Arbeit wurde unternommen, um morphologische Daten über die Wirkung von transplantierten allogenen Keratinozyten auf Narben zu erhalten, sowie die optimalen Transplantationsvarianten zu bestimmen.

Es wurde festgestellt, dass alle drei Methoden der Transplantation real sind, aber die Transplantation von IPAA ohne ein Substrat ist ein sehr mühsames Verfahren, bei dem IPAC verletzt werden kann, was die Ergebnisse der Transplantation beeinflusst. Darüber hinaus schließt diese Transplantationsmethode Arbeiten auf großen Flächen aus.

Die Transplantation der Keratinocytensuspension ist eine viel wirtschaftlichere Methode, erfordert keine lange Zellkultur und ist einfach in unserer vorgeschlagenen Version, die sterile Cambric-Knüppel verwendet, deren Abmessungen der Größe der Narben entsprechen. Die Verzögerung der therapeutischen Wirkung während der Transplantation der Zellsuspension für etwa einen Monat im Vergleich zur MIC auf der Wundauflage ist mit der in vielen Monaten berechneten Behandlungsdauer kein signifikanter Moment. Es ist bekannt, dass während der Transplantation von IPC, um Patienten zu verbrennen, die Transformation des Hautstrukturzustands allmählich und für mehrere Jahre erfolgte. Die Transplantation der Keratinozytenkultur auf Wundabdeckungen ist die bequemste und vielversprechendste Methode, sie ist jedoch auch viel teurer. Darüber hinaus erfordert die Suche nach anspruchsvolleren Beschichtungen, die plastisch, hygroskopisch sein müssen, bakteriostatische oder bakterizide Eigenschaften und für Zellen biologisch neutral sein. Der Film „Polipor“ - eine Zwischenversion der heimischen Wundabdeckung Film trotz einiger Mängel, hat uns erlaubt, experimentell Keratinozyten-Transplantation Ratten auf Narben zu untersuchen und Rückschlüsse auf die Wirksamkeit dieser Richtung Anziehung Vernarbung zu ziehen.

Die Autoren, die die IPC-Transplantation an verbrannten Wunden durchgeführt hatten, bemerkten, dass die Epidermis während der ersten Woche nach der Transplantation der mehrschichtigen Keratinozytenschicht auf die sterilisierten Wunden verdickte und stratifizierte. Alle Schichten der Epidermis waren gut definiert. Es ist interessant, dass die Anzahl der Zellschichten in Transplantaten 10-30% größer ist als in Hautbiopsieproben. Die Autoren bemerkten am 5. Tag nach der Transplantation von MPA, Basalmembran und Hemidesmosomen das Auftreten von Keratogialin-Granula - bereits am dritten Tag.

J. Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) fand heraus, dass sehr schwach in den frühen Zeiten nach der Transplantation BMD Patienten mit polnosloynymi Hautdefekten nach Verbrennungen, die Kommunikation zwischen den Dermis und Epidermis ist und eine gerade Linie, Papillarkörper fehlt. Am Ende des zweiten Monats beginnt die Bildung von flachen Papillen und Hautanhängen, die Verbindung zwischen der Dermis und der Epidermis wird haltbarer. Die Literaturdaten sprechen von der Transplantation allogener Keratinozyten auf die Wunden von verbrannten Patienten als eine vielversprechende Methode. Trotz der Tatsache, dass die Abstoßung von allogenen Keratinozyten von verschiedenen Autoren in der Zeit von 10 Tagen bis 3 Monate, jedoch vorgelegt auftritt, haben sie eine Rolle bei der Heilung der Wundoberfläche, Wachstumsfaktoren lösen und mechanisch um den Defekt zu schließen. Es wird angenommen, dass MPALK eine verringerte antigene Aktivität aufweist, da während der Kultivierung in vitro Langerhans-Zellen verlieren, was ihnen erlaubt, lange in dem Empfängerorganismus zu existieren. Darüber hinaus besitzt die aus der Haut von jungen gesunden Menschen gewonnene allogene Kultur ein unvergleichlich größeres biologisches Potential als die autologe Kultur von Patienten nach Trauma.

Das Hauptziel unserer Studie war herauszufinden, ob allogene Keratinozyten auf den Narben überleben und welche Veränderungen im Narbengewebe unter dem Einfluss einer solchen biologisch aktiven "Wundbeschichtung" auftreten. Im Falle eines positiven Ergebnisses, erarbeiten Sie die effektivste und am wenigsten arbeitsintensive Technologie in diesem Bereich der Rehabilitationsmedizin.

Die von uns erhaltenen Daten entsprachen in vielerlei Hinsicht den Literaturdaten zu den morphologischen Veränderungen, die in der menschlichen Epidermis nach dem Transfer von allogenen Keratinozyten in Brandwunden auftreten. Aber es gibt signifikante Unterschiede sowohl hinsichtlich des morphologischen Substrats, das transplantiert wird, als auch bezüglich der Technologie. Also der Prozess der Bildung der Basalmembran und der dermo-epidermalen Verbindungen (Hemidesmosomen, Papillen) erfolgt zu einem späteren Zeitpunkt als bei der Keratinozyten-Transplantation an den Wundflächen ohne Narbenveränderungen. Dies scheint auf eine schlechte Ernährung des Pansengewebes im Vergleich zur Dermis oder Muskelfaszie zurückzuführen zu sein. Die Narbe, besonders die alte, ist ein dichtes Bindegewebe mit einer sehr kleinen Anzahl von Gefäßen, der Boden der Brandwunde ist ein granulationsreiches Gewebe, das reich an Blutgefäßen ist. Daher ist es offensichtlich, dass die Bedingungen, unter denen Transplantation und Transplantation von Keratinozyten auftreten, völlig verschieden sind. Je vaskularisierter der Bereich der Transplantation von Zellen, desto einfacher ist es, sie zu verarbeiten. Aus diesem Postulat wird auf die Präferenz für die Arbeit mit jungen Narben geschlossen, bei denen das Bindegewebe noch locker genug und reich an Blutgefäßen ist.

Als Ergebnis dieser experimentellen Arbeit wurde bewiesen, dass:

1. Eine Transplantation von MALK in Narben ist möglich. 
2. Die optimale Transplantationsmethode ist die Transplantation von Keratinozyten auf die Wundabdeckung.
3. Die Oberfläche der Narbe sollte mit einer operativen Dermabrasion mit Schumann-Laser oder einem Cutter geschliffen werden.
4. Unter dem Einfluss von MPALK tritt eine schnelle Epithelisierung der Bodenoberfläche des Pansens auf.
5. Je besser das vaskularisierte Narbengewebe, dh je jünger die Narbe ist, desto besser sind die Ergebnisse der Keratinozytentransplantation.
6. Das Narbengewebe unter dem Einfluss von transplantierten Keratinozyten wird allmählich transformiert und verwandelt sich in ein dermales (mehr brüchiges Narbengewebe mit Hautanhangsgebilden).
7. Die allmähliche Lockerung des Narbengewebes beginnt mit der subepidermalen Schicht. Verbessert seine Vaskularisierung, nehmen Bündel von Kollagenfasern in den oberen und unteren Teilen des Pansens eine brüchigere Lage als im Narbengewebe ohne Transplantation von Zellen. Es gibt Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Epidermis in ihrer Struktur nähert sich nach der Phase der Hypertrophie der Epidermis der normalen Haut.
8. Die beobachteten Veränderungen sind mit Keratinozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktoren, Zytokinen, verbunden, die den Trophismus des Narbengewebes verbessern und seine Transformation von grobem faserigem Gewebe in ein lockereres erleichtern, was zu einer Verbesserung des Narbentyps führt.

Auf der Grundlage dieser Studie kann somit auf die vorteilhafte Wirkung von transplantierten Keratinozyten auf Narbengewebe geschlossen werden, was für die Rehabilitation von Patienten mit verschiedenen Narben von praktischer Bedeutung sein kann.

Diese Arbeit an Ratten erlaubte es auch, Anforderungen zu formulieren. Zu den Wundbedeckungen, auf denen Keratinozyten wachsen.

Wundabdeckungen sollten sein:

• biokompatibel mit Zellen,
• atmungsaktiv,
• eine elastische, formbildende Basis haben,
• hydrophil sein,
• als medizinische Zusätze enthalten antibakterielle Medikamente und Antioxidantien sind nicht toxisch für kultivierte Zellen.

Klinische Ergebnisse der biotechnologischen Behandlung von Narben.

Früher haben N. Carver et al. (1993) fanden, dass Okklusivverbände am besten für die Anhaftung an die Wunde und das Überleben von Keratinozyten geeignet sind, aber nicht die Bildung einer geschichteten (reifen) Epidermis erlauben. Um eine stratifizierte Epidermis zu bilden, ist eine Luftumgebung notwendig. Daher wurde nach dem Anbringen der mehrlagigen Schicht nach 7-10 eine okklusive Wundabdeckung vorgeschlagen, um Wunden unter trockenen Bandagen oder wasserlöslichen Salben zu entfernen und zu führen. Wir können sagen, dass die Qualität und die Eigenschaften des "Substrats", auf dem die Zellen gezüchtet werden, für die Wirksamkeit der Transplantation des Zellmaterials und folglich für die Ergebnisse der Arbeit der Ärzte sehr wichtig sind. Doch trotz der Fülle der vorgeschlagenen Optionen (Kunstleder, Vliesstoff aus Carboxymethylcellulose, Fibrin-Beschichtungen, semipermeable Polyurethan-Folien) gibt es heute keine ideale Wundabdeckung. Ein nicht unwichtiger Moment in dieser Angelegenheit sind die Kosten von "Substraten" (speziellen Wundbeschichtungen), da deren hohe Kosten die Gesamtkosten der biotechnologischen Behandlung erhöhen.

Die Wirksamkeit zellulärer Technologien wurde bis heute bewiesen, aber unglücklicherweise sind diese Technologien sehr teuer, insbesondere in Ländern, in denen die industrielle Produktion zellulärer Zusammensetzungen nicht etabliert ist. Dennoch haben Länder wie die Vereinigten Staaten seit langem eine Industrie für die Herstellung von Zellmaterial für die Transplantation von verbranntem etabliert. Insbesondere hebt das Unternehmen Biosurface Technology Inc, seit 1989, 37.000 laminierte Schichten von Keratinozyten, die in 79 Ländern für die Behandlung von 240 Patienten wurden auf der ganzen Welt (R.Odessey, 1992) mit 1 cm ² Zellkultur kostet etwa 7-8 $ US.

Die Technologie zur Behandlung verschiedener Krankheiten und Hautprobleme weist eine Reihe von Unterschieden auf, aber das Herz jeder Behandlung mit Zellen ist die Herstellung von hochwertigem Zellmaterial und dessen Transplantation.

Dieser Prozess besteht aus den folgenden Schritten:

• Hautauswahl von Betroffenen (oder von Spendern),
• Transport von Hautlappen in das Biotechnologiezentrum,
• die Isolierung von Zellen der Basalschicht und deren Vermehrung,
• Aufbau von mehrschichtigen Schichten von Keratinozyten (IPC).
• Transplantation von Zellkulturen.

Das Hauptproblem bei der Behandlung mit der Transplantation von mehrschichtigen Keratinozytenschichten ist die Notwendigkeit lebensfähiger Zellen in allen Stadien der Zelltransplantation. Hautstücke zum Isolieren von autologen oder allogenen Zellen sollten so dünn wie möglich sein, da sie sich in diesem Fall leichter mit mechanischen und enzymatischen Methoden trennen lassen und eine Suspension von lebenden Zellen für das Wachstum erhalten. Sie können erhalten werden, indem man das Dermatom abschneidet oder die Haut der Augenlider, die Vorhaut, die innere Oberfläche der Schulter verwendet. Da die Zellen gegenüber Halogenen (Chlor, Jod) und Wasserstoffperoxid empfindlich sind, können sie bei der Behandlung der Haut zum Zeitpunkt der Entnahme nicht verwendet werden.

Der quantitative und qualitative Ertrag von Zellen aus Hauttransplantaten und die Wirksamkeit ihrer Kultivierung hängen auch von dem Gesundheitszustand und dem Alter des Spenders ab. Darüber hinaus sollten Hautbiopsien so schnell wie möglich und unter geeigneten Bedingungen (Umgebung, Temperatur) an ein zertifiziertes und akkreditiertes Labor geliefert werden.

Eagle-Medium oder -Medium 199 mit dem Zusatz von 10% Rinderserum, DMEM-Medium, das mit 5% fötalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt ist, kann zum Lagern und Transportieren von Hautlappen verwendet werden.

Im zytologischen Labor wird die Hautbiopsie zunächst mechanisch in kleine Stücke geteilt, anschließend erfolgt die Verarbeitung der Hautfragmente mit Hilfe von Enzymen: Trypsin, Kollagenase, Dyspase, etc.

Unter der Wirkung von Enzymen findet eine Zerstörung durch Desmosomen statt und Keratinozyten werden als getrennte Zellen oder Aggregate, die aus einer unterschiedlichen Anzahl von Zellen bestehen, in das Medium freigesetzt. Für die Kultur werden nur basale Keratinozyten verwendet, die auf speziellen Medien in Inkubatoren mit 5% CO., In Petrischalen oder in Ampullen bei t = 37 ° C kultiviert werden. Innerhalb von 48 Stunden wird die Bildung von Keratinozytenkolonien beobachtet, die allmählich zu einer Monoschicht konvergieren. Nach dem Erhalt einer ausreichenden Anzahl von Zellen wird die resultierende Suspension auf die für diesen Zweck hergestellten Wundabdeckungen verteilt und in Petrischalen gegeben. Aus der Suspension wird zunächst eine Monoschicht und dann eine mehrschichtige Keratinozytenschicht gebildet. Schematisch sind die Stadien des Keratinozyten Kultivierungsprozesses in Abb. 12 (33.43.54.65).

Die Bildung einer mehrschichtigen Keratinozytenformation, die für die Transplantation geeignet ist, dauert üblicherweise 7-10 Tage. Manchmal ist diese Zeitspanne länger, was von der Qualität des Ausgangsmaterials abhängt (Alter, Gesundheit des Spenders, Richtigkeit des Materials, Qualität der verwendeten Medien usw.). Wenn die mehrschichtige Schicht überwächst, kann es auf ihrer Oberfläche Zellen mit Apoptosephänomenen geben, die für eine Transplantation ungeeignet sind. Petrischalen, in denen sie auf Wundabdeckungen durch mehrschichtige Schichten von Keratinozyten (IPC) wachsen, werden in speziellen Behältern bei einer Temperatur von nicht weniger als + 15 ° C an die Klinik geliefert.

Die modifizierte Green-Methode zum Wachstum der IPC

Bei unserer Arbeit als Wundauflage verwendeten wir ein mehrschichtiges Cambric und verzichteten auf die Polyporenfilme, mit denen wir in einem Experiment mit Ratten zu arbeiten begannen. So wurden mehrschichtige Keratinocytenschichten von uns auf Prefect und sterilem Batist gezüchtet, obwohl es auch nicht die optimale Wundabdeckung ist.

Klinische Studien wurden an Freiwilligen unter Einhaltung der notwendigen ethischen Normen durchgeführt: Unterzeichnung eines Vertrags und Einverständniserklärung.

1. Die Kultur von eigenen (autologen) und aus den Bankzellen entnommenen (allogenen) Keratinozyten wurde angewendet.
2. Eigene Keratinozyten wurden von einem Stück Haut erhalten, das von der Innenseite der Schulter der Patienten geschnitten wurde.
3. Operation der Dermabrasion von Narben wurde mit Hilfe von Thermo-Kopplung, rotierenden Scheiben und Erbium-Laser durchgeführt.
4. Es wurden Gruppen von Patienten mit normotrophen, hypotrophen und hypertrophen Narben entnommen.

Der technologische Prozess zur Anwendung der Zelltechnologie zur Verbesserung der Art der Hautnarben bestand aus folgenden Phasen:

1. Auswahl von Patienten.
2. Erläutern Sie das Wesen der Behandlung, den Zeitpunkt des Erreichens der erwarteten Ergebnisse, die Unterzeichnung eines Vertrags und die Einwilligung nach Aufklärung.
3. Ernennung der Patienten für 2-3 Wochen vor der Operation Selmevit von 1 t. 3 mal am Tag, Zinkteral auf 1 t. 3 mal am Tag.
4. Man nimmt ein Stück Haut von 2,0 cm Länge und 0,7-1,0 cm Breite von der inneren Oberfläche der Schulter, hoch, fast am Boden der Achselregion, um autologe Keratinozyten zu erhalten.
5. Im Falle, dass Patienten sich weigerten, ihre eigenen Keratinozyten zu isolieren, weil die Möglichkeit bestand, eine lineare Narbe an der inneren Oberfläche der Schulter zu erhalten, wurde das Zellmaterial aus einer Zellbank (allogene Keratinozyten) entnommen.
6. Keratinozyten wurden isoliert und unter Bedingungen eines für diese Art von Arbeit zertifizierten Labors gezüchtet.
7. Nach Erhalt einer IPC, die für die Transplantation ausreichend war, wurde den Narben in der Klinik ein Tag der Operation verabreicht, wo das Material in speziellen Behältern in Petrischalen eingebracht wurde.
8. Die Operation der Dermabrasion des Pansens, Hämostase wurde durchgeführt, die Bodenoberfläche wurde mit steriler Salzlösung gewaschen, getrocknet, wonach IPC auf sterile Batist- "Zellen nach unten" transplantiert wurde. Das heißt, die Zellen, die im MIC oben waren, waren niedriger, angrenzend an die polierte Oberfläche.
9. Oben wurde ein steriler Film aufgelegt, der mit einer elastischen Bandage oder einem elastischen Omnifix-Pflaster an der Haut fixiert wurde. Anstelle der Folie können auch indifferente, silikonhaltige Wundauflagen, beispielsweise Mepitel, Mepiform, Silikongelplatten, verwendet werden.

Nach 5-7 Tagen wird der Film oder die Silikonbeschichtung entfernt. Zu dieser Zeit müssen alle Keratinozyten auf die polierte Narbe kriechen und an ihrer Oberfläche anhaften.

10. Die feuchte Umgebung unter der Film- und Silikonbeschichtung trägt aktiv dazu bei. Der von dieser Stelle auf der Narbe verbliebene Baptist kann mit Curiose oder Chitosan-Gel imprägniert werden. Als Ergebnis wird am zweiten Tag eine dichte Kruste erzeugt, die für die Bequemlichkeit des Patienten besser mit einem elastischen, luftdurchlässigen Pflaster, zum Beispiel Omnifix, zu fixieren ist. Die atmungsaktive Kruste ermöglicht es der neu gebildeten Epidermis, sich zu differenzieren und zu reifen.

Je nach Art der Narbe und der Tiefe des Schleifens wird der Verband nach 8-10 Tagen abgestoßen. Die Epidermis hat zu dieser Zeit 30-40% mehr Zellschichten als in normaler Haut. Die Basalmembran ist nicht gebildet. Keratinozyten der verdickten Epidermis setzen eine Masse biologisch aktiver Moleküle in das Narbengewebe frei.

Der Erfolg der biotechnologischen Behandlung von Narben hängt weitgehend davon ab, wie sie in der postoperativen Phase versorgt werden. Zellkulturen sind eine "zarte" Art der Wundabdeckung und in den frühen Perioden nach der Transplantation kann die BMD leicht von den darunter liegenden Geweben abgelöst werden. Daher wird den Patienten empfohlen, nach der Operation auf die Narbe zu achten. Für 8-9 Monate, nicht reiben und leicht mit kaltem abgekochtem Wasser arbeiten, um zu vermeiden, eine dünne, neu geschaffene Epidermis abzureißen, die keinen festen Griff mit dem darunter liegenden Gewebe hat.

Hinweis:

Vor der Operation und während der Dermabrasion Verwendung von halogenierten Oxidationsmittel und Konservierungsmittel (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, Chlorhexidin, Wasserstoffperoxid) zulässig ist, bevor Umpflanzen kletok- absolut kontra aufgrund ihrer cytotoxischen Wirkungen. Giftig für Zellen sind auch Methylenblau. Brilliantes Grün.

Zur Vermeidung von Infektionen, insbesondere bei hypertrophen Narben, kann das Operationsfeld mit Neomycinsulfat, Polymyxin oder Gentamicin behandelt werden. Sie üben keine zytotoxische Wirkung auf Keratinozyten aus.

Als Ergebnis dieser Behandlung wird ein Dreifacheffekt erzielt.

1. Ausrichtung der Oberfläche des Pansens.
2. Erstellen Sie eine Schicht darüber eine neue Epidermis, normale Dicke.
3. Die Umwandlung von Narbengewebe in dermopodobnuyu durch die Wirkung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und andere von transplantierten Zellen und Keratinozyten von ihnen stimuliert sezerniert bioaktive Moleküle, Fibroblasten und Makrophagen.

Die Narbe wird weniger auffällig, elastischer, die Poren erscheinen darin, die Haare können gebleicht werden, die Pigmentierung kann aufgrund der Anwesenheit von Melanozyten im MPC wiederhergestellt werden.

All diese positiven Momente in der Narbe kommen jedoch nicht sofort. In dieser Hinsicht ist es notwendig, Patienten zu warnen. Dass der Prozess der Umwandlung von Narbengewebe in die Dermis langsam ist und das optimale Ergebnis einer solchen Behandlung nicht früher als 10-14 Monate erwartet werden kann. Unmittelbar nach dem Abweisen des Verbandes haben die polierten Oberflächen eine ausgeprägte Polychromie, je heller der Schleifprozess ist. Die geringste Schädigung der Haut tritt auf, wenn die normotrophen Narben mit einem Erbiumlaser geschliffen werden. Die Farbe der Narben und der umgebenden Haut wurde im Zeitraum von 3 bis 8 Wochen wiederhergestellt. Trotz dieser Vorkehrungen kommt es manchmal zu postoperativen Hyperpigmentierungen, die mehrere Monate unabhängig voneinander verlaufen können.

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